一种植物根腐病生防菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物根腐病生防菌及其应用。

背景技术：

根腐病是一种发生在植物根部，造成植物根系不发达，地上部分矮小、瘦弱，叶色淡绿，分枝、结实明显减少的植物类疾病。根腐病发病初期，仅仅是个别支根、须根染病，并逐渐向主根扩展。主根染病后，早期植株不表现症状，后随着根部腐烂程度的加剧，植株吸收水分和养分的功能逐渐减弱，植株叶片出现萎蔫。病情严重时，根皮变褐、并与髓部分离，叶片萎蔫，植物猝倒、死亡。根腐病是我国农业生产上一大严重病害，在我国几乎各地、各种农作物上都有发生，严重地区减产或绝收。

以大豆根腐病为例，大豆根腐病由多种病原菌引起，目前，在我国已经报道的大豆根腐病的病原菌主要包括：大豆疫霉菌(phytophthorasojae)、终极腐霉菌(pythiumultimum)、尖镰孢菌(fusariumoxysporum)、茄腐镰孢菌(fusariumsolani)、禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)等。据统计，每年因根腐病造成大豆30％以上的减产，严重时甚至导致绝收。大豆根腐病不仅病原种类复杂，还可以复合侵染，因此，大豆根腐病防治难度较大。

现有技术中大豆根腐病的防治主要包括以下方式：1、使用抗病品种植株，但是由于病原菌致病群体复杂、毒力变异快，致使大豆品种的抗性容易丧失；2、化学药剂，化学药剂虽然能够在一定程度上防治大豆根腐病，但是大量使用化学药剂会导致病原菌产生抗药性。此外，药剂残留超标会导致环境污染、危害人类健康。

植物周围环境中存在着许多有益微生物，这些微生物不仅不会使植物致病，有些甚至能够诱导植物产生抗性，提高植物在生物胁迫或非生物胁迫条件下的生存能力。此外，这些微生物来源于自然环境，对环境无污染，使用这些微生物防治植物病有利于保持生态平衡。现在，越来越多的研究人员致力于寻找环境益生菌作为生物防控的方法治理植物类疾病。

综上所述，现有技术还缺少一种预防植物根腐病的绿色、高效的环境益生菌。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明公开了一种能够有效防治植物根腐病的有益微生物及其应用。

本发明的第一个方面，提供了一种植物根腐病生防菌，所述生防菌命名为寡雄腐霉pyo34-3，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.20224。

所述cgmccno.20224已于2020年7月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)登记保藏，保藏编号为cgmccno.20224，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

优选的，所述寡雄腐霉pyo34-3筛选自南京市江宁区大豆田。

优选的，所述植物根腐病包括大豆根腐病、番茄根腐病、草莓根腐病和烟草根腐病。

本发明的第二个方面，提供了一种工程菌，所述工程菌包含生防菌寡雄腐霉pyo34-3的核酸片段。

优选的，所述核酸片段的碱基序列包括seqidno.1和seqidno.2；

seqidno.1：

aactttccacgtgaaccgttataactatgttctgtgcttcgtcgcaagacttgaggctgaacgaaggtgagtctgcgtctattttggatgcggatttgctgatgttattttaaacacctattacttaatactgaactatactccgaatacgaaagtttttggttttaacaattaacaactttcagcagtggatgtctaggctcgcacatcgatgaagaacgctgcgaactgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgagtcatcgaaattttgaacgcatattgcactttcgggttatgcctggaagtatgcctgtatcagtgtccgtacatcaaacttgcctttctttttttgtgtagtcaaaattagagatggcagaatgtgaggtgtctcgcgctgtctttttaaagatggttcgagtccctttaaatgtacgttgattctttcttgtgtctgcgaattgcgatgctatgctctttgtgatcggtttagattgctttgcgctggtgggcgacttcggttaggacatatggaagcaacctcaattggcggtatgttcggctttgcctgacgttaagctaagcgagtgtagttttctgtcttttccttgaggtgtacctgtcgtgtgtgaggttgatttaggctatatggttgcttggttgtgtggtttagcgttttcagacgcctgcttcggtaggtaaaggagacaacaccaatttgggactgagagtttactctctttttcactttggacctgatatcaggtaagactacccgctgaacttaagcatatcataaacgggaaaaagaaatac

seqidno.2：

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优选的，所述生防菌命名为寡雄腐霉pyo34-3，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.20224。

优选的，所述寡雄腐霉pyo34-3筛选自南京市江宁区大豆田。

优选的，所述植物包括大豆、番茄、草莓和烟草。

本发明的第三个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含寡雄腐霉pyo34-3或其工程菌。

优选的，所述生防菌命名为寡雄腐霉pyo34-3，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.20224。

优选的，所述寡雄腐霉pyo34-3筛选自南京市江宁区大豆田。

优选的，所述植物包括大豆、番茄、草莓和烟草。

本发明的第四个方面，提供了一种植物根腐病生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分包括权利要求1所述的寡雄腐霉pyo34-3的菌丝、孢子和次生代谢物中的一种或几种。

优选的，所述寡雄腐霉pyo34-3的孢子的含量不少于1×10⁶个/g^-1；进一步优选的，所述寡雄腐霉pyo34-3的孢子的含量不少于1×10⁸个/g^-1。

优选的，所述寡雄腐霉pyo34-3的菌丝由寡雄腐霉pyo34-3接种于v8培养基、避光培养制得。

优选的，所述生防菌剂包括生防化肥、生防农药。

本发明的第五个方面，提供了一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、将大豆秸秆、大豆粉和蛭石混合，制成基质；

s2、向基质中加入寡雄腐霉pyo34-3的菌丝、孢子或次生代谢物；

s3、加入无菌水，使s2得到的混合物的含水量为50％-80％；

s4、将s3得到的产物密封培养数天得到生防菌剂。

优选的，所述方法包括如下步骤：

a1：将寡雄腐霉菌株pyo34-3接种于直径9cm的内含有20ml、10％的未过滤的v8培养基中，于25℃、避光培养4d待其长满培养皿。

a2：将基质(大豆秸秆：大豆粉：蛭石＝100：5：10)在121℃环境下高温灭菌20min，冷却后装入带有透气孔的无菌固体发酵袋中。每袋基质1500g。

a3：将长满寡雄腐霉pyo34-3的培养基加入基质中，加入无菌水使基质中的水分含量达到70％，封口后置于28℃培养箱中黑暗培养15d，制得寡雄腐霉pyo34-3的固体发酵菌剂。

本发明的第六个方面，提供了本发明所述的生防菌、工程菌、组合物和生防菌剂在防治植物根腐病中的应用。

本发明的第七个方面，提供了一种植物根腐病的防治方法，包括向植物生长环境中施用本发明提供的生防菌、工程菌、组合物或生防菌剂。

优选的，所述植物生长环境为植物苗下胚轴生长处。

优选的，所述植物根腐病包括由大豆疫霉、终极腐霉、尖孢镰刀菌和拟茎点霉中的一种或多种引起的植物病。

优选的，所述植物包括大豆、番茄、草莓和烟草。

现有技术相比，本发明具有如下优点或者有益效果：本发明提供的生防菌寡雄腐霉pyo34-3能够显著降低植物根腐病的病害严重度，其平均生防效果达到55.23％，同时还能够显著提高植物产量，其平均增产率达到16.00％。

附图说明

图1为实施例1中编号为34-3的菌诱导大豆抗性的效果图；

图2为实施例1中编号为34-3的菌对大豆生长影响的结果图；

图3为实施例2中菌寡雄腐霉pyo34-3对大豆疫霉p6497导致的植物根腐病的影响；

图4为实施例2中菌寡雄腐霉pyo34-3对终极腐霉导致的植物根腐病的影响；

图5为实施例2中菌寡雄腐霉pyo34-3对尖孢镰刀菌导致的植物根腐病的影响；

图6为实施例2中菌寡雄腐霉pyo34-3对拟茎点霉导致的植物根腐病的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

如本发明中所述，术语“生防菌”指有益微生物，可以防治植物病害，主要有细菌、真菌、放线菌。

如本发明中所述，术语“工程菌”指采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。

如本发明中所述，术语“大豆疫霉菌”分类地位：藻物界(chromista)、卵菌门(oomycota)、霜霉目(peronosporales)、腐霉科(pythiacea)、疫霉属(phytophthora)。主要分布在美国、加拿大、巴西、阿根廷、日本、澳大利亚、英国、匈牙利、尼日利亚、印度、中国、埃及、以色列、南非、德国、瑞士、新西兰等国家。

如本发明中所述，术语“终极腐霉”属于藻物界(chromista)、卵菌门(oomycota)、霜霉目(peronosporales)、腐霉科(pythiacea)、腐霉属(pythium)，菌落在cma上呈放射状。菌丝发达，分枝繁茂，粗2.3-9.8μm。最初从英国腐败的水芹幼苗上分离出，报道分布甚广，它不仅栖息在土壤中，还广泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。

如本发明中所述，术语“尖孢镰刀菌”属半知菌类(imperfectifungi)、从梗孢目(moniliales)、瘤座孢科(tuberculariaceae)、镰刀菌属(fusarium)。是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。

如本发明中所述，术语“拟茎点霉”属壳霉目，壳霉科，分布广泛。

实施例1菌寡雄腐霉pyo34-3的筛选

1、初筛：分离潜在的生防菌

1.1、获取试验材料：从常年发生根腐病的田间(南京市江宁区大豆田)选取长势良好的大豆植株，取其根部组织和根际土壤。

1.2、大豆根部微生物的分离及培养：剪取大豆的根部组织，用无菌水冲洗三遍，用灭菌手术刀将清洗的根部组织切成0.5-1cm的小段，用无菌吸水纸吸干根部组织表面水分，置于含有氨苄青霉素、利福平及五氯硝基苯的v8琼脂固体培养基上，放置于25℃培养箱中培养2天。

1.3、大豆根际土壤微生物的分离及培养：用灭菌的镊子取土0.25g，放入含有氨苄青霉素、利福平及五氯硝基苯的v8琼脂固体培养基上，放置于25℃培养箱中培养2天。待样品周围长出菌丝后，切取2×2mm大小的菌丝块置于新的带有氨苄青霉素、利福平及五氯硝基苯的v8固体培养基中再次培养2天。

2、微生物培养物侵染大豆黄花苗

分别将步骤1.2获取的大豆根部微生物培养物和步骤1.3获取的大豆根际土壤微生物培养物转接至v8固体培养基中，置于25℃培养箱中培养2天。用灭菌打孔器将培养基打成直径为0.5cm的菌饼，将菌饼接种到大豆黄花苗下胚轴上，保湿培养三天后，观察微生物在大豆上的侵染状况，以此筛选出对大豆无致病力的菌株。

3、筛选能够促进大豆生长的菌株

3.1、从步骤2中长势良好的大豆根部分离出对大豆无致病力的菌株，菌株分别接种于直径9cm的培养皿中(内含20ml未过滤的v8培养基)，25℃培养4d。

3.2、将步骤3.1获得的菌株平板分别切成0.5cm×0.5cm的小块。设置实验组和对照组，其中，实验组为：2个同种菌株小块用灭菌水混合均匀，然后加入至盆钵2/3处，播种5颗大豆种子，随后用拌过菌的蛭石将大豆种子覆盖。对照组为：v8培养基和灭菌水混合均匀，然后加入至盆钵2/3处，播种5颗大豆种子，随后将大豆种子覆盖。每个处理3个重复。播种10d后统计其发芽率、株高、根长、鲜重、干重。

3.3、统计发芽率、株高、根长、鲜重、干重参数信息均优于对照组的菌株实验组，并收集相对应的菌株小块。

4、筛选能够诱导大豆产生抗性的菌株

4.1、将步骤3.3获得的菌株小块分别接种大豆黄化苗，3d后取掉菌株小块，用直径1.5cm的打孔器打入大豆疫霉菌菌饼，重新卷起吸水纸，并用锡箔纸包裹，露出大豆子叶。置于光下，25℃培养5d。

4.2、为了对各处理的大豆发病情况进行更准确的量化，将病情级别有所下降的大豆苗以接种点为中心上下各取2.5cm，共5cm的大豆组织，每处理取3株。用植物基因组dna提取试剂盒提取总dna，以大豆的管家基因cyp2作为内参基因，对大豆疫霉菌的actin进行定量分析，以比较大豆组织内病原菌的侵入量。从而筛选出能够诱导大豆产生抗性，抵抗大豆疫霉菌侵染的菌株。

其中，病级数分级标准：0：幼苗茎基部和主根上均无病斑；1：茎基部和主根上有少量病斑，病斑面积在1/4以下；2：茎基部和主根上病斑面积占茎基和主根总面积的1/4-1/2左右；3：茎基部和主根上病斑面积占1/2-3/4左右；4：茎基和主根上病斑连片，形成绕茎现象，但根系并未坏死；5：根系坏死，地上部萎蔫或死亡。

最终筛选得到一株对大豆无致病性且促进大豆生长、并能诱导大豆抗性的菌株，编号为34-3。

如图1所示，左图为对照组豆苗根部，右图为实验组接种编号为34-3的菌的豆苗根部。图中深色部分是菌侵染的病斑，可见实验组的菌斑明显少于对照组，实验组产生了抗性。

如图2所示，左图为对照组豆苗，右图为实验组接种编号为34-3的菌的豆苗。可见，接种编号为34-3的菌的豆苗株高和根长均明显优于对照组，因此，编号为34-3的微生物培养物可以促进大豆生长。

5、筛选所得菌株的分子生物学鉴定

5.1、将纯化所得的微生物培养物置于v8液体培养基中，25℃培养两天，培养液离心收集菌丝体。

5.2、采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组dna快速提取试剂盒提取所收集菌丝体的基因组dna。

5.3、采用大连宝生物科技有限公司的pcr扩增试剂盒扩增步骤5.2得到的基因组dna的its2(internaltranscribedspacer2)和coi1(cytochromeoxidasesubunit1)基因。

5.4、扩增所得pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的pcr产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果于为：步骤4筛选得到的菌株的its2基因序列为seqidno.1,coi1基因序列为seqidno.2。

5.5、在ncbi数据库网站上比对seqidno.1和seqidno.2两条序列。比对结果如表1所示。根据表1结果可以推定本发明的生防菌34-3为寡雄腐霉(pythiumoligadrum)，命名为菌寡雄腐霉pyo34-3。

表1

实施例2菌寡雄腐霉pyo34-3对不同植物根腐病菌导致的根腐病的影响

本发明的发明人进行了大量的实施例1筛选的菌寡雄腐霉pyo34-3对不同植物根腐病菌导致的根腐病的影响的试验，以下以大豆疫霉、终极腐霉、尖孢镰刀菌和拟茎点霉为例进行说明。

【大豆疫霉】

寡雄腐霉pyo34-3对大豆疫霉导致的植物根腐病的影响试验方法包括如下步骤：

r1、将寡雄腐霉菌株pyo34-3、大豆疫霉p6497分别接种于直径9cm的含有20ml、10％的未过滤的v8培养基的培养皿中，分别于25℃、避光培养4d和7d，待菌株长满培养皿；

r2、选择直径为12cm的盆钵，将长满寡雄腐霉pyo34-3和大豆疫霉p6497的培养基切成0.5cm×0.5cm的平板块。试验设置2组，对照组为：每个盆钵加入2个0.5cm×0.5cm的v8平板和2个0.5cm×0.5cm的大豆疫霉p6497的平板块；实验组为：每个盆钵加入2个0.5cm×0.5cm的寡雄腐霉pyo34-3的平板块和2个0.5cm×0.5cm的大豆疫霉p6497的平板块。每个设置3个重复；

r3、用无菌水和灭菌的蛭石将2各种平板块搅拌均匀，加入盆钵到1/3处，向每个盆钵中播种20颗大豆(品种为合丰47)，随后用平板粉末将大豆覆盖；

r4、用无菌水浇灌各组大豆，播种14d后统计大豆的发芽率、株高和鲜重；结果如图3和表2所示。

表2

其中，表中出苗率、株高和鲜重的数值表达方式为：平均值±标准误差。

从图3可知，实验组的株高、出芽数量、茂盛程度明显优于对照组，可见，菌寡雄腐霉pyo34-3对大豆疫霉p6497导致的植物根腐病有预防或治愈的作用。

表2中实验组的出苗率比对照组增加约50％，株高和鲜重也明显增加。

从图3和表2的结果可以看出，本发明分离的生防菌寡雄腐霉pyo34-3对大豆疫霉导致的植物根腐病具有显著的防治效果。pyo34-3处理可显著提高大豆的出苗率、株高和鲜重。

【终极腐霉】

采用步骤r1-r4的方法检测菌寡雄腐霉pyo34-3对终极腐霉导致的植物根腐病的影响。实验中，将大豆疫霉p6497换成终极腐霉pyu1。试验结果如图4和表3所示。

表3

从图4可知，实验组的株高、出芽数量、茂盛程度明显优于对照组，可见，菌寡雄腐霉pyo34-3对终极腐霉导致的植物根腐病有预防或治愈的作用。

表3中实验组的出苗率为63.33±10.41、对照组出苗率为8.33±2.43，实验组的出苗率相对于对照组呈倍数增加，株高和鲜重也明显增加。

从图4和表3的结果可以看出，本发明的生防菌寡雄腐霉pyo34-3对终极腐霉导致的植物根腐病具有显著的防治效果，pyo34-3处理显著提高了大豆的出苗率、株高和鲜重。

【尖孢镰刀菌】

采用步骤r1-r4的方法检测菌寡雄腐霉pyo34-3对尖孢镰刀菌导致的植物根腐病的影响。实验中，将大豆疫霉p6497换成尖孢镰刀菌。试验结果如图5表4所示。

表4

从图5可知，实验组的株高、出芽数量、茂盛程度明显优于对照组，可见，菌寡雄腐霉pyo34-3对终极腐霉导致的植物根腐病有预防或治愈的作用。

表4中实验组的出苗率、株高和鲜重均明显优于对照组。

从图5和表4的结果可以看出，本发明的生防菌寡雄腐霉pyo34-3对尖孢镰刀菌导致的植物根腐病具有显著的防治效果，pyo34-3处理显著提高了大豆的出苗率、株高和鲜重。

【拟茎点霉】

采用步骤r1-r4的方法检测菌寡雄腐霉pyo34-3对拟茎点霉导致的植物根腐病的影响。实验中，将大豆疫霉p6497换成拟茎点霉。试验结果如图6和表5所示。

表5

从图6可知，实验组的株高、出芽数量、茂盛程度明显优于对照组，可见，菌寡雄腐霉pyo34-3对拟茎点霉导致的植物根腐病有预防或治愈的作用。

表5中，实验组的出苗率比对照组增加约50％，实验组的株高比对照组增加约40％，鲜重也明显增加。

从图6和表5的结果可以看出，本发明的生防菌寡雄腐霉pyo34-3对拟茎点霉导致的植物根腐病具有显著的防治效果，pyo34-3处理显著提高了大豆的出苗率、株高和鲜重。

实施例3寡雄腐霉pyo34-3的现场试验

步骤一、将寡雄腐霉菌株pyo34-3接种于直径9cm的内含有20ml、10％的未过滤的v8培养基中，于25℃、避光培养4d待其长满培养皿。

步骤二、将基质(大豆秸秆：大豆粉：蛭石＝100：5：10)在121℃环境下高温灭菌20min，冷却后装入带有透气孔的无菌固体发酵袋中。每袋基质1500g。

步骤三、将长满寡雄腐霉pyo34-3的培养基切成0.5cm×0.5cm的小块，每袋基质接种两块，加入无菌水使基质中的水分含量达到70％，封口后置于28℃培养箱中黑暗培养15d，制得寡雄腐霉pyo34-3的固体发酵菌剂。

步骤四、镜检寡雄腐霉pyo34-3的固体发酵菌剂，其卵孢子数量为1×10⁸个/g^-1。同时，培养和镜检均未发现杂菌污染，符合《农用微生物菌剂》gb20287-2006标准。

步骤五、大豆田间种植(南京农业大学白马基地)采用等距穴播栽培法，行距70cm，穴距15～20cm，每穴2-3株。大豆品种为苏豆13。实验采用完全随机设计，每个处理3个重复，每个重复的小区面积为20m²(4m×5m)，小区与小区之间均设有保护行。大豆穴播过程中将寡雄腐霉pyo34-3的固体发酵菌剂每穴施用100g，随大豆种子一起施用。大田实验均采用标准的田间管理模式，并且不再使用任何其它的杀菌剂。

步骤六、播种后30天(大豆苗期)统计植物根腐病的病害防治情况。每个处理随机取10株苗，取样时先去掉表土(0～5cm)，将植株连根挖出，保持根系完整，计算根腐病病情指数和根腐病防效。其中，病情指数＝(病情株数×病级数)/(株数总和×最高病级值)×100，防治效果(％)＝(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数×100。结果如表6、7所示。其中，病级数按照实施例1步骤4.2中的方法分级。

表6

表7

从上述表6和7的结果可以看出，本发明的生防菌寡雄腐霉pyo34-3能够显著降低植物根腐病的病害严重度，其平均生防效果达到55.23％，同时还能够显著提高大豆产量，其平均增产率达到16.00％。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种植物根腐病生防菌及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>820

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aactttccacgtgaaccgttataactatgttctgtgcttcgtcgcaagacttgaggctga60

acgaaggtgagtctgcgtctattttggatgcggatttgctgatgttattttaaacaccta120

ttacttaatactgaactatactccgaatacgaaagtttttggttttaacaattaacaact180

ttcagcagtggatgtctaggctcgcacatcgatgaagaacgctgcgaactgcgatacgta240

atgcgaattgcagaattcagtgagtcatcgaaattttgaacgcatattgcactttcgggt300

tatgcctggaagtatgcctgtatcagtgtccgtacatcaaacttgcctttctttttttgt360

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gcaacctcaattggcggtatgttcggctttgcctgacgttaagctaagcgagtgtagttt600

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<210>2

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<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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ttcaactatagctgatgatactaataataataacgaaggtggtaataaccaaaaactaat360

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