1.本发明涉及食品加工领域，具体地说是一种桑葚果渣醋及其制备方法。
背景技术：
：：2.桑葚(mulberry)又名桑椹子、乌葚、桑果，桑葚果在成熟初期由绿色变红色，后期由红色转变为紫黑色，成熟期主要在4～6月。桑葚主要生长在热带和亚热带等气候适宜的地区，桑葚中富含花青素、多糖、多酚、氨基酸、有机酸等多种功能成分，具有补肝益肾、滋阴补血、延缓衰老、调节免疫力等众多功效，目前在发展中国家，果渣等副产物大部分没有得到充分利用，丢弃后的果渣会给环境造成污染(sethibk,nandapk,sahoos.enhancedproductionofpectinasebyasperbllusterreusncft4269.10usinbbananapeelsassubstrate[j].3biotech,2016,6(1):36.)。而我国是水果种植面积和产地居前列的国家之一，每年都有近千万吨的丢弃果渣。若没有得到恰当的处理，果渣资源造成严重的浪费，甚至会给环境带来危害(胡聪等.果渣的利用现状及开发动向[j].饲料工业,2017,38(13):44‑46.)。因此，对果渣进行充分利用是非常必要的。桑葚果渣仍残留大量可溶性膳食纤维(廖李等.桑葚果渣可溶性膳食纤维提取工艺优化[j].湖北农业科学,2014,53(24):6086‑6089.)、白藜芦醇(陈琼玲等.响应面法优化桑葚果渣中白藜芦醇的提取工艺[j].山西农业科学,2016,44(06):836‑839+856.)、花青素(aramwitpetal，2010；zhangwnetal，2011)、多酚(邓义书等.超声波辅助提取桑葚果渣中多酚物质的工艺研究[j].食品工业科技,2011,32(08):314‑317.)和黄酮等具有生理活性及保健功能的营养成分，加工榨汁后产生大量的果渣，而桑葚果渣的含水量较高，容易招蚊虫，把果渣重新运回基地丢掉，这样既造成环境污染，又造成了资源的浪费，据研究报道，每年都会有大量的果渣没有得到充分利用；因此对企业桑葚果渣等副产物综合利用具有重要的研究意义。技术实现要素：[0003]针对上述问题，为了解决现有技术中存在的不足,本发明目的是增加贵州桑葚酒厂的果渣和霜桑叶副产物附加值，变废为宝，使桑葚果渣和桑叶得到综合利用。提供了一种桑葚果渣醋及其制备方法。[0004]本发明技术方案如下：[0005]一种桑葚果渣醋，其制备方法如下：将桑葚果渣进行调配，调配后加入酵母菌，酵母菌的接种量为桑葚果渣总质量的0.04～0.05％，于26℃～28℃温度下进行酒精发酵，发酵时间为5d，发酵后加入醋酸杆菌，醋酸杆菌的接种量为桑葚果渣总质量的11.91％‑12.0％，再加入霜桑叶调节含水量制醋醅，醋醅于28℃～36℃，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，发酵结束，发酵后进行淋醋，浸泡7‑9h，反复浸泡三次,再进行过滤，离心，灭菌，最终得到成品。[0006]所述调配是指在桑葚果渣中同时加入桑葚果汁和糖，糖的添加量为桑葚果渣总质量的12～16％，桑葚果汁添加量为为桑葚果渣总质量的21％。[0007]所述酒精发酵过程中可加入糖，添加量为桑葚果渣总质量的12～16％最佳。[0008]所述醋醅的含水量为79.44％‑79.5％最佳。[0009]所述初始酒精度为7.63％vol‑7.7％vol。[0010]所述醋醅发酵温度为32.1℃，每隔24h搅拌一次。[0011]所述灭菌条件于65℃下处理30min；所述离心条件为4000r/min，处理20min。[0012]一种桑葚果渣醋的制备方法，制备方法如下：在桑葚果渣进中加入糖，糖的添加量为桑葚果渣总质量的12～16％，搅拌均匀后加入酵母菌，酵母菌的接种量为桑葚果渣总质量的0.04～0.05％，于26℃～28℃温度下进行酒精发酵，发酵时间为5d，发酵后加入醋酸杆菌，醋酸杆菌的接种量为桑葚果渣总质量的11.91％‑12.0％，再加入霜桑叶调节含水量制醋醅，醋醅于28℃～36℃，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，发酵结束，发酵后进行淋醋，浸泡7‑9h，反复浸泡三次，再进行过滤，离心，灭菌，最终得到成品。[0013]本发明的主要优点是：[0014]本发明对桑葚果渣醋进行了工艺优化，桑葚果渣醋的最佳发酵工艺条件，监测果醋酒精发酵及醋酸发酵过程中花青素、酸度、多酚和黄酮等指标的变化，通过成品果醋理化指标综合分析，开发一款多酚、黄酮含量较高的果醋。精确了醋醅的含水量，初始酒精度和醋醅发酵温度，使得成品能够达到最佳的发酵效果，口感好味道佳，营养最适。具有良好的抗氧化、降血糖功效及一定的抗菌功能。附图说明[0015]图1‑1为含水量与酒精度的响应面图；[0016]图1‑2为含水量与酒精度的等高线图；[0017]图2‑1为含水量与温度的响应面图；[0018]图2‑2为含水量与温度的等高线图；[0019]图3‑1为含水量与接种量的响应面图；[0020]图3‑2为含水量与接种量的等高线图；[0021]图4‑1为酒精度与温度的响应面图；[0022]图4‑2为酒精度与温度的等高线图；[0023]图5‑1为酒精度与接种量的响应面图；[0024]图5‑2为酒精度与接种量的等高线图；[0025]图6‑1为温度与接种量的响应面图；[0026]图6‑2为温度与接种量的等高线图；[0027]图7还原糖含量的标准曲线figure7standardcurveofreducingsugarcontent；[0028]图8多酚含量的标准曲线figure8standardcurveofpolyphenolcontent；[0029]图9黄酮含量的标准曲线figure9standardcurveforflavonoidcontent；[0030]图10桑葚果渣酒精发酵过程中酒精与还原糖含量的变化figure10changesinthecontentofalcoholandreducingsugarduringthealcoholfermentationofmulberrypomace；[0031]图11桑葚果渣酒精发酵过程中花青素含量的变化figure11changesinanthocyanincontentduringalcoholfermentationofmulberrypomace；[0032]图12不同温度对桑葚果渣酒精发酵过程中酒精含量的影响figure12theeffectofdifferenttemperaturesonthealcoholcontentofmulberrypomaceduringalcoholfermentation；[0033]图13不同温度对桑葚果渣酒精发酵过程中花青素含量的影响figure13theeffectofdifferenttemperaturesontheanthocyanincontentduringthealcoholfermentationofmulberrypomace；[0034]图14不同接种量对桑葚果渣酒精发酵过程中酒精含量的影响figure14theeffectofdifferentinoculationdosesonthealcoholcontentofmulberrypomaceduringalcoholfermentation；[0035]图15不同接种量桑葚果渣对酒精发酵过程中花青素含量的影响figure15effectofdifferentinoculummulberrypomaceontheanthocyanincontentduringalcoholfermentation；[0036]图16不同蔗糖添加量对桑葚果渣酒精发酵中花青素含量的影响figure16effectofdifferentamountsofsucroseontheanthocyanincontentinalcoholfermentationofmulberrypomace；[0037]图17不同含水量的醋醅在醋酸发酵过程中总酸含量的变化figure17changesintotalacidcontentofvinegarwithdifferentwatercontentsduringaceticacidfermentation；[0038]图18不同含水量的醋醅在醋酸发酵过程中多酚含量的变化figure18variationofpolyphenolcontentofvinegarwithdifferentwatercontentduringaceticacidfermentation；[0039]图19不同含水量的醋醅在发酵过程中黄酮含量的变化figure19changesinflavonoidcontentofvinegarwithdifferentwatercontentduringfermentation；[0040]图20不同酒精度的醋醅在醋酸发酵过程中总酸含量的变化figure20changesintotalacidcontentofvinegarwithdifferentalcoholcontentduringaceticacidfermentation；[0041]图21不同酒精度的醋醅在醋酸发酵过程中多酚含量的变化figure21changesinpolyphenolcontentofvinegarwithdifferentalcoholcontentduringaceticacidfermentation；[0042]图22不同酒精度的醋醅在醋酸发酵过程中黄酮含量的变化figure22changesinflavonoidcontentofvinegarwithdifferentalcoholcontentduringaceticacidfermentation；[0043]图23不同温度下发酵的醋醅在醋酸发酵过程中总酸含量的变化figure23changesintotalacidcontentofvinegarfermentedatdifferenttemperaturesduringaceticacidfermentation；[0044]图24不同温度下发酵的醋醅在醋酸发酵过程中多酚含量的变化figure24changesinpolyphenolcontentofvinegarfermentedatdifferenttemperaturesduringaceticacidfermentation；[0045]图25不同温度下发酵的醋醅在醋酸发酵过程中黄酮含量的变化figure25changesinflavonoidcontentofvinegarfermentedatdifferenttemperaturesduringaceticacidfermentation；[0046]图26不同接种量的醋醅在醋酸发酵过程中总酸含量的变化26changesintotalacidcontentofvinegarwithdifferentinoculationamountsduringaceticacidfermentation；[0047]图27不同接种量的醋醅在醋酸发酵过程中多酚含量的变化figure27variationofpolyphenolcontentofvinegarwithdifferentinoculationamountsduringaceticacidfermentation；[0048]图28不同接种量的醋醅在醋酸发酵过程中黄酮含量的变化figure28changesinflavonoidcontentofvinegarwithdifferentinoculationamountsduringaceticacidfermentation具体实施方式[0049]下面通过实施例详述本发明。[0050]实施例1[0051]1.主要仪器设备[0052][0053][0054]1.1原料桑葚果渣、霜桑叶：贵州台今联合农业科技有限责任公司提供；bv818葡萄酒酵母：购买于安琪酵母股份有限公司，储存于4℃冰箱备用；巴氏醋酸杆菌：贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏；糖：昆明盘龙区上水井食品厂的白糖。[0055]1.2原辅料的预处理[0056](1)霜桑叶：将11月23号采摘的新鲜霜桑叶用水清洗，待自然晾干于60℃的恒温鼓风干燥箱烘干，捏碎约为10目左右，分装于密封袋中，并储存于‑15℃的冷库中，备用。[0057](2)桑葚果渣：将鲜榨桑葚果渣分装于若干个无菌的密封袋中，并立刻储存于‑20℃的冰箱中，备用。[0058]1.3菌种活化[0059](1)酵母活化[0060]实验采用的是bv818活性干酵母，酵母活化的步骤：称取一定量的酵母，加入含糖量为2％(酵母添加量的5倍)的糖水，在37℃温度下水浴活化15～30min。[0061](2)巴氏醋酸杆菌菌种的制备[0062]固态培养：添加葡萄糖1g，碳酸钙2g，琼脂2g，酵母膏1g，蒸馏水100ml置于500ml三角瓶中，在121℃高压灭菌锅灭菌20min，待培养基灭菌后冷却至50～60℃再加入无水乙醇3ml，平板冷却后，将保藏的醋酸菌重新划线，把培养皿置于30℃恒温培养箱培养24～48h。[0063]液体发酵培养：称取葡萄糖1％，酵母膏1％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，加100ml蒸馏水使培养基溶解，将溶解的培养基置于500ml的三角瓶中，用封口膜和报纸将瓶口封住，高压灭菌锅121℃灭菌20min，待培养基灭菌后冷却至50‑60℃再加入无水乙醇3ml。再将活化好的醋酸菌菌种接入液体培养基中，于30℃、150r/min的摇床中培养48h，备用。[0064]1.4工艺流程如下[0065]一种桑葚果渣醋，其制备方法如下：先将桑葚果渣进行调配，在100kg桑葚果渣中同时加入桑葚果汁和糖，糖的添加量为15kg，桑葚果汁添加量为21kg。[0066]调配后加入酵母菌，酵母菌的接种量0.04kg，于28℃温度下进行酒精发酵，发酵过程中加入糖，糖的添加量为15kg，发酵时间为5d，发酵后加入醋酸杆菌，醋酸杆菌的接种量为桑葚果渣总质量的11.91％kg，再加入霜桑叶调节含水量制醋醅，醋醅于32.1℃进行，每隔24h搅拌一次，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，发酵结束，发酵后进行淋醋，加入120ml灭菌后蒸馏水，浸泡8h，反复浸泡三次,再进行过滤，离心4000r/min，20min，灭菌65℃下30min，最终得到成品。[0067]2.各阶段样品检测及筛选[0068]2.1试验方法[0069]2.1.1取样方法[0070](1)酒精发酵阶段的样品：用玻璃棒将酒醪搅拌均匀后，分别均匀称取20g的不同样品置于250ml三角瓶中，加入20ml的蒸馏水，密封浸泡4h，每隔半个小时用旋涡混匀器振荡一次，用滤纸过滤于50ml离心管中，并立刻密封储存于4℃冰箱中，过滤样液进行适当的稀释后测定指标。[0071](2)醋酸发酵阶段的样品：将3个不锈钢盆于高压灭菌锅(121℃，20min)灭菌冷却后，将醋醅倒入铁盆中搅拌均匀，立刻称取20g的不同样品置于500ml三角瓶中，加入180ml的蒸馏水，密封浸泡4h，每隔半个小时用旋涡混匀器振荡一次，用滤纸过滤于50ml离心管中，并立刻密封储存于4℃冰箱中，过滤样液进行适当的稀释后测定指标(xiex,zhengy,liux,etal.antioxidantactivityofchineseshanxiagedvinegaranditscorrelationwithpolyphenolsandflavonoidsduringthebrewingprocess[j].journaloffoodscience,2017.)。[0072]2.1.2酒精度的测定[0073]参考aoacofficialmethod969.12alcoholinwinesbydichromateoxidation的半微量蒸馏法对样品中的酒精度含量进行测定(张丽.高盐稀态酱油发酵过程中添加酵母的研究[d].贵阳:贵州大学,2019.)。[0074]2.1.3还原糖的测定[0075][1]参照(赵凯,许鹏举,谷广烨.3,5‑二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[j].食品科学,2008(08):534‑536.)dns法(3，5‑二硝基水杨酸比色法)测定样品中的还原糖。[0076]2.1.4花青素的测定[0077]参照(giustimm,wrolstadre.characterizationandmeasurementofanthocyaninsbyuv‑visiblespectroscopy[j].currentprotocolsinfoodanalyticalchemistry,2001.)稍作修改；[0078]ph1.0缓冲液的配制：准确称取15gkcl用蒸馏水稀释并定容至1000ml；准确量取17ml浓盐酸用蒸馏水定容至1000ml，将kcl溶液与hcl溶液混合。用kcl溶液调ph(1.0±0.1)。[0079]ph4.5缓冲液的配制：准确称取16.4gch3coona用蒸馏水稀释并定容至1000ml，用hcl溶液调ph(4.5±0.1)。[0080]测定步骤：取1ml样品(酒精发酵阶段的产物)，用蒸馏水定容至10ml。移取1ml样液2份，分别用ph1.0、ph4.5缓冲液定容至10ml，用振荡器摇匀后避光静止2h，以蒸馏水代替样品做空白对照，在510nm和700nm处测定吸光度。[0081]花青素含量的计算如下：[0082][0083]式中：a＝(a510nm‑a700nm)ph1.0‑(a510nm‑a700nm)ph4.5[0084]mw—矢车菊素‑3‑葡萄糖苷分子量，449.2g/mol；[0085]df—稀释倍数；[0086]ε—摩尔消光系数，26900l·mol‑1·cm‑1；[0087]l—光程的厘米数，1cm；[0088]2.1.5多酚的测定[0089]参照(李静,聂继云,王孝娣,等.folin‑ciocalteus法测定葡萄和葡萄酒中的总多酚[j].中国南方果树,2007(06):86‑87.)稍作修改；[0090](1)一水合没食子酸标准溶液：准确称取一水合没食子酸0.110±0.001g，用水溶解到100ml容量瓶中，此溶液一水合没食子酸浓度为1000mg/l；用5ml分度吸管从此标准溶液吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0ml到100ml容量瓶中，用水稀释定容，即分别得到0、10、20、30、40和50μg/ml的一水合没食子酸标准溶液。[0091](2)标准曲线制作[0092]标准曲线的制作：用分度吸管从0、10、20、30、40和50μg/ml的系列一水合没食子酸标准溶液中吸取1.0ml，分别加水5ml、fc显色剂1ml，7.5％碳酸钠溶液3ml，显色，此时分别相当于0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0μg/ml的一水合没食子酸。放置2小时后，在765nm波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，并求得方程式。[0093](3)实验步骤[0094]将样品(醋酸发酵阶段的产物)稀释120倍，然后吸取1.0ml稀释样品溶液，分别加入水5.0ml、fc显色剂1ml和7.5％碳酸钠溶液3ml显色。放置2小时后，在765nm波长下测定样品的吸光度，再根据标准曲线(方程)计算出样品中多酚的浓度。[0095]2.1.6黄酮的测定[0096]参照gb/t19777‑2013《地理标志产品山西老陈醋》附录c规定的方法检测样品的黄酮含量。[0097]2.1.7总酸的测定[0098]参照gb/t5009.41‑2003食醋卫生标准中总酸的测定中酸碱滴定法对样品中的总酸含量进行测定。[0099]2.1.8桑葚果渣醋酒精发酵单因素的筛选[0100](1)酒精发酵周期的确定[0101]将桑葚果渣分为18份，每份200g，在蔗糖添加量为14％，酵母添加量为0.03％，26℃条件下发酵1d、2d、3d、4d、5d、6d，分别测定桑葚果渣酒精发酵过程中含糖量和酒精度的变化，找出最佳发酵时间。[0102](2)发酵温度对酒精发酵过程中酒精的影响[0103]将桑葚果渣分为18份，每份200g，在蔗糖添加量为14％，酵母添加量为0.03％，发酵5d的条件下，试验22℃、24℃、26℃、28℃，30℃，32℃六个培养温度对酒精发酵的影响，探讨酒精发酵的最佳温度。[0104](3)酵母菌接种量对酒精发酵过程中的影响[0105]将桑葚果渣分为18份，每份200g，蔗糖添加量为14％，取酵母添加量为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％六个接种量对酒精发酵的影响，发酵温度为26℃，发酵第5d时测其酒精度，探讨酒精发酵时酵母最佳接种量。[0106](4)蔗糖添加量对酒精发酵过程中的影响[0107]将桑葚果渣分为18份，每份200g，果渣按不同比例调整蔗糖添加量分别为10％、12％、14％、16％、18％、20％六个水平，发酵温度为26℃，酵母接种量为0.03％，发酵第5d时测其酒精度，探讨酒精发酵时最佳蔗糖添加量。[0108]2.2桑葚果渣醋醋酸发酵单因素的筛选[0109]a.含水量对醋酸发酵过程中总酸的影响[0110]制备6份酒精度为7.5％vol的桑葚果渣酒醪，分别接入10％醋酸菌种子液，通过控制霜桑叶的加入量，把醋醅的含水量分别调节为60％、65％、70％、75％、80％、85％，放置在32℃的恒温培养箱中发酵，每隔24h搅拌一次，搅拌均匀后，立刻取样测其酸度，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，醋酸发酵结束，探讨醋醅发酵的最佳水分含量。[0111]b.酒精度对醋酸发酵过程中总酸的影响[0112]将桑葚果渣均匀分成6份，调节好糖度后，使其制得酒醪的酒精度分别5.5％vol、6.5％vol、7.5％vol、8.5％vol、9.5％vol，分别接入10％的醋酸菌种子液，加入适量的霜桑叶使得醋醅的含水量为80％，再将醋醅放置在32℃的恒温培养箱中进行发酵，每隔24h搅拌一次，搅拌均匀后，立刻取样测其酸度，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，醋酸发酵结束，探讨醋醅发酵的最佳酒精度。[0113]糖度的调整：根据1.7g的糖生成1％vol的酒精来补加蔗糖，根据醋酸发酵的不同酒精度要求来调节添加量。[0114]c.发酵温度对醋酸发酵过程中总酸的影响[0115]制备酒精度为7.5％vol的桑葚果渣酒醪，接入10％醋酸菌种子液，再加入适量的霜桑叶使得醋醅的含水量为80％，将制好醋醅分为6份，分别放入28℃、30℃、32℃、34℃、36℃的恒温培养箱中进行发酵，每隔24h搅拌一次，搅拌均匀后，立刻取样测其酸度，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，醋酸发酵结束，探讨醋醅发酵的最佳发酵温度。d.醋酸菌接种量对醋酸发酵过程中总酸的影响[0116]制备6份酒精度为7.5％vol的桑葚果渣酒醪，按接种量8％、10％、12％、14％、16％接入醋酸菌种子液，加入适量的霜桑叶使得醋醅的含水量均为80％，放入32℃的培养箱中，每隔24h搅拌一次，搅拌均匀后，立刻取样测其酸度，待醋醅的总酸不再上升或略微下降时，醋酸发酵结束，探讨醋醅发酵的最佳醋酸菌接种量。[0117]2.3桑葚果渣醋醋酸发酵的响应面优化试验[0118]通过单因素试验的结果，以总酸为考察指标，依据box‑behnken设计方法，选择醋醅的含水量、酒精度、发酵温度和接种量进行四因素三水平响应面实验，确定最佳发酵条件。(见表一)[0119][0120]表一[0121]数据处理与分析[0122]采用excel2010、origin8.6和design‑expert.v8.0.6等软件对试验数据进行处理，每个处理组进行2个平行试验。[0123]3结果与分析[0124]3.1dns标准曲线绘制[0125]配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，并测定其吸光度绘制还原糖含量标准曲线。还原糖含量标准曲线的回归方程为y＝0.4336x‑0.0148，r2＝0.9991，线性关系良好。(见图7)[0126]3.2多酚含量标准曲线绘制[0127]配制不同浓度的一水合没食子酸标准溶液，并测定其吸光度绘制多酚标准曲线。多酚含量标准曲线的回归方程为y＝0.0124x+0.0066，r2＝0.999，线性关系良好。(见图8)[0128]3.3黄酮含量标准曲线绘制[0129]配制不同浓度的无水芦丁标准溶液，并测定其吸光度绘制黄酮标准曲线。黄酮含量标准曲线的回归方程为y＝0.4421x+0.0034，r2＝0.9991，线性关系良好。(见图9)[0130]3.4桑葚果渣醋酒精发酵[0131]3.4发酵时间对桑葚果渣酒精发酵的影响[0132]由图10结果所示，在酒精发酵过程中随着发酵时间的延长，酒精度呈先逐渐升高后平缓的趋势，在第5d时，桑葚果渣酒醪的酒精度含量达到最大值7.71％vol，此时，之后酒精度呈小幅度下降。而还原糖含量随着发酵时间呈先迅速减少后平缓的趋势，在第4d后，桑葚果渣酒醪中的还原糖含量趋于一个恒定值，说明酒精发酵基本结束。在发酵过程中观察可以得知，在发酵第2d时，发酵醪的表面会产生大量的气泡，酒精发酵第4d时，气泡逐渐减少，第5d时发酵醪表面基本上没有气泡。[0133]由图11结果所示，随着发酵时间的延长，花青素含量呈先上升后下降的趋势，在第1d到第2d时，花青素的含量从107.5mg/l上升到115.5mg/l，原因可能是桑葚果渣原料中花青素的溶出。到达第6d时，花青素含量下降至83.14mg/l，在最高值115.5mg/l的基础上下降了28.02％。可能是由于随着发酵时间的延长，花青素含量易受光照、糖度、乙醇等因素影响，从而使其发生了降解(赵红宇等.桑葚果酒全渣发酵过程中生物活性物质及其抗氧化活性变化的研究[j].食品工业科技,2015,36(23):182‑185+189.)。从发酵时间对酒精度和花青素的影响，综合选取发酵时间为5d作为后面酒精发酵试验。[0134]3.6发酵温度对桑葚果渣酒精发酵的影响[0135]从图12可知，随着发酵温度的升高，酒精度呈先上升后下降的趋势。在温度为28℃时，酒精度达到最大值7.88％vol，当温度处于22℃时，其酒精度为7.37％vol，原因可能是酵母生长较为缓慢，酶的活性较低，发酵时间长，在发酵过程中易受杂菌的污染或发酵不完全，从而酒精发酵的酒精度低。而当温度大于28℃时，由于酵母快速生长，导致发酵动力不足，细胞易衰老、自溶(吴庆园.青稞醋发酵工艺及其特性研究[d].重庆：西南大学,2017.)。[0136]从图13可知，在桑葚果渣酒精发酵过程中花青素的含量随着温度的升高呈下降的趋势。在温度28℃、30℃和32℃下，花青素的含量在分别下降至87.34mg/l、85.34mg/l和84.01mg/l。这可能是由于花青素属于热敏性物质，温度升高，分解速度增加，从而使花青素含量降低。从温度对酒精度和花青素的影响，综合选取26℃～28℃的发酵温度作为后面酒精发酵试验。[0137]3.8酵母菌接种量对桑葚果渣酒精发酵的影响[0138]从图14可以看出，随着酵母菌接种量的增加，酒精度呈先上升后略微下降的趋势，且在酵母添加量为0.05％时，酒醪的酒精度到达最高值。当酵母接种量低于0.04％时，桑葚果渣酒醪的酒精度较低，这说明酒精发酵过程中蔗糖没有被完全利用。当接种量高于0.06％时，桑葚果渣酒醪的酒精度稍偏低，接种量过大可能会导致酵母衰老快，酒精发酵能力低。[0139][1]从图15可知，随着酵母接种量的增加，桑葚果渣在酒精发酵过程中花青素的含量呈下降的趋势。酵母接种量为0.04％时，花青素含量为85.32mg/l且与接种量为0.05％和0.06％的花青素含量差异不大。随着接种量的增大，花青素下降的原因可能是酵母使花青素的糖苷形式发生降解产生花青素苷元或发生聚合成为聚合花青素，均会导致水溶性花青素下降。在发酵过程中酵母可以释放次级代谢产物如丙酮酸、乙醛等并与花青素发生反应产生一些大分子衍生物(刘学铭等.桑椹汁乙醇发酵过程中主要成分和功能成分的动态变化[j].食品与发酵工业,2006(12):138‑141.)。因此，从酵母接种量对酒精度和花青素的影响，综合选取0.04～0.05％的接种量作为后面酒精发酵试验。[0140]由图16可知，在酒精发酵过程中，随着蔗糖添加量的增加，桑葚果渣花青素的含量呈下降趋势。酒精发酵结束后，在蔗糖添加量为10％、12％、14％、16％、18％％和20％时对应花青素含量分别为89.64mg/l、89.3mg/l、88.47mg/l、87.47mg/l、86.96mg/l、85.29mg/l，不同蔗糖的添加量对桑葚果渣花青素含量的影响差异不大。因此综合考虑蔗糖的添加量对酒精度和花青素的影响，选取蔗糖添加量为12～16％作为后面酒精发酵试验。[0141]3.12桑葚果渣醋醋酸发酵[0142]含水量对醋酸发酵过程中总酸的影响[0143]由图17可以看出，在14d的醋酸发酵阶段中，不同含水量的醋醅的总酸呈先缓慢上升后下降的趋势。桑葚果渣醋的醋醅含水量为80％时的总酸为最高值，醋醅的总酸从初始值0.605g/100g上升至4.85g/100g。含水量小于80％时，含水量越低，醋醅的总酸越低。醋酸发酵结束后，含水量为60％、65％、70％和75％的醋醅的总酸分别[0144]由初始值升高至1.23g/100g、1.926g/100g、2.987g/100g和4.07g/100g。原因可能是当桑葚果渣醋醋醅含水量过低时，霜桑叶和桑葚果渣内部过于疏松，其溶氧量大，醋酸菌利用大量营养物质自身代谢，从而使醋酸菌老化，导致酒精利用不完全且醋醅的总酸含量低。而醋醅含水量为85％时，其总酸为4.003g/100g，水分含量过大，溶氧量不高，使醋酸菌代谢产物含量低。一些研究表明(朱瑶迪.镇江香醋[0145]固态发酵参数的智能在线监测及其分布研究[d].镇江:江苏大学,2016.)，固态发酵食醋的醋醅含水量在60％～70％左右，而本研究醋醅含水量为80％发酵产酸量较好且积液较少，可能是因为桑葚果渣和霜桑叶的持水率较高，从而使醋醅含水量增大。[0146]由图18可知，从整体上来看，随着发酵时间的延长，不同含水量的醋醅在醋酸发酵过程中多酚含量呈下降的趋势。含水量为60％、65％、70％、80％的醋醅在第11d总酸达到最高时，多酚含量由初始值0.643g/100g、0.645g/100g、0.651g/100g、0.622g/100g分别降低了49.97％、57.17％、55.77％、52.64％；而含水量为75％和85％分别在第10d和第12d总酸最高且多酚含量从初始值0.630g/100g和0.594g/100g分别降低了55.27％、53.15％。由此可知，含水量为60％多酚含量变化幅度最小，含水量为80％次之。由图19可知，从整体上来看，在1～14d的醋酸发酵阶段，不同含水量的醋醅在醋酸发酵过程中黄酮含量呈下降的趋势。在醋酸发酵结束时，含水量为60％、65％、70％、75％、80％、85％的醋醅黄酮含量由初始值0.394g/100g、0.399g/100g、0.396g/100g、0.390g/100g、0.451g/100g、0.490g/100g分别降低了34.48％、45.59％、39.99％、36.84％、45.21％、40.42％。由总酸、多酚和黄酮三个指标综合考虑，后期醋醅含水量选用75％、80％、85％来做优化试验。[0147]由图21和图22可以看出，在整个醋酸发酵过程中，随着发酵时间的延长，醋醅中多酚和黄酮含量呈下降的趋势，在0～6d，二者下降速率较快，在发酵后期速度逐渐平缓。醋酸发酵结束后，醋醅初始酒精度为5.5％vol、6.5％vol、7.5％vol、8.5％vol、9.5％vol的多酚含量由初始值0.607g/100g、0.608g/100g、0.606g/100g、0.602g/100g、0.599g/100g分别降至0.297g/100g、0.287g/100g、0.271g/100g、0.278g/100g和0.310g/100g，醋醅的黄酮含量分别由初始值0.450g/100g、0.444g/100g、0.448g/100g、0.446g/100g、0.449g/100g分别降至0.244g/100g、0.235g/100g、0.230g/100g、0.229g/100g和0.256g/100g。由总酸、多酚和黄酮三个指标综合考虑，后期醋醅初始酒精度选用6.5％vol、7.5％vol和8.5％vol来做优化试验。[0148]3.18发酵温度对醋酸发酵过程中总酸的影响[0149]由图23结果可知，在醋酸发酵过程中，总酸随着发酵温度的升高呈先上升后下降的趋势。醋酸发酵第11d时，温度为32℃的桑葚果渣醋醋醅的总酸到达最高值且其含量为4.84g/100g。醋醅的发酵温度过低时，不利于醋酸菌的生长代谢，使发酵时间延长。温度为28℃时，发酵前期醋醅的产酸速度较慢，乙醇等底物利用率低，在此温度下发酵的果醋产酸较低；发酵温度为36℃时，温度太高会加速醋酸菌的老化使其产酸能力变弱；并且会加速醋醅中己产生的醋酸挥发，使其总酸含量变低。[0150]由图24结果得知，在不同温度条件下，随着发酵时间延长醋醅的多酚含量呈急剧下降后平缓的趋势。温度越高，醋醅中的多酚含量下降得越快。发酵结束后，温度为28℃、30℃、32℃、34℃和36℃的醋醅多酚含量由初始值0.605g/100g、0.606g/100g、0.602g/100g、0.608g/100g、0.612g/100g分别降低了51.65％、53.94％、54.86％、60.64％、66.12％。发酵温度为28℃对多酚含量的影响最小，但发酵时间长，酒精转化率降低。由图25结果得知，温度越高，醋醅中黄酮含量下降速度越快。在0～6d时，黄酮含量下降速率较快，7～14d变化较为平缓。醋酸发酵结束后，温度为28℃、30℃、32℃、34℃和36℃醋醅黄酮含量比初始值0.46g/100g分别降低了46.84％、48.88％、50.36％、54.47％、57.01％，其中，30℃和32℃差异不大。因此，从总酸、多酚、黄酮三个指标综合来考虑，发酵温度为32℃效果较好，因此后期用30℃、32℃和34℃来做响应面优化试验。[0151]3.21醋酸菌接种量对醋酸发酵过程中总酸的影响[0152]由图26得知，在醋酸发酵过程中，随着接种量的增加总酸呈先上升后下降的趋势。可以明显看出，在发酵前期，醋酸菌的接种量接种量越大，产酸速率越大。在醋酸发酵第9d时，接种量为16％的醋醅总酸含量达到4.06g/100g，但由于醋酸菌接种量过大，酒精度被稀释过大，使醋醅中产酸量大大的降低。接种量为8％时，发酵时间太长且产酸的速度慢，在发酵过程中优势菌种没有充分利用发酵底物，导致醋醅的总酸含量不高。在第11d时，接种量为12％的醋醅总酸含量达到最大值为5.01g/100g，接种量为10％次之且总酸含量为4.855g/100g。[0153]由图27可知，在整个醋酸发酵阶段中，醋醅的多酚含量随着发酵时间呈下降的趋势。在第1～8d，多酚含量下降速率较快，后期发酵下降速度较为平缓。接种量为8％、10％、12％、14％、16％的醋醅多酚初始含量分别为0.636g/100g、0.62g/100g、0.612g/100g、0.613g/100g、0.610g/100g；醋酸发酵结束后，接种量为8％、10％、12％、14％、16％的醋醅多酚含量分别降低了55.78％、54.05％、54.15％、55.15％和56.44％。8％醋醅中的多酚含量下降幅度大，由于接种量小，发酵时间较长，多酚受温度等因素使其含量下降幅度大。由图28可知，醋醅中黄酮含量随着发酵时间呈下降的趋势，不同接种量醋醅的黄酮含量之间的差异不大。接种量为8％、10％、12％、14％和16％的醋醅黄酮初始含量分别为0.458g/100g、0.457g/100g、0.438g/100g、0.436g/100g、0.441g/100g，醋酸发酵结束时，接种量为8％、10％、12％、14％、16％的醋醅黄酮含量分别比初始值降低了47.36％、48.87％、48.35％、49.63％、49.77％。因此，从总酸、多酚、黄酮三个指标综合来考虑，接种量为12％发酵效果最好，因此后期用10％、12％和14％来做响应面优化试验。[0154]3.4桑葚果渣醋醋酸发酵响应面试验优化[0155]3.4.1响应面实验结果及方差分析[0156]桑葚果渣醋醋酸发酵响应面试验结果见表3.4，方差分析结果见表3.5。[0157]表3.4响应面设计方案及结果[0158]table3.4designandresultsofresponsesurfaceexperiment[0159][0160][0161]续表3.4[0162][0163]采用design‑expert.v8.0.6软件对数据进行回归分析，得到回归方程的方差分析表，见表3.5，得到二次回归方程：[0164]y＝+5.01‑0.11a+0.17b+0.020c‑0.058d+0.12ab+8.750e‑003ac‑0.065ad+0.039bc+4.500e‑003bd‑0.13cd‑0.42a2‑0.60b2‑0.39c2‑0.63d2[0165]表3.5回归方程的方差分析[0166]table3.5analysisofvarianceofregressionequation[0167][0168][0169]续表3.5[0170][0171]注：*代表0.05显著水平；**代表0.01显著水平[0172]由表3.5回归方程的方差分析可知，该模型p<0.0001，则说明响应面模型极显著；失拟误差p＝0.1556>0.05，则在α＝0.05水平上不显著。决定系数r2＝0.9796，模型的校正决定系数r2adj＝0.9593，说明该数学模型可以很好的用于预测桑葚果渣醋工艺条件的响应值。从响应值的多项回归模型方程来看，因素一次项的a和b对总酸影响极显著(p<0.01)，因素d影响显著(p<0.05)，因素c影响不显著(p>0.05)，且影响桑葚果渣醋醋酸含量的因素大小顺序分别为b>a>d>c，即酒精度>含水量>接种量>发酵温度。模型二次项的4个因素p<0.0001，且对总酸的影响都为极显著(p<0.01)。模型的交互项中cd极显著，ab显著，ac、ad、bc和bd不显著(p>0.05)。[0173]3.4.2响应面分析[0174]响应曲面和等高线图可以直观地看出各因素间的交互作用对桑葚果渣醋总酸的影响，交互作用图和等高线图，如图1‑5所示。图1responsesurfaceandcontourplotsofwatercontentandalcoholcontent(包括图1‑1和图1‑2)显示了含水量与酒精度之间的交互作用，响应曲面的坡度较为陡峭，表明这两个因素对总酸的交互作用较为显著。当醋醅含水量为77％～81％，酒精度7％vol～8％vol时，总酸含量接近最高点，在此范围产酸能力较强。酒精度的轴向等高线图较含水量更为密集，表明酒精度比原料含水量对总酸的影响大。等高线呈椭圆形，表明两因素交互作用较强，影响显著。如图2responsesurfaceandcontourmapofwatercontentandtemperature(包括图2‑1和图2‑2)可以看出，含水量与温度的响应曲面较为陡峭，表明这两个因素对响应值(总酸含量)的交互作用较为显著。由等高线图得知，含水量轴向等高线较发酵温度更为密集，表明原料含水量比发酵温度对总酸的影响大，等高线呈圆形，表明两因素交互作用较弱，影响不显著。[0175]如图3responsesurfaceandcontourmapofwatercontentandinoculationvolume(包括图3‑1和图3‑2)所示，含水量与接种量的响应曲面较为陡峭，表明醋醅的含水量和接种量对总酸的交互作用较为显著。含水量轴向等高线较接种量更为密集，表明醋醅的含水量比接种量对总酸的影响大，等高线呈圆形，表明两因素交互作用较弱，影响不显著。[0176]如图4responsesurfaceandcontourmapsofalcoholandtemperature(包括图4‑1和图4‑2)可知，酒精度和温度的响应曲面较为陡峭，表明这两个因素对总酸的交互作用较为敏感。当酒精度7％vol～8％vol，醋醅含水量为77％～81％时，从等高线可以看出酒精度轴向等高线更加密集，表明酒精度比温度对总酸的影响大，等高线呈圆形，表明两因素交互作用较弱，影响不显著。[0177]如图5responsesurfaceandcontourmapsofalcoholandvaccinationvolume(包括图5‑1和图5‑2)可以得出，酒精度和接种量的响应曲面较为陡峭，表明这两个因素对总酸的交互作用较为显著。与接种量相比，沿酒精度轴向等高线更加密集，表明酒精度比接种量对总酸的影响大，等高线呈圆形，表明两因素交互作用较弱，影响不显著。[0178]如图6(包括图6‑1和图6‑2)可知，温度和接种量的响应曲面较为陡峭，表明温度和接种量两个因素对总酸的交互作用较为显著。当温度为31℃～33℃，接种量为11％～13％时，对醋酸发酵产酸较有利。与温度相比，沿接种量轴向等高线密集度较大，表明接种量比温度对总酸的影响大，等高线呈椭圆形，表明两因素交互作用较强，影响显著。[0179]4验证试验[0180]利用软件design‑expert.v8.0.6优化，分析得到桑葚果渣醋酸发酵的最佳工艺条件为：醋醅的含水量为79.44％，初始酒精度为7.63％vol，发酵温度为32.08℃，醋酸菌的接种量为11.91％。为检验预测结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证实验。但同时考虑到实际操作情况，将最佳发酵工艺条件修正为:醋醅的含水量为79.5％，初始酒精度为7.7％vol，发酵温度为32.1℃，醋酸菌的接种量为12.0％，验证实验得到醋醅中总酸平均值为5.02g/100g，与醋醅总酸预测值5.03g/100g相对误差较小，实验结果的准确性较好，说明响应面法优化桑葚果渣醋醋酸发酵工艺是可行的。[0181]5试验结果表明：综合考虑对酒精度和花青素的影响，发酵时间为5d，酵母接种量为0.04％～0.05％、发酵温度为26℃～28℃对桑葚果渣酒精发酵效果较好，为保证后续醋酸发酵的正常进行，糖的添加量为12～16％作为后面酒精发酵试验。[0182]根据单因素试验和box‑benhnken响应面优化试验，桑葚果渣醋的二次多项式的回归模型为：[0183]y＝+5.01‑0.11a+0.17b+0.020c‑0.058d+0.12ab+8.750e‑003ac‑0.065ad+0.039bc+4.500e‑003bd‑0.13cd‑0.42a2‑0.60b2‑0.39c2‑0.63d2，通过响应面试验的得出桑葚果渣醋的最佳发酵工艺条件为：醋醅的含水量为79.5％，初始酒精度为7.7％vol，发酵温度为32.1℃，醋酸菌的接种量为12.0％，在此条件下，得到醋醅中总酸平均值为5.02g/100g。与醋醅总酸理论值相对误差较小，说明响应面法优化桑葚果渣醋醋酸发酵工艺是可行的。当前第1页12当前第1页12