一种抑制caspase1基因表达的siRNA分子及其应用的制作方法

本发明涉及核酸制药
技术领域：
，具体涉及一种抑制caspase1基因表达的sirna分子及其应用。
背景技术：
：小干扰rna(sirna分子)是已获得临床验证的新兴核酸药物，它是一类双链短rna分子，它的反义链能够与特定的mrna链互补配对，由此引发序列特异性的基因表达抑制(基因沉默)，也即rna干扰(rnai)。目前全球已有2种sirna分子药物获批上市(onpattro、givlaari)。理论上，可针对任意基因设计、筛选sirna分子并抑制基因的表达。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶1(caspase1)作为一种炎症调节因子，已被证明是炎症调控、细胞凋亡、细胞焦亡的关键环节。研究显示，caspase1广泛参与心血管疾病、代谢性疾病、癌症等全身疾病的进展。细胞焦亡是一种新近发现的依赖于caspase1活化的细胞程序性死亡方式。细胞焦亡伴随着膜孔形成、液体流入、细胞肿胀、细胞溶解，最终质膜破裂和细胞内容物泄漏。在经典的细胞焦亡途径中，细胞内吞噬细胞识别受体3(nlrp3)等受体蛋白感应胞外刺激信号，caspase1的前体pro-caspase1与胞内吞噬细胞识别受体(nlr)等形成蛋白复合物，激活caspase1，活化的caspase则通过切割gsdmd蛋白使其转化为活化状态从而导致细胞焦亡。细胞焦亡在固有免疫和肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，深入探究细胞焦亡与肿瘤的关系有利于对肿瘤的发生、发展及新的预防治疗提供新思路。与此同时，使用sirna分子抑制caspase1的表达水平可以快速直接地阻止细胞焦亡，从而预防及治疗因细胞焦亡导致的疾病。而且sirna分子仅作用于靶基因的mrna，不影响其他基因的转录与表达，因此sirna分子介导的核酸治疗具有安全高效的特点。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提出一种抑制caspase1基因表达的sirna分子及其应用，旨在一定程度上解决相关研究的技术问题之一。基于上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种抑制caspase1基因表达的sirna分子，所述sirna分子包括正义链和反义链，所述sirna分子的序列包括如下组合中的一种：组合一：(1)、正义链的核苷酸序列如seqidno.1所示；和(2)、反义链的核苷酸序列如seqidno.2所示；或(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合二：(4)、正义链的核苷酸序列如seqidno.3所示；和(5)、反义链的核苷酸序列如seqidno.4所示；或(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合三：(7)、正义链的核苷酸序列如seqidno.5所示；和(8)、反义链的核苷酸序列如seqidno.6所示；或(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合四：(10)、正义链的核苷酸序列如seqidno.7所示；和(11)、反义链的核苷酸序列如seqidno.8所示；或(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合五：(13)、正义链的核苷酸序列如seqidno.9所示；和(14)、反义链的核苷酸序列如seqidno.10所示；或(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列。在本发明的实施例中所述sirna分子的序列包括如下组合中的一种：组合一：(1)、正义链的核苷酸序列如seqidno.1所示；和(2)、反义链的核苷酸序列如seqidno.2所示；或组合二：(4)、正义链的核苷酸序列如seqidno.3所示；和(5)、反义链的核苷酸序列如seqidno.4所示；或组合三：(7)、正义链的核苷酸序列如seqidno.5所示；和(8)、反义链的核苷酸序列如seqidno.6所示；或组合四：(10)、正义链的核苷酸序列如seqidno.7所示；和(11)、反义链的核苷酸序列如seqidno.8所示；或组合五：(13)、正义链的核苷酸序列如seqidno.9所示；和(14)、反义链的核苷酸序列如seqidno.10所示。在本发明的实施例中，所述sirna分子的序列为组合三。根据本发明的实施例，所述sirna分子的序列具有甲氧基修饰和氟代修饰，所述甲氧基修饰为甲氧基取代核苷酸中的核糖2′-羟基；所述氟代修饰为氟取代核苷酸中的核糖2′-羟基。根据本发明的实施例，按照5’末端到3’末端的方向，正义链的第1、2、3、4、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19为甲氧基修饰的核苷酸；第5、7、8和9位为氟代修饰的核苷酸；所述sirna分子的序列的反义链的第1、3、4、5、7、10、12、13、15、17、18和19为甲氧基修饰的核苷酸；第2、6、8、9、14和16位为氟代修饰的核苷酸。根据本发明的实施例，所述sirna分子的序列还具有硫代磷酸酯基修饰，所述硫代磷酸酯基修饰为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代。根据本发明的实施例，所述sirna分子的序列的正义链和反义链均具有硫代磷酸酯基修饰位点；所述正义链的修饰位点为5'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸之间，和5'末端端部的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的至少一种；所述反义链的修饰位点为以下位置中的至少一种：5'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；5'末端端部的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；3'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸之间和3'末端端部的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。在本发明的实施例中，所述sirna分子能够抑制caspase1基因的mrna水平和蛋白水平的表达。第二方面，本发明提供了一种抑制基因表达的方法，所述基因为caspase1，所述方法包括利用sirna分子转染细胞，以便抑制所述细胞中caspase1基因的表达，所述sirna分子具有如本发明第一方面任一所述的序列。转染细胞的方法包括但不限于：电穿孔的方法，阳离子聚合物试剂方法，外泌体递送方法，可离子化脂质体递送方法等。例如可以采用商业化阳离子聚合物转染试剂lipofectamine2000，还可以采用实验室合成的多肽载体、高分子聚合物载体、碳纳米管、金属纳米载体、有机/无机杂化的各类载体等。在本发明的实施例中，所述sirna分子通过lipofectamine2000被转染进细胞内部，并发挥了抑制基因表达的作用。第三方面，本发明提供了一种抑制caspase1基因表达的sirna分子药物，包括有效量的如本发明第一方面所述的sirna分子和药学上可接受的载体。所述药物可以运用常规方法制备成不同的制剂，例如可以采用生理盐水或者含有葡萄糖和其他辅剂的水溶剂通过常规方法制备成针剂。所制备成的不同的药物可以以任何方便的形式给药，例如可以通过局部、静脉、肌肉、皮下、皮内、节内、鞘内注射等不同的途径给药。药物的用量可以根据实际情况进行适应性调整。第四方面，本发明提供了sirna分子在制备抑制caspase1基因表达药物中的应用，所述sirna分子为本发明第一方面任一实施例所述的sirna分子。在本发明的实施例中，所述抑制caspase1基因表达药物为治疗外因诱导的细胞焦亡、自发炎症、正常组织的炎症损伤或癌症的药物。在本发明的实施例中，所述抑制caspase1基因表达药物为抗细胞焦亡药物。从上面所述可以看出，本发明提供的用于抑制caspase1基因表达的sirna分子包括序列组合一至五中的任意一种，能够高效抑制caspase1基因和相关蛋白的表达，提高细胞线粒体的活性。所述sirna分子可用于制备抑制基因caspase1表达的药物，该药物可用于抗细胞焦亡；对自发炎症、正常组织的炎症损伤和癌症的治疗。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例中多壁碳纳米管对巨噬细胞线粒体活性的影响；图2为本发明实施例中多壁碳纳米管对巨噬细胞信号通路的影响；图3为本发明实施例中多壁碳纳米管对巨噬细胞形态的影响；图4为本发明实施例中多壁碳纳米管对巨噬细胞蛋白质表达水平的影响；图5为采用本发明实施例中5种组合的caspase1sirna分子转染thp-1巨噬细胞后线粒体活性的检测结果；图6为采用本发明实施例中组合三的caspase1sirna分子转染thp-1巨噬细胞后caspase蛋白表达水平的检测结果；图7为采用本发明实施例中组合三的caspase1sirna分子转染thp-1巨噬细胞后nlrp3蛋白表达水平的检测结果。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。本发明实施例提供一种抑制caspase1基因表达的sirna分子(smallinterferingrna)，所述sirna分子包括正义链和反义链，包括如下组合中的一种。组合一：(1)、正义链的核苷酸序列如seqidno.1所示；和(2)、反义链的核苷酸序列如seqidno.2所示；或(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合二：(4)、正义链的核苷酸序列如seqidno.3所示；和(5)、反义链的核苷酸序列如seqidno.4所示；或(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合三：(7)、正义链的核苷酸序列如seqidno.5所示；和(8)、反义链的核苷酸序列如seqidno.6所示；或(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合四：(10)、正义链的核苷酸序列如seqidno.7所示；和(11)、反义链的核苷酸序列如seqidno.8所示；或(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列；或组合五：(13)、正义链的核苷酸序列如seqidno.9所示；和(14)、反义链的核苷酸序列如seqidno.10所示；或(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有85％同一性的核苷酸序列。在一个实施例中，所述sirna分子的序列包括如下组合中的一种：组合一：(1)、正义链的核苷酸序列如seqidno.1所示；和(2)、反义链的核苷酸序列如seqidno.2所示；或组合二：(4)、正义链的核苷酸序列如seqidno.3所示；和(5)、反义链的核苷酸序列如seqidno.4所示；或组合三：(7)、正义链的核苷酸序列如seqidno.5所示；和(8)、反义链的核苷酸序列如seqidno.6所示；或组合四：(10)、正义链的核苷酸序列如seqidno.7所示；和(11)、反义链的核苷酸序列如seqidno.8所示；或组合五：(13)、正义链的核苷酸序列如seqidno.9所示；和(14)、反义链的核苷酸序列如seqidno.10所示。其中，所述sirna分子通过抑制caspase1基因的表达，进而抑制gsdmd蛋白的活化。表1caspase1sirna分子序列在seqidno.1至seqidno.10所示的序列中，sirna分子均为双链结构，包括正义链和反义链。所述正义链由19个核苷酸组成，反义链由21个核苷酸组成。按照5'末端到3'末端的方向，反义链核苷酸序列的第1-19位与同一条sirna分子的正义链核苷酸序列完全互补。较佳地，在seqidno.1至seqidno.10所示的序列中，所述正义链和反义链的每一个核苷酸都是经过修饰的核苷酸。通过对核苷酸进行修饰，能够提高该caspase1表达抑制剂的稳定性、降低免疫原性，使得该caspase1表达抑制剂能够直接用于制备抑制基因caspase1表达的药物。较佳地，所述sirna分子的序列的核苷酸具有甲氧基修饰和氟代修饰。其中，所述甲氧基修饰和所述氟代修饰均为对核苷酸中的核糖2′-羟基的取代。也即，所述甲氧基修饰为甲氧基取代核苷酸中的核糖2′-羟基；所述氟代修饰为氟取代核苷酸中的核糖2′-羟基。其中，所述核苷酸序列正义链的第1、2、3、4、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述正义链中第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。所述核苷酸序列反义链的第1、3、4、5、7、10、12、13、15、17、18、19位的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链中第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。通过对正义链的上述位点的核苷酸中的核糖2'-羟基分别进行不同的修饰，配合对反义链的核苷酸中的核糖2'-羟基的相应位点的不同的修饰，能够提高sirna分子对核酸酶的抵抗力，提高其稳定性，同时还能降低其免疫原性，提高安全性。进一步地，在seqidno.1至seqidno.10所示的序列中，还包括硫代磷酸酯基的修饰，且正义链和反义链均具有硫代磷酸酯基修饰位点。所述硫代磷酸酯基修饰为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代。其中，所述正义链的硫代磷酸酯基的修饰位点为5'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸之间，和5'末端端部的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的至少一种。所述反义链的修饰位点为以下位置中的至少一种：5'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；5'末端端部的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；3'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸之间和3'末端端部的第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。通过分别在正义链和反义链的相应位点，采用p-s键代替p-o键的硫代修饰，能够大大的影响酶的降解作用，提高sirna分子抗核酸酶的能力，增加其稳定性。较佳地，所述sirna分子的序列为如seqidno.5和6所示的序列。采用该序列，与上述的具体位点的甲氧基取代核苷酸中的核糖2′-羟基、氟取代核苷酸中的核糖2′-羟基、p-s键代替p-o键对正义链的5'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的硫代修饰、p-s键代替p-o键对反义链的5'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的硫代修饰、p-s键代替p-o键对反义链的3'末端端部的第1个核苷酸和第2个核苷酸以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的硫代修饰，能够对caspase1基因有良好的抑制效果。本发明实施例还提供一种抑制基因表达的方法，所述基因为caspase1基因，所述方法包括利用如前任一所述的抑制caspase1基因表达的sirna分子转染细胞，以抑制所述细胞中所述caspase1基因的表达。本发明实施例还提供一种抑制基因表达的药物，包括有效量的如前任一所述的抑制caspase1基因表达的sirna分子和药学上可接受的载体。本发明实施例还提供一种抑制caspase1基因表达的sirna分子在制备抑制caspase1基因表达药物中的应用，所述sirna分子具有如前任一所述的抑制caspase1基因表达的sirna分子的序列。该药物具体可以为sirna分子。通常，上述caspase1基因抑制药物在本发明中一般以药物组合物的形式使用。该药物组合物可通过抑制caspase1基因的表达从而改善或治疗相关的疾病。抑制caspase1基因表达的药物可以为sirna分子药物，包括如前所述的caspase1sirna分子和药学上可接受的载体。应当说明的是，药学上可接受的载体是指一种或者多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，该可药用载体适合将本发明中的sirna分子应用于个体。所述药学上可接受的载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂等，和其他的适合本发明的sirna分子应用的载体。可注射用的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、甘油等；可口服用的载体包括甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。与此同时，作为生物学上中性的载体，应用的药理学组分中可以含有非毒性的辅助物质，包括湿化或者乳化剂、防腐剂、ph缓冲试剂、醋酸钠和单月桂酸酯等。优选地，所述药学上可接受的载体为纳米级材料，包括脂质体、聚合物纳米胶束、外泌体和其它纳米级材料。具体地，所述抑制caspase1基因表达的sirna分子药物为抵抗细胞焦亡、自发炎症、正常组织的炎症损伤或癌症的药物。较佳地，所述抑制caspase1基因表达的sirna分子药物为抵抗细胞焦亡的药物。具体地，所述抵抗细胞焦亡的药物通过抑制caspase1相关蛋白，如pro-caspase1蛋白和nlrp3的表达，增强细胞的线粒体活性。下面结合具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。试验材料：thp-1细胞系购自美国典型培养物保藏中心(manassas,va,usa)。多壁碳纳米管(mwcnt)购自南京xfnano材料技术有限公司。1：5000β-actin抗体，1：5000hrp山羊抗兔igg，购自美国proteintech。opti-memtm低血清培养基，购自thermo-fisher。opti-memtm低血清培养基购自thermo-fisher。实施例1sirna分子的性能决定了药物抑制基因caspase1表达效果的优劣。实施例1针对caspase1的mrna序列设计和筛选了多组sirna分子，如表1所示，最终筛选到五组优良的sirna分子组合(组合一至五)，一组最优的sirna分子组合(组合三)。因为此处的表2与前述表1的内容完全相同，因此，此处删除了表2表1中的sirna分子序列均由苏州贝信生物技术公司合成，sirna分子运用depc水溶解，储存在4℃备用。本实施例以人源的caspase1基因(geneid：834，updatedon21-jul-2020)检测指标为例。同时，为了验证sirna分子的基因抑制、逆转细胞焦亡效果，进行如下实验例验证。实验例1thp-1细胞的培养及诱导分化1)采用添加了10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基对thp-1细胞系细胞被培养进行培养。2)用10ng/ml佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma；sigma,st.louis,mo,usa)处理培养后的细胞24小时，将thp-1细胞分化为巨噬细胞，得到thp-1巨噬细胞。实验例2多壁碳纳米管mwcnt诱导thp-1巨噬细胞焦亡实验目的：筛选诱导thp-1巨噬细胞焦亡效果最佳的多壁碳纳米管的直径。诱导条件：根据多壁碳纳米管的直径设置为三个处理组，分别命名为xfm4，xfm22和xfm34，每个处理组的直径不相同，直径按xfm4<xfm22<xfm34的顺序。每个处理组均设置0、4、8、16、32和64μg/ml这6种不同的浓度。诱导处理的时间为24小时。诱导方法：将xfm4，xfm22和xfm34三个处理组的6种浓度分别使用超声波处理器连续超声处理16分钟后，悬浮在2％fbs中。将thp-1巨噬细胞以每孔2.4×105的细胞密度，分别注入24孔板中，并分别用xfm4，xfm22和xfm34的6种浓度直接接触24小时，每组3个复孔。实验例3caspase1sirna分子转染thp-1巨噬细胞抑制caspase1基因表达、逆转细胞焦亡。转染方法：将thp-1巨噬细胞以每孔7×105的细胞密度，接种在6孔板中，将40nm化学修饰的组合一至组合五的caspase1sirna分子分别稀释在0.5mlopti-memtm低血清培养基中，将3μllipofectamine2000试剂也稀释于0.5mlopti-memtm中，各自静置5min，然后把sirna分子和lipofectamine2000充分混匀，作为处理组。室温静置10min，最后将此混合溶液加入细胞培养板内转染细胞，4小时后，每孔中额外加入1ml完全培养基，继续转染至24小时。对照组为未添加sirna分子的组，处理组和对照组每组3个复孔。诱导方法：将经过sirna分子转染的thp-1巨噬细胞分别与32μg/ml的xfm4培养24小时进行细胞焦亡诱导。检测方法：诱导结束后，运用cck-8法检测细胞的活性。使用提取总的rna，反转录并进行荧光实时定量pcr检测。使用westernblot(蛋白质印迹法)检测细胞蛋白质表达水平。应当说明的是，具体的检测方法分别与前述的实验例2中的检测方法相同，此处不再赘述。结果分析1、多壁碳纳米管诱导thp-1巨噬细胞焦亡的结果1)cck-8法检测多壁碳纳米管诱导后巨噬细胞线粒体的活性检测结果如图1所示。可以看出，对于不同浓度的处理组xfm4，xfm22和xfm34，以浓度为32μg/ml最为适宜，与其余浓度的处理组对细胞的活性影响差异显著，且均差较为稳定。2)rna测序检测多壁碳纳米管对巨噬细胞信号通路的影响检测结果如图2。图2中的数值是将多壁碳纳米管对单个信号通路的影响的p值取-log(10)对数以后作图得到的，因此多壁碳纳米管的作用越明显，p值越小，相对应的取-log(10)对数以后得到的数值也越大。其中，以处理组xfm4的数值最大，对信号通路的影响最大。3)tem观察多壁碳纳米管诱导后巨噬细胞形态的变化检测结果如图3所示。其中，a组为对照组thp-1巨噬细胞的形态。b组、c组和d组分别为32μg/ml的xfm4，xfm22和xfm34三个处理组的thp-1巨噬细胞的形态。图中可以看到，处理组细胞均内吞大量的mwcnt(多壁碳纳米管材料)。且xfm4处理组中出现multi-pores(细胞膜穿孔的现象)。4)westernblot(蛋白质印迹法)检测多壁碳纳米管诱导后巨噬细胞蛋白质表达水平的变化检测结果如表2和图4所示。其中，设定对照组的巨噬细胞蛋白质表达量为100％，处理组的蛋白表达量为相对对照组的百分比变化。比较可得，xfm4处理组中，巨噬细胞蛋白表达量相对于对照组的百分比变化最大，且差异显著。综合上述结果，信号通路与免疫系统/炎症反应相关，对信号通路的影响越大，代表细胞焦亡的程度越大。细胞膜穿孔的现象，是细胞焦亡的重要标志。因此，浓度为32μg/ml处理组xfm4对细胞焦亡的诱导效果最好。表2巨噬细胞caspase1相关蛋白质表达水平对照组(control)处理组(xfm4)处理(xfm22)处理组(xfm34)cleavedcaspase1100±2.46385.55±3.85177.97±5.47142±4.632、caspase1sirna分子对thp-1巨噬细胞焦亡的影响1)rt-pcr(荧光定量实时pcr)法检测采用组合一至组合五的caspase1sirna分子转染thp-1巨噬细胞后，pro-caspase1基因的mrna表达水平，可反映caspase1基因抑制效率。检测结果如表3所示。由表3可知，采用组合一至组合五的caspase1sirna分子转染后能够极大地抑制pro-casepase1mrna的表达。其中，采用组合三所示序列的caspase1sirna分子对于pro-casepase1基因的抑制率高于80％，效果最好。表3thp-1细胞pro-caspase1mrna抑制效果2)cck-8法检测采用caspase1sirna分子转染、多壁碳纳米管诱导后巨噬细胞线粒体的活性。检测结果如表4和图5。其中，设定对照组的线粒体的活性为100％，处理组的活性百分比数据为相对对照组的百分比变化。可以看出，xfm4处理组的巨噬细胞线粒体活性百分比相较于对照组有明显提升，且组合3序列sirna分子细胞活性最高。3)westernblot(蛋白质印迹法)法检测采用组合三caspase1sirna分子转染、多壁碳纳米管诱导后巨噬细胞蛋白质的表达水平。检测结果如表5、图6和图7。其中，设定对照组的巨噬细胞蛋白质表达量为100％，处理组的蛋白表达量为相对对照组的百分比变化。可以看出，xfm4处理组的巨噬细胞蛋白表达量相对于对照组的百分比变化很大，且差异显著。表4thp-1细胞线粒体活性(％)表5caspase1sirna分子转染、mwcnt诱导后thp-1细胞蛋白质表达水平上述结果表明，所述5种组合的sirna分子序列能够抑制caspase1基因和相关蛋白的表达、提高线粒体的活性。上述对本说明书特定实施例进行了描述。其实施例在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或步骤可以按照不同于实施例中的顺序来执行并且仍然可以实现期望的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出的特定顺序或者连续顺序才能实现期望的结果。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。在阐述了具体细节以描述本发明的示例性实施例的情况下，对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下或者这些具体细节有变化的情况下实施本发明。因此，这些描述应被认为是说明性的而不是限制性的。尽管已经结合了本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>湖南中医药大学<120>一种抑制caspase1基因表达的sirna分子及其应用<130>fi200479-nd<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>rna<223>人工序列<400>1gacauauuccuagaagaa19<210>2<211>21<212>rna<223>人工序列<400>2uucuucuaggaauacuguaaa21<210>3<211>19<212>rna<223>人工序列<400>3guucaugucucaugguauu19<210>4<211>21<212>rna<223>人工序列<400>4aauaccaugagacaugaacac21<210>5<211>19<212>rna<223>人工合成<400>5gaagagauccuucuguaaa19<210>6<211>21<212>rna<223>人工合成<400>6uuuacagaagcaucucuucac21<210>7<211>19<212>rna<223>人工合成<400>7gaaagagugacuuugacaa19<210>8<211>21<212>rna<223>人工合成<400>8uugucaaagucacucuuucag21<210>9<211>19<212>rna<223>人工合成<400>9gagauauacuacaacucaa19<210>10<211>21<212>rna<223>人工合成<400>10uugaguuguaguauaucuggg21当前第1页12