一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异性分子标记及其引物和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记及其引物和应用。

背景技术：

鱼类的性别决定、分化机制和性别控制技术育种在水产养殖研究和应用方面意义重大，许多鱼类具有性别二态性。如有的鱼类具有性别生长二态性，单性养殖可以提高效率。半滑舌鳎(cynoglossussemilaevis)(陈松林等,2013)和鲤鱼(cyprinuscarpio)(jiangetal,2020)等雌性生长速度显著快于雄性，全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一；尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)(chenetal.,2017)和黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)(danetal.,2018)等鱼类雄性在生长上显著优于雌性，全雄化养殖以增加产量和效益。有的鱼类某种性别具有重要价值，如鲟鱼卵可生产鱼子酱，因此雌鱼比雄鱼经济价值高(东天等,2015)。因此，根据鱼类雌雄经济性状的性别差异，开展性别控制育种具有重要价值。

金钱鱼(scatophagusargus)为广盐性亚热带中小型鱼类，杂食性，雌、雄鱼最小性成熟年龄为1龄，一般为2龄。群体繁殖期为4-8月，5-7月为盛，海水池塘或网箱养殖一年即可上市。金钱鱼味道鲜美，肉质细嫩，在我国沿海及东南亚等地有广阔的市场，目前市场价格达80-120元/公斤。金钱鱼具有明显的雌雄生长差异，人工养殖条件下，1龄雌鱼生长速度比雄鱼快30％左右，2龄雌鱼则高于同龄雄鱼100％以上(蔡泽平等,2010)。因此，金钱鱼全雌化养殖可明显提高养殖效率。金钱鱼还是一种人们喜爱的观赏鱼，雄性比雌性体色艳丽，全雄金钱鱼具有更高观赏价值，但目前还未见单性苗种培育报道。要实现性别控制，需开展性别决定分子机理基础理论研究。由于鱼类性别的可塑性，理论上可以通过雄性类固醇激素、抗雌药物和芳香化酶(雌激素合成关键酶)抑制剂处理，诱导遗传性别xx的个体发育为伪雄鱼(遗传上仍为xx)，将xx伪雄鱼与正常xx雌鱼交配繁殖，最终获得全雌后代，实现金钱鱼全雌单性苗种培育。同样，可以通过雌激素处理，诱导xy个体发育为伪雌鱼(遗传上仍为xy)，将xy伪雌鱼与xy正常雄鱼交配，获得四分之一的yy超雄鱼，yy超雄鱼与正常雌鱼交配，可实现全雄苗种培育用于观赏。

传统的鱼类性别控制育种通过测交来判断亲本基因型，耗时耗力，而基于性别连锁的分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力，虽然已有与金钱鱼遗传性别相关的特异分子标记公布，但该标记需要对pcr扩增产物进行sanger测序，检测成本较高，且耗时相对长。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记，本发明的目的之二在于提供所述特异分子标记在制备鉴定金钱鱼性别引物中的应用，本发明的目的之三在于提供一对能够pcr扩增出所述特异分子标记或其部分片段的引物，本发明的目的之四在于提供所述特异分子标记或所述引物在鉴定金钱鱼遗传性别中的应用，本发明的目的之五在于提供所述特异分子标记或所述引物在制备鉴定金钱鱼性别试剂盒中的应用，本发明的目的之六在于提供一种快速鉴定金钱鱼遗传性别的方法，本发明的目的之七在于提供一种鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记，所述分子标记为两条在金钱鱼x染色体和y染色体中部分同源的dna片段，x染色体上部分同源的dna片段核苷酸序列如seqidno：1，y染色体上部分同源的dna片段核苷酸序列如seqidno：2所示。

2、所述特异分子标记在制备鉴定金钱鱼性别引物中的应用。

3、一对能够pcr扩增出所述特异分子标记或其部分片段的引物，pcr扩增产物在x染色体和y染色体上具有显著的差异。

作为优选技术方案之一，所述引物中正向引物核苷酸序列如seqidno：3所示，反向引物核苷酸序列如seqidno：4所示。

4、所述特异分子标记或上述引物在制备鉴定金钱鱼性别中的应用。

5、所述特异分子标记或上述引物在制备鉴定金钱鱼性别试剂盒中的应用。

6、一种快速鉴定金钱鱼遗传性别的方法，包括如下步骤：

s1.提取待测样本基因组dna；

s2.设计引物并以s1的基因组dna为模板，pcr扩增所述特异分子标记或其部分片段，得到pcr扩增产物；

s3.将s2的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

s4.分析测序结果，根据电泳结果判断金钱鱼遗传性别，判断标准为：

如果pcr扩增产物只有一条清晰的条带，则待测样本为雌鱼；

如果pcr扩增产物有两条清晰的条带，则待测样本为雄鱼。

作为优选技术方案之一，所述pcr扩增的体系为2×pcrmix25μl，10μmol/l正反向引物各1μl，基因组dna2μl，ddh2o21μl，共50μl。

作为优选技术方案之一，所述pcr扩增的程序：94℃3min；94℃30s、58℃30s、72℃1min，37个循环；72℃10min延伸。

7、一种鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含有所述特异性分子标记引物。

本发明的有益效果在于：

本发明从金钱鱼基因组信息中筛选到两条在金钱鱼x染色体和y染色体上部分同源dna片段，并设计特异性引物进行金钱鱼遗传性别鉴定，可以快速、准确的区分金钱鱼遗传性别。本发明的方法在雌、雄个体中都可扩增出特异dna片段并可用琼脂糖凝胶电泳法区分，适用于实验室或水产养殖企业准确鉴定金钱鱼遗传性别。本发明检测金钱鱼遗传性别的方法还可用于对不同生长阶段和不同群体的金钱鱼性别鉴定和筛选，对研究金钱鱼性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。

附图说明

图1为分子标记辅助选育生产遗传全雌鱼的技术路线。a为xy系统构建全雌鱼生产的技术路线图，b为xy系统构建全雄鱼生产的技术路线图。e2，雌二醇；17α-mt，17α-甲基睾酮；le，letrozole，芳香化酶抑制剂。

图2为本发明金钱鱼x染色体、y染色体同源dna片段序列比对图。引物位置用箭头标出；方框：本专利鉴定遗传性别的x染色体相对于y染色体缺失的dna片段序列；黑色背景x染色体和y染色体dna片段一致序列；-：缺失序列。

图3为本发明在3个不同群体雌、雄金钱鱼pcr产物琼脂糖凝胶电泳图。♀：表型性别为雌性；♂：表型性别为雄性。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

金钱鱼性别特异标记的获得

1、性别特异分子标记的发现

对1雌1雄金钱鱼肌肉组织的dna进行二代基因组survey测序，以及对3雌3雄金钱鱼性腺组织的转录组测序，分析测序数据，发现了金钱鱼性别决定候选基因dmrt1。通过分析雌雄个体重测序数据，发现dmrt1基因序列仅在雄鱼基因组存在，在雌鱼基因组不存在，其截短突变基因dmrt1b雌雄鱼都存在，比较dmrt1与dmrt1b基因结构，发现dmrt1外显子5’至3’utr区域与基因dmrt1b所在contig00204上相应的区域相似度为78.2％，针对此区域的基因序列设计1对引物。

上游引物f(seqidno.3)：5′-tcagagcacaattgttaggcaaagtgaac-3′；

下游引物r(seqidno.4)：5′-tcgctactttcaccaatacagcatga-3′)；

利用这对引物对10尾雌性金钱鱼和10尾雄性金钱鱼基因组dna进行pcr扩增，在xx雌性和xy雄性个体中都能扩增出一条长约为600bp的条带，此外，xy个体还扩增出一条长约为700bp的条带。

2、性别特异分子标记的克隆与序列分析

利用上述引物扩增3雌3雄金钱鱼的基因组，琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收xx雌性个体中扩增出的单一条带和xy雄性个体中扩增出的两条带，并将其连接到peasy-t3载体上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞，用lb液体培养基培养1小时后，吸取50-100ul菌液涂布在la固体培养基，过夜培养，挑取单菌落，用pcr法鉴定阳性克隆，再进行测序。

将来自每尾鱼的5-10个阳性克隆的测序序列用dnaman4.0软件进行多重比对，结果发现，来自雌性个体的单一扩增条带为593bp，该序列在不同雌性个体之间的同源性高达99.3％-100％，将此序列命名为seqchrx(seqidno.1)。来自雄性个体的与雌性个体扩增条带等长的片段长度也593bp，在不同雄性个体之间的同源性高达99.5％-100.0％，所以该片段也命名为seqchrx；而来自雄性个体的比seqchrx序列大的片段长度为693bp，不同雄性个体之间序列同源性高达99.7％-100.0％，故将该雄性特异的片段命名为seqchry(seqidno.2)。来自雄性个体的seqchrx序列和seqchry序列的同源性仅仅为72.8％-73.7％，它们与来自雌性个体seqchrx序列的同源性平均分别为99.5％和72.6％。以上结果表明seqchrx在雌雄个体都存在，seqchry仅仅在雄性个体存在，即seqchrx和seqchry分别来自x和y染色体的同源序列，分子标记辅助选育生产遗传全雌鱼的技术路线如图1所示。

对测序获得的x染色体特异序列seqchrx和y染色体特异序列seqchry进行序列比对分析。结果如图2所示，seqchrx和seqchry序列差异主要有12处：与y染色体特异分子标记相比，x染色体特异分子标记：(1)在66bp处缺失了17bp序列；(2)在172bp处缺失了4bp序列；(3)在209bp处缺失了27bp序列；(4)在287处插入了1bp；(5)在350bp处缺失了5bp序列；(6)在391bp处缺失了3bp序列；(7)在414bp处缺失了4bp序列；(8)在445bp处缺失了1bp序列；(9)在455bp处缺失了9bp序列；(10)在484bp处缺失了6bp序列；(11)在513bp处缺失了21bp序列；(12)在548bp处缺失了4bp序列。

实施例2

金钱鱼遗传性别鉴定引物序列的应用

快速准确鉴定金钱鱼遗传性别，包括如下步骤：

(1)不同地理来源金钱鱼的采集和表型性别鉴定

为了验证本专利对遗传性别鉴定的准确性，采集湛江市、北海市、珠海市三个地方的213尾金钱鱼(106尾表型雌鱼和107尾表型雄鱼)，金钱鱼的表型性别通过性腺外观确定，雌鱼卵巢拟三角形，雄鱼精巢长囊状。

(2)金钱鱼基因组dna提取

剪取待测的金钱鱼的尾鳍，采用基因组dna提取试剂盒，按步骤提取金钱鱼基因组dna。

(3)待测样本dna的测序检测

采用实施例1中的seqidno.3和seqidno.4对所提取的基因组dna进行pcr扩增；

pcr反应体系：2×pcrmixbuffer25μl，10μmol/l上下游引物各1μl，模板dna2μl，ddh2o21μl，混匀后离心。

pcr扩增程序：94℃3min；94℃30s、60℃30s、72℃1min，37个循环；72℃10min，4℃保存。

pcr产物用1.0％琼脂糖电泳，电压120v，时间20min。

同时，利用参考文献(mustapha,u.f.；jiang,d.n.；liang,z.h.；gu,h.t.；yang,w.；chen,h.p.；deng,s.p.；wu,t.l.；tian,c.x.；zhu,c.h.；etal.male-specificdmrt1isacandidatesexdeterminationgeneinspottedscat(scatophagusargus).aquaculture.2018,495,351-358)中的金钱鱼遗传性别分子标记dmrt3-marker-f/dmrt3-marker-r进行遗传性别鉴定，鉴定结果作为阳性对照。

结果如图3和如表1所示，雌鱼电泳结果为单一条带，雄鱼电泳结果为清晰的两条带(图3)，对106尾雌鱼和107尾雄鱼的表型鉴定结果进行匹配分析，结果显示雌鱼与雄鱼的基因型性别和表型性别鉴定结果完全吻合，遗传性别与表型性别的吻合率为100％(表1)。利用分子标记dmrt3-marker-f/dmrt3-marker-r进行遗传性别鉴定的结果与本发明鉴定的结果完全一致(表1)。由上述结果可知，本发明的性别特异分子标记适用于多个不同地理来源的金钱鱼，具有普适性。

表13个不同地理来源的金钱鱼的遗传性别鉴定结果

注：♀：表型性别为雌性；♂：表型性别为雄性

实施例3

一种鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒

一种用于鉴定金钱鱼遗传性别的试剂盒，试剂盒中含有用于鉴定金钱鱼遗传性别的引物；引物序列如seqidno.3、seqidno.4所示。

同时，试剂盒中还包含有pcr扩增反应所需的试剂：2×pcrmixbuffer和ddh2o。

试剂盒的使用方法包括如下步骤：

s1.提取待测样本基因组dna；

s2.以上述引物对s1的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

s3.将s2的pcr扩增产物进行电泳，根据电泳结果，如果在s2样品显示单一条带，则为雌鱼；如果显示清晰的两条带，则为雄鱼。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>广东海洋大学

<120>一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异性分子标记及其引物和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>593

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcagagcacaattgttaggcaaagtgaacttctttttgaatacccagaagataaaatcac60

ccaaaattaaccctttctggcttacaacaaataggacaaatgcagttttcacacttctgt120

taacttctgcttctgttaacagtgaatgggcagtgattatttagatacagtgaactttct180

tttaatcactcatctcagccaggtgagaagtttactggtagaggttaacaaatcagagac240

tttcagggagtgttgatctgcatataatttcaacagtcggttttaaagtataattaggac300

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ccatggtagtctcttgtcaatcagaggttgccacaccttaaagcatacccagcttcatta540

tctggaccataatttactcaatgaacatcatgctgtattggtgaaagtagcga593

<210>2

<211>693

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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ccaaaatacaaaataatgatattataaccctttctggcttacaacaaataggactaatgt120

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agtgtggcattgtggatctgattgagaacctgaggacatgccatggtagtctcttgtcaa600

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atgaacatcatgctgtattggtgaaagtagcga693

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcagagcacaattgttaggcaaagtgaac29

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcgctactttcaccaatacagcatga26