一种以2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲为配体的钯配合物及其合成方法与流程

本发明涉及钯配合物，具体涉及一种以2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲为配体的钯配合物及其合成方法。

背景技术：

癌症目前依旧是威胁人类生命安全的重要隐患。随着人类生活环境的污染日益加剧，生存环境的不断恶化。人类的致癌因素也越来越多。就全球来说癌症发病率逐年攀升。因此，也激发了很多科研工作者的研究热情。人们对以铂为基础的抗肿瘤药物的兴趣起源于20世纪60年代，rosenberg发现了铂配合物对癌细胞存在抑制作用。尽管经过一系列的研究顺铂成为了治疗癌症的上市药，但它有严重的毒性副作用，其适用范围仅局限于相对较窄的肿瘤。科研工作者不得不致力于新的抗肿瘤药物的研究。钯配合物与铂配合物属于同族元素，具有相似的空间构型性能和物理化学性能。因此，越来越多的科研工作者开始致力于钯配合物的研究。关于钯配合物的相关报道也越来越多。

氨基硫脲是指化合物nh2--nh--cs--nh2,其中的氨基与醛或酮羰基进行缩合成为缩氨基硫脲,有些缩氨基硫脲衍生物对结核、麻风、风湿、疟疾、天花和某些肿瘤有一定的药理活性。因此，很多学者致力于深入研究缩氨基硫脲的配合物以寻求活性更好的抗肿瘤化合物。许多研究数据表明，含有杂环的缩氨基硫脲化合物及其金属配合物会比一般的缩氨基硫脲化合物具有更加广泛的生物活性,因此,在缩氨基硫脲化合物中引入杂环改善其结构,则有望得到生物活性更好的化合物。2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲(apt)化合物因含有杂环,从而得到广泛的研究,是一类具有潜在生物活性的化合物。

随着抗肿瘤药物广泛研究，研究学者发现自由基与肿瘤之间的关系密切，特别是活性氧(ros)。增加细胞内ros水平，可以诱导肿瘤细胞的死亡。当前临床使用的一些药物会诱导细胞产生高水平的活性氧。比如，长春花碱，铂类化合物，蒽环类抗生素等，总之，引发活性氧不平衡的化疗药物能为治疗癌症提供一些思路。因此，我们选用2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲(apt)化合物与金属钯进行配位，得到了五种不同的钯配合物，旨在得到一种新型、高效、低毒的抗肿瘤配合物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲为配体的钯配合物及其合成方法和应用，该钯配合物对h460细胞具有较好的抗肿瘤活性，该方法操作简单，便于实施。

实现本发明目的的技术方案是：

一种以2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲为配体的钯配合物，其结构式如下式c1-c5所示：

上述式c1-c5所示钯配合物的合成路线为：

本发明以2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲为配体的钯配合物的合成方法，包括以下步骤：

(1)将氨基硫脲溶于甲醇，再加入2-乙酰基吡啶，滴加醋酸，混合均匀；于65℃回流反应，反应后过滤，滤液室温挥发，有晶体析出，再过滤，用无水乙醇洗涤，得到配体；

或者在回流反应后，过滤，滤液减压浓缩，乙酸乙酯萃取，依次用饱和碳酸氢钠，水洗涤，硅胶柱层析分离得到配体；

(2)取步骤(1)配体溶于甲醇中，65℃回流反应，再加入pdcl2常温搅拌后过滤，将沉淀晾干，用ch2cl2溶解后，装入试管体积的1/5，再沿试管壁缓慢加入试管体积3/5的正己烷，盖上橡皮塞封口，室温静置10天后，于试管中部得到钯配合物。

步骤(1)所述氨基硫脲还包括4-甲基氨基硫脲、4,4-二甲基氨基硫脲、3-吡咯氨基硫脲、4-苯基氨基硫脲；

氨基硫脲与2-乙酰基吡啶的摩尔比为1:1；

硅胶柱层析分离，洗脱剂体积比为石油醚:乙酸乙酯＝10:1；

所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。

进一步，所述步骤(2)是：取步骤(1)配体、pdcl2溶于ch3oh和ch2cl2的混合溶液中，真空密封，于65℃鼓风干燥箱中静置72h，之后取出置于室温下缓慢降温，过滤，滤液中补加甲醇，将滤液置于通风橱中，缓慢挥发至橙红色晶体析出，即钯配合物。

进一步，所述步骤(2)是：取步骤(1)配体溶于甲醇中，65℃回流反应，再加入pdcl2常温搅拌反应，反应后过滤，将沉淀晾干，用ch2cl2溶解后，装入试管体积的1/5，再沿试管壁缓慢加入试管体积3/5的正己烷，塑料薄膜封口，用针戳3-5个小孔，最后置于装有10ml乙醚的大试管中盖上橡皮塞封口，室温静置10天后，于试管中部得到钯配合物。

进一步，所述步骤(2)是：步骤(1)的配体、pdcl2溶于甲醇，真空密封，65℃鼓风干燥箱中静置72h，得到钯配合物。

进一步，所述步骤(2)是：取步骤(1)配体溶于甲醇中，65℃回流反应，加入pdcl2常温搅拌反应，反应后过滤，将滤液平均分成三份，滤液中分别按2:1的体积比补加甲醇和乙腈，室温挥发，得到钯配合物。

步骤(2)所述配体与pdcl2的摩尔比为1:1；

所述ch3oh和ch2cl2体积比为1:1；

所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。

本发明选择2-乙酰基吡啶与氨基硫脲进行缩合反应，得到配体。含有氮杂环的缩氨基硫脲及其金属配合物比一般的缩氨基硫脲配合物具有更强抗肿瘤活性。所以在缩氨基硫脲化合物中引入氮杂环，改变其结构能使其具有更强的活性。本发明利用含氮杂环的2-乙酰基吡啶配体与金属钯进行配位，能更有效的增强缩氨基硫脲钯配合物的活性。

本发明进一步对合成钯配合物进行了体外增殖抑制活性实验，结果表明，合成的钯配合物比其配体的体外活性普遍较好，表现出很好的抑制活性，并且对人正常细胞毒性作用不大，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为实施例1合成的c1钯配合物的单晶结构图；

图2为实施例2合成的c2钯配合物的单晶结构图；

图3为实施例3合成的c3钯配合物的单晶结构图；

图4为实施例4合成的c4钯配合物的单晶结构图；

图5为实施例5合成的c5钯配合物的单晶结构图。

图6为使用流式细胞术通过探针h2dcfda研究不同浓度的c2作用h460细胞24h后ros的产生水平图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明内容作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

c1钯配合物的合成，具体合成方法为：

(1)将4-甲基氨基硫脲3mmol溶于25ml甲醇，再加入2-乙酰基吡啶3mmol，滴加1ml醋酸，混合均匀；于65℃回流反应8h，反应后过滤，滤液置于室温挥发，有白色晶体析出；过滤，无水乙醇洗涤三次，得到配体l1(产率；89.12％，白色晶体)；

yield:89.12％,c9h12n4s:c,51.90；h,5.81；n,26.90；s,15.39.found:c,51.91；h,5.83；n,26.89；s,15.36.ir,cm-1:3450(s,amide),3213(s,nh),3043(m,aromatichydrogen),1579(m),1494(s),1474(s,aromatic),1364(m,c＝n),1286(s,thioamide),1148(s),1073(s),905(m,c-h),741(m,c＝s),570(m)；

(2)取步骤(1)得到的配体l1(0.1mmol)溶于15ml甲醇，65℃回流反应4h，加入pdcl2(0.1mmol)常温搅拌4h后过滤，将沉淀晾干，用ch2cl2溶解后，装入试管体积的1/5，再沿试管壁缓慢加入试管体积3/5的正己烷，盖上橡皮塞封口，室温静置10天后，于试管中部得到钯配合物c1(产率；70.10％，橙红色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(ccdc数据库)申请号：no.2019140；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用olex2软件解析钯配合物c1晶体结构，如图1所示；

c9h11clpdn4s：c,30.96；h,3.18；cl,10.15；n,16.05；pd,30.48；s,9.18；found：c,30.94；h,3.15；cl,10.17；n,16.03；pd,30.44；s,9.20；ir,cm-1:3433(s,amide),3294(s,nh),2977(m,aromatichydrogen),1638(m),1562(s),1524(s,aromatic),1463(m,c＝n),1405(s,thioamide),1257(s),1190(s),880(m,c-h),735(m,c＝s),572(m)。

实施例2：

c2钯配合物的合成，具体合成方法为：

(1)将4,4-二甲基氨基硫脲3mmol溶于25ml甲醇，再加入2-乙酰基吡啶3mmol，滴加1ml醋酸，混合均匀；于65℃回流反应8h，反应后过滤，滤液减压浓缩，乙酸乙酯萃取，依次用饱和碳酸氢钠，水洗涤，硅胶柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯体积比＝10:1)得配体l2(89.31％，淡黄色固体)；

yield:89.31％,c10h14n4s:c,54.03；h,6.35；n,25.20；s,14.42.found:c,54.02；h,6.34；n,25.22；s,14.41.ir,cm-1:3424(s,amide),3222(s,nh),3094(m,aromatichydrogen),1580(m),1497(s),1461(s,aromatic),1378(m,c＝n),1285(s,thioamide),1146(s),1093(s),889(m,c-h),736(m,c＝s),586(m)；

(2)取步骤(1)得到的配体l2(0.1mmol)、pdcl2(0.1mmol)溶于ch3oh和ch2cl2(5ml,1:1)的反应釜中，真空密封，65℃鼓风干燥箱中静置72h，之后取出置于室温下缓慢降温，过滤，滤液中补加甲醇8ml，将滤液置于通风橱中，缓慢挥发至橙红色晶体析出，即钯配合物c2(65.13％，橙红色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(ccdc数据库)申请号：no.2019142；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用olex2软件解析钯配合物c2晶体结构，如图2所示；

c10h13clpdn4s：c,33.07；h,3.61；cl,9.76；n,15.43；pd,29.30；s,8.83；found：c,33.09；h,3.65；cl,9.72；n,15.40；pd,29.33；s,8.82；ir,cm-1:3434(s,amide),3047(s,nh),2929(m,aromatichydrogen),1638(m),1557(s),1473(s,aromatic),1404(m,c＝n),1373(s,thioamide),1265(s),1166(s),911(m,c-h),731(m,c＝s),614(m)。

实施例3：

c3钯配合物的合成，具体合成方法为：

(1)将3-吡咯氨基硫脲3mmol溶于20ml甲醇，再加入2-乙酰基吡啶3mmol，滴加0.8ml醋酸，混合均匀；于65℃回流反应8h，过滤，将滤液置于通风橱中，缓慢挥发至淡黄色晶体析出；用无水乙醇洗涤三次，得配体l3(产率；88.54％，淡黄色晶体)；

yield:88.54％,c12h16n4s:c,58.04；h,6.49；n,22.56；s,12.91.found:c,58.08；h,6.47；n,22.54；s,12.89.ir,cm-1:3434(s,amide),3046(s,nh),2971(m,aromatichydrogen),1584(m),1534(s),1416(s,aromatic),1338(m,c＝n),1288(s,thioamide),1163(s),1047(s),899(m,c-h),720(m,c＝s),600(m)；

(2)取步骤(1)得到的配体l3(0.1mmol)溶于15ml甲醇，65℃回流反应4h，加入pdcl2(0.1mmol)常温搅拌4h后过滤，将沉淀晾干，用ch2cl2溶解后，装入试管体积的1/5，再沿试管壁缓慢加入试管体积3/5的正己烷，塑料薄膜封口(用针戳3-5个小孔)，最后置于装有10ml乙醚的大试管中盖上橡皮塞封口。室温静置10天后，于试管中部得到钯配合物c3(68.14％，红色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(ccdc数据库)申请号：no.2019143；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用olex2软件解析钯配合物c3晶体结构，如图3所示；

c12h15clpdn4s：c,37.03；h,3.88；cl,9.11；n,14.39；pd,27.34；s,8.24；found：c,37.05；h,3.90；cl,9.10；n,14.41；pd,27.32；s,8.23；ir,cm-1:3448(s,amide),3065(s,nh),2946(m,aromatichydrogen),1639(m),1593(s),1438(s,aromatic),1383(m,c＝n),1337(s,thioamide),1247(s),1176(s),905(m,c-h),738(m,c＝s),573(m)。

实施例4：

c4钯配合物的合成，具体合成方法为：

(1)将4-苯基氨基硫脲3mmol溶于25ml甲醇，再加入2-乙酰基吡啶3mmol，滴加1ml醋酸，混合均匀；于65℃回流反应6h，反应后过滤，滤液减压浓缩，乙酸乙酯萃取，依次用饱和碳酸氢钠，水洗涤，硅胶柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯体积比＝10:1)得配体l4(产率；85.33％，淡黄色固体)；

yield:85.33％,c14h14n4s:c,62.20；h,5.22；n,20.72；s,11.86.found:c,62.21；h,5.23；n,20.71；s,11.88.ir,cm-1:3450(s,amide),3243(s,nh),3043(m,aromatichydrogen),1579(m),1497(s),1467(s,aromatic),1364(m,c＝n),1286(s,thioamide),1148(s),1073(s),905(m,c-h),741(m,c＝s),570(m)；

(2)取步骤(1)得到的配体l4(0.1mmol)、pdcl2(0.1mmol)溶于ch3oh(2ml)一端密封的玻璃管中，真空密封，65℃鼓风干燥箱中静置72h，得到钯配合物c4(65.32％，红色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(ccdc数据库)申请号：no.2019144；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用olex2软件解析钯配合物c4晶体结构，如图4所示；

c14h13clpdn4s：c,40.89；h,3.19；cl,8.62；n,13.62；pd,25.88；s,7.80；found：c,40.88；h,3.20；cl,8.61；n,13.60；pd,25.90；s,7.81；ir,cm-1:3451(s,amide),3061(s,nh),3009(m,aromatichydrogen),1596(m),1539(s),1457(s,aromatic),1434(m,c＝n),1378(s,thioamide),1251(s),1153(s),895(m,c-h),749(m,c＝s),579(m)。

实施例5：

c5钯配合物的合成，具体合成方法为：

(1)将氨基硫脲3mmol溶于25ml甲醇，再加入2-乙酰基吡啶3mmol，滴加1ml醋酸，混合均匀；于65℃回流反应8h，反应后过滤，滤液减压浓缩，乙酸乙酯萃取，依次用饱和碳酸氢钠，水洗涤，硅胶柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯体积比＝10:1)得配体l5(89.31％，淡黄色固体)；

yield:90.12％,c8h10n4s:c,49.46；h,5.19；n,28.84；s,16.51.found:c,49.43；h,5.18；n,28.81；s,16.49.ir,cm-1:3421(s,amide),3175(s,nh),3135(m,aromatichydrogen),1605(m),1500(s),1466(s,aromatic),1367(m,c＝n),1315(s,thioamide),1150(s),1150(s),897(m,c-h),742(m,c＝s),582(m)；

(2)取步骤(1)得到的配体l5(0.1mmol)溶于15ml甲醇，65℃回流反应4h，加入pdcl2(0.1mmol)常温搅拌4h后过滤，将滤液平均分成三份后，滤液中分别补加甲醇和乙醇(体积比ch3oh:ch3cn＝4ml:2ml)，室温挥发3天，得到钯配合物c5(70.01％，红色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(ccdc数据库)申请号：no.2019139；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用olex2软件解析钯配合物c5晶体结构，如图5所示；

c8h9clpdn4s：c,28.67；h,2.71；cl,10.58；n,16.72；pd,31.76；s,9.57found：c,28.64；h,2.72；cl,10.59；n,16.73；pd,31.75；s,9.58；ir,cm-1:3413(s,amide),3310(s,nh),3187(m,aromatichydrogen),1598(m),1557(s),1501(s,aromatic),1439(m,c＝n),1369(s,thioamide),1265(s),1175(s),1001(m,c-h),736(m,c＝s),580(m)。

为说明本发明以2-乙酰基吡啶氨基硫脲为配体的钯配合物，申请人对该钯配合物进行了体外增殖抑制活性实验：

1、细胞株与细胞培养

本实验选用了人肺癌细胞株(h460)，人正常肝细胞(hl-7702)进行了活性探究。

所有细胞株均培养在含10％小牛血清、100u/ml链霉素的dmem培养液内，置37℃含体积浓度5％co2孵箱中培养。

2、待测化合物的配制

所用的受试药物的纯度≥95％，将其dmso储液用生理缓冲液稀释后配置成5mmol/l的终溶液，其中助溶剂dmso的浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长得抑制程度。

3、细胞生长抑制实验(mtt法)

(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配置成浓度为5000个/ml的细胞悬液，以每孔180μl接种于96孔培养板中，使待测细胞浓度至每孔1000～10000/孔(边缘孔用无菌pbs填充)；

(2)5％co2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物20μl，每个浓度梯度设5个复孔；

(3)5％co2，37℃孵育48h，至倒置显微镜下观察；

(4)每孔加入10μl的mtt溶液(5mg/mlpbs，即0.5％mtt)，继续培养4h-6h；

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μl的dmso充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；

(6)根据测得的光密度值(od值)，来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强。利用公式：

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(1-实验组平均od值)/(对照组平均od值)]×％；

ic50测定：利用以上方法，每种化合物须设置浓度梯度，其中含多个(一般5～8个)浓度，每个浓度也须设置3～5个副孔，实验得到每个不同浓度的抑制率，然后在spss软件中计算化合物的ic50值。

表1：配体l1以及配合物c1-c5对不同细胞株的ic50值(μm)，数值越低表明抑制活性越好。

本实验的结果表明，对上述所测试的人肺癌细胞，合成的系列2-乙酰基吡啶缩氨基硫脲钯配合物比其配体对其体外活性普遍较好，表现出很好的抑制活性，并且对人正常细胞毒性作用不大，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

活性氧ros检测试剂盒是一种利用荧光染料dcfh-da进行活性氧检测的试剂盒。本实验应用流式细胞术检测dcf的荧光变化就可以知道细胞内活性氧水平的变化。具体步骤如下：

(1)消化较好的h460细胞，将2ml细胞悬浮液(2x105个)接种于六孔板中，待细胞长到70％-80％，加一定浓度的c2，并设置空白对照组；

(2)作用24h后，收集细胞置于15ml离心管中，离心后用pbs洗涤1-2次；

(3)每个样品加入500μl用无血清培养基将h2dcf-da稀释1000倍的稀释液，然后在37℃避光孵育30分钟；

(4)用无血清培养基洗涤1-2次，离心，弃上清；

(5)每个样品加入500μl无血清培养基悬浮细胞，过膜，使用流式细胞术检测

我们使用流式细胞术通过探针h2dcfda研究不同浓度的c2作用h460细胞24h后ros的产生水平。从图6中可以看出，与对照组相比，c2(6μm和12μm)均能增加细胞内ros水平，而且c2浓度为12μm比6μm产生的ros更为突出。