一种酶催化制备淫羊藿次甙II的方法与流程

本发明涉及一种酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法，属于生物化工用于制备医药中间体领域。

背景技术：

淫羊藿是小檗科淫羊藿属多年生草本植物的地上部分，其茎叶干燥后可作为商品药材。淫羊藿的种类主要有心叶淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿和柔毛淫羊藿等五大类，生于林下、灌木丛下或阴湿的山沟，分布于河南、山西、安徽、湖南、广西、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省(自治区)。各种淫羊藿的药效成分主要是黄酮，含量约1.01％～8.81％。目前已分离出50多种黄酮，研究发现具有活性的8种异戊烯基黄酮醇及其苷类在淫羊藿属植物中普遍存在，可以说是该属的特征性成分。

淫羊藿甙是淫羊藿提取物中重要的具有异戊烯基糖苷结构的黄酮类活性药效成分。具有补阳肾，强盘骨，祛风湿，用于阳痿遗精，盘骨痿软，风湿痹痛麻木拘挛，更年期高血压症。能够有效抑制葡萄球菌，抗衰老。能够有效改善心脏血管系统，调整内分泌。另外，特别值得关注的是它还具有抗癌作用，被喻为最有潜力的抗癌药物。

淫羊藿甙(式i)的化学结构特征是异戊烯基上带有一个葡萄糖基、一个鼠李糖基和一个甲基，其异戊烯基上带的葡萄糖基被水解掉之后的转化产物为淫羊藿次甙ⅱ(式ii)；其异戊烯基上带的葡萄糖基和鼠李糖基都被水解掉之后的转化产物为淫羊藿素(式iii)。随着国内外对淫羊藿甙药效的关注，深入地开展了对其药理活性的研究，发现淫羊藿甙在体内被吸收之前会在肠道内代谢转化为淫羊藿次甙ⅱ和淫羊藿素，而且发现直接使用淫羊藿甙的水解产物淫羊藿次甙ⅱ和淫羊藿素在很多药理活性方面都较淫羊藿甙更加的突出，并且具有更小的毒副作用。然而淫羊藿次甙ⅱ和淫羊藿素这两种天然活性成分在大自然中含量极低，如果通过植物提取来获得高纯度的淫羊藿次甙ⅱ和淫羊藿素是极其困难的，势必会付出极其高昂的生产成本。

目前淫羊藿次甙ⅱ的制备主要是通过对淫羊藿甙的降解来实现，而淫羊藿素可以通过淫羊藿次甙ⅱ的降解来制备。然而该方法存在的一下缺点：1，酸水解淫羊藿甙时，鼠李糖苷键断裂的速度是葡萄糖苷键的500倍，因此酸水解淫羊藿甙的产物中淫羊藿次甙ⅱ的转化率非常低，所以高纯度的淫羊藿次甙ⅱ很难通过这种方式高效率地大规模制备；2，淫羊藿甙直接酸水解制备淫羊藿素的时间很长，一般要超过72h，用不同的酸水解，转化率也各不相同，使用单一的酸水解转化率只能达到30％左右，混合酸水解最高也只能达到70％左右，并且在生产上污染较大，同时产物复杂，分离纯化难度较高。酶催化反应在有机化学中是一种必需工具，酶专一性使许多反应可通过一步反应合成其它手段需要多步合成的化合物。另外，酶催化反应的一些特点低温、高选择性和副产物少等为其在药物合成工业化生产中发挥重要作用。因此，本发明提供一种一种酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有淫羊藿次甙ⅱ在大自然中含量极低，直接通过植物提取来获得高纯度的淫羊藿次甙ⅱ势必会付出极其高昂的生产成本，而传统酸水解淫羊藿甙制备淫羊藿次甙ⅱ的转化率非常低、水解时间长、生产上污染较大、同时产物复杂、分离纯化难度较高等缺陷，提供一种可高效制备淫羊藿次甙ⅱ的酶催化方法，解决现阶段淫羊藿次甙ⅱ产量低、价格高的问题。具体为，将淫羊藿甙原料用甲醇处理，去除其中的可溶性鞣质、多糖和萜类等成分；然后在乙醇溶液中以反式糖苷水解酶作为催化剂酶进行酶催化反应使淫羊藿甙转变为淫羊藿次甙ⅱ，最后通过重结晶得到淫羊藿次甙ⅱ纯品。

本发明解决上述问题采用的技术方案，酶催化制备淫羊藿次甙ii方法的步骤以下：

(1)淫羊藿甙酶催化底物：将从中药材淫羊藿中提取而来的淫羊藿甙粗产物加入甲醇中，加热至65～100℃，在200～750r/min的搅拌速率下回流搅拌4～10h，然后将产物冷却至50℃以下，过滤收集滤饼，将其在50～80℃下干燥得到淫羊藿甙酶催化底物；其中淫羊藿甙与甲醇的质量比为1：2～5；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物加入到20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在5.5～6.5之间，加热至50～80℃，在200～750r/min的搅拌速率下搅拌10～30min；同时，将反式糖苷水解酶溶解在纯水中，之后以1.0～5.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200～750r/min的搅拌速率下搅拌10～60min；然后停止搅拌，在50～80℃下静止反应8-20h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在50～80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；其中反式糖苷水解酶：纯水：淫羊藿甙酶催化底物：20％乙醇水溶液的质量比为1：5～20：10～40：300～800；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3～5遍，得到99％以上含量的淫羊藿次甙ⅱ纯品。

所述的酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法，其特征在于：其反式糖苷水解酶的基因序列为seqidno.1所示基因序列，或其基因序列与seqidno.1所示的基因序列具备95％以上的同源性且能水解淫羊藿甙成淫羊藿次甙ⅱ的水解酶的基因序列。

所述的酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法，其反式糖苷水解酶的氨基酸序列具备98％以上的同源性且能水解淫羊藿甙成淫羊藿次甙ⅱ的水解酶。

所述的酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法，其反式糖苷水解酶的细胞选自基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。

所述的一种酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法，该酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法所制备得到的淫羊藿次甙ii含量≥99％，底物转化率≥99％，综合产率≥95％。

本发明的有益效果：该方法可以特异性地水解掉淫羊藿甙上的葡萄糖基，使淫羊藿甙转化成淫羊藿次甙ⅱ。产物单一，综合转化率达到95％以上，只需要通过简单的重结晶就可以得到99％以上高纯度的产品，生产操作简单，设备要求低，生产过程中的溶剂可以循环利用，绿色环保，可大规模进行生产。本发明方法对原料的要求比较宽泛，不需要用到高纯度的淫羊藿甙原料就可以高效地生产出高纯度的淫羊藿次甙ⅱ，较大幅度地降低了生产成本。本发明过程中使用酸的量相比传统方法大大减少，并且水解母液还可进行多轮的循环利用，极大地减轻了对环保的压力。

附图说明

图1是本发明中淫羊藿次甙ⅱ的制备流程图

具体实施方式

以下介绍本发明制备方法的实施例，但以下实施例是用于说明本发明的示例，并不构成对本发明权利要求的任何限定。

实施例1

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：将从中药材淫羊藿中提取而来的淫羊藿甙粗产物20kg加入65kg甲醇中，加热至75℃，在200r/min的搅拌速率下回流搅拌4h，然后将产物冷却至40℃以下，过滤收集滤饼，将其在50℃下干燥得到淫羊藿甙酶催化底物；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物20kg加入到380kg20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在6.5，加热至50℃，在750r/min的搅拌速率下搅拌10min；同时，将1kg反式糖苷水解酶溶解在10kg纯水中，之后以1.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200r/min的搅拌速率下搅拌60min；然后停止搅拌，在50℃下静止反应20h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.3％。

实施例2

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：将从中药材淫羊藿中提取而来的淫羊藿甙粗产物15kg加入65kg甲醇中，加热至75℃，在200r/min的搅拌速率下回流搅拌4h，然后将产物冷却至40℃以下，过滤收集滤饼，将其在50℃下干燥得到淫羊藿甙酶催化底物；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：此步骤与实施例中相应步骤一致；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.8％。

实施例3

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：将从中药材淫羊藿中提取而来的淫羊藿甙粗产物30kg加入65kg甲醇中，加热至75℃，在200r/min的搅拌速率下回流搅拌4h，然后将产物冷却至40℃以下，过滤收集滤饼，将其在50℃下干燥得到淫羊藿甙酶催化底物；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：此步骤与实施例中相应步骤一致；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.1％。

实施例4

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物10kg加入到380kg20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在6.5，加热至50℃，在750r/min的搅拌速率下搅拌10min；同时，将1kg反式糖苷水解酶溶解在10kg纯水中，之后以1.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200r/min的搅拌速率下搅拌60min；然后停止搅拌，在50℃下静止反应20h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.8％。

实施例5

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物30kg加入到380kg20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在6.5，加热至50℃，在750r/min的搅拌速率下搅拌10min；同时，将1kg反式糖苷水解酶溶解在10kg纯水中，之后以1.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200r/min的搅拌速率下搅拌60min；然后停止搅拌，在50℃下静止反应20h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.2％。

实施例6

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物20kg加入到380kg20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在6.0，加热至50℃，在750r/min的搅拌速率下搅拌10min；同时，将1kg反式糖苷水解酶溶解在10kg纯水中，之后以1.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200r/min的搅拌速率下搅拌60min；然后停止搅拌，在50℃下静止反应20h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.7％。

实施例7

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物20kg加入到380kg20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在6.0，加热至50℃，在750r/min的搅拌速率下搅拌10min；同时，将2kg反式糖苷水解酶溶解在10kg纯水中，之后以1.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200r/min的搅拌速率下搅拌60min；然后停止搅拌，在50℃下静止反应20h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.9％。

实施例8

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：将步骤(1)得到的淫羊藿甙酶催化底物20kg加入到380kg20％的乙醇中，用盐酸控制体系的ph在6.0，加热至50℃，在750r/min的搅拌速率下搅拌10min；同时，将1kg反式糖苷水解酶溶解在10kg纯水中，之后以1.0kg/min的速率加入淫羊藿甙酶催化底物体系中，在200r/min的搅拌速率下搅拌60min；然后停止搅拌，在50℃下静止反应10h；最后将反应产物过滤并收集滤饼，将其在80℃下干燥得到淫羊藿次甙ⅱ粗产品；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶3遍，得到99.0％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.1％。

实施例9

制备淫羊藿次甙ⅱ的示意图如附图1所示。

(1)淫羊藿甙酶催化底物：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(2)淫羊藿甙酶催化水解：此步骤与实施例1中相应步骤一致；

(3)淫羊藿次甙ⅱ的提纯：将步骤(2)制备得到的淫羊藿次甙ⅱ粗产品乙酸乙酯进行重结晶5遍，得到99.5％的淫羊藿次甙ⅱ纯品，底物转化率为99.3％。

序列表

<110>北京岳达生物科技有限公司

<120>一种酶催化制备淫羊藿次甙ii的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1433

<212>dna

<213>肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)

<400>1

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