一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞的制作方法

文档序号：23383179发布日期：2020-12-22 13:47阅读：186来源：国知局

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞。

背景技术：

随着全球环境因素的不断恶化，无论发达国家或发展中国家，恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势，恶性肿瘤已成为人类生命健康的最大危害。2020年，中国每年约有550万新发癌症病例，其中死亡人数达400万。

嵌合抗原受体免疫细胞是一种杀伤肿瘤的新型精准靶向免疫细胞，近几年通过优化改良在肿瘤杀伤上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效的方式。嵌合抗原受体免疫细胞包括car-t、car-nk、car-b以及car-mp(car-macrophage，car-巨噬细胞)，是一种以嵌合型抗原受体(chimericantigenreceptor,car)为基础的免疫细胞。通过体外基因转移技术，将编码特异的嵌合抗原受体的基因序列转导入免疫细胞，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性t细胞。

目前car-t细胞对治疗血液肿瘤效果显著，如针对急性b淋巴母细胞白血病和针对难治性/复发性非何杰金氏淋巴瘤的yescarta已在美国上市。但免疫细胞如car-t细胞对实体瘤的杀伤效果，远不如血液肿瘤。可能与实体瘤的肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)影响car-t细胞外结构稳定性和完整性有关，如局部富集活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)降解car的spacer，破坏car-t与肿瘤细胞表面的抗原结合，从而使car-t失去对肿瘤细胞的攻击作用。而低氧(hypoxia)是实体瘤微环境的主要特征，导致产生局部ros富集，促进肿瘤细胞生长。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞，通过提高嵌合型抗原受体和免疫细胞的抗氧化性，提高稳定性。

本发明公开了一种抗氧化嵌合型抗原受体，包括胞外区，所述胞外区包括间隔区，所述间隔区的核心铰链区氨基酸序列为corehinge-y1：cdktytcppcp(seqidno：3)或corehinge-y2：cdktstcppcp(seqidno：4)。

优选的，本发明的嵌合型抗原受体还包括跨膜区和胞内区，所述胞外区还包括单链抗体，所述间隔区两端连接所述跨膜区和单链抗体，所述跨膜区与所述胞内区连接，所述间隔区为免疫球蛋白g的常链片段。

优选的，所述间隔区的基因序列为igghch3-y1cdna(seqidno：6)或igghch3-y2cdna(seqidno：7)。

本发明还提供一种表达上述嵌合型抗原受体的免疫细胞。

优选的，所述免疫细胞包括car-t细胞、car-nk细胞、car-b细胞或car-mp细胞。

优选的，所述免疫细胞应用于杀伤肿瘤细胞。

优选的，所述免疫细胞应用于杀伤实体瘤细胞或血液肿瘤细胞。

优选的，所述免疫细胞的制备方法包括：

合成嵌合型抗原受体的cdna；

用所述cdna制备慢病毒质粒；

通过慢病毒质粒制备慢病毒颗粒；

获取单个核细胞，并进行预培养；

将慢病毒颗粒转染到预培养后的单个核细胞中，经过培养，获取免疫细胞。

优选的，所述慢病毒颗粒的制备方法包括：

使用含10％胎牛血清的dmem培养液培养6x10⁶个hek293t细胞；

第二天细胞达到聚合度80％左右时，换无10％fbs以及无抗生素的培养液后，稳定2-3小时；

将所述car的cdna克隆到pccl/mndu3-x穿梭质粒获得含car序列的慢病毒质粒：pccl-car质粒，分别取终浓度为6.9μg/ml的pccl-car质粒、3.4μg/ml的pmdlg-prre质粒、2μg/ml的pmd2.g质粒、1.71μg/ml的prsv-rev质粒加入到培养液中，混匀得到质粒培养液；

取35μg浓度为1μg/μl的聚乙烯亚胺加入1毫升dmem培养液中，混匀得到聚乙烯亚胺培养液；

将聚乙烯亚胺培养加入到质料培养中，混匀后，室温静置20分钟，获得第一转染液；

将所述第一转染液加入到稳定后的hek293t细胞中，进行转染；

转染4小时后，培养液更换为含10％胎牛血清的dmem培养液；

继续培养48小时后，收集细胞培养液，0.22μm的滤膜过滤；

滤出液经26000rpm、4℃离心2小时，取沉淀；

用xvivo15全培养液重悬所述沉淀，获得慢病毒颗粒。

优选的，获取免疫细胞的方法包括：

取50ml外周血，ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单个核细胞；

所述单个核细胞以2x10⁶/ml的细胞密度，在x-vivo15全培养液、37℃、5％co2培养2小时，收集悬浮细胞；

悬浮细胞以1.2x10⁶/ml的细胞密度接种到培养瓶内，以细胞比磁珠为1:3的比例加入cd3/cd28磁珠，并加入终浓度100u/ml的白介素2培养过夜；

加入所述慢病毒颗粒进行转染；

细胞转染后继续培养5天，通过磁力架去除磁珠，获得免疫细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

通过在嵌合型抗原受体在核心铰链区的极性带正电的组氨酸，替换为中性不带电的丝氨酸或者酪氨酸，获得抗氧化嵌合型抗原受体；经数据证实，本发明的嵌合型抗原受体和免疫细胞具有抗氧化性、较强的肿瘤细胞杀伤作用或抗肿瘤作用。

附图说明

图1是本发明的嵌合抗原受体构成示意图；

图2是嵌合抗原受体的组成示意图；

图3是免疫细胞的制备方法流程图；

图4是慢病毒颗粒的制备方法流程图；

图5是获取免疫细胞的方法流程图；

图6是实施例一抗氧化性测试结果图；

图7是实施例二抗氧化性测试结果图

图8是实施例一肿瘤杀伤测试后活细胞检测结果图；

图9是实施例二肿瘤杀伤测试后活细胞检测结果图；

图10是实施例一的tnfα检测结果图；

图11是实施例一的ifnγ检测结果图；

图12是实施例二的tnfα检测结果图；

图13是实施例二的ifnγ检测结果图；

图14是肿瘤模型测试结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：

一种抗氧化嵌合型抗原受体，如图1所示，包括胞外区，所述胞外区包括间隔区(spacer)，所述间隔区的核心铰链区氨基酸序列为cdktytcppcp(seqidno：3)或cdktstcppcp(seqidno：4)。

使用符合抗体结构特征的抗体分子igg的hch3片断作为spacer,由于实体瘤微环境ros的富集，特别是ros的主要代表分子h2o2，可能降解spacer中igghch3的核心铰链区(corehinge,seqidno：1)导致car-t胞外区car结构丢失，使得car-t细胞失去抗肿瘤功能。

现有的核心铰链区氨基酸序列为corehinger：cdkthtcppcp(seqidno：1),含有极性带负电的天冬氨酸(d)，带正电的赖氨酸(k)和组氨酸(h)。这些带电氨基酸，尤其是与带负电的天冬氨酸(d)和带正电的赖氨酸(k)间隔一个苏氨酸(t)的极性带正电的组氨酸(h)，可能是推动ros攻击spacer的核心铰链区电子转移的关键氨基酸。本发明通过中性不带电的丝氨酸(s)或者酪氨酸(y)取代核心铰链区中极性带正电的组氨酸(h)，获得抗氧化嵌合型抗原受体。可以明显增强在ros环境中的稳定性，从而使得car免疫细胞在肿瘤微环境ros富集的情况下仍能保持对肿瘤细胞的杀伤作用。

现有corehinger的cdna序列为tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca，其中将cac替代为tac可以得到corehinge-y1的cdna，但不限于此，也可以是tat；将cac替换为tca可以得到corehinge-y2的cdna，但不限于此，也可以是tct、tcc、tcg、agt或者agc。

如图1和图2所示，本发明的嵌合型抗原受体还可以包括跨膜区和胞内区，所述胞外区还包括单链抗体(scfv)，所述间隔区两端连接所述跨膜区和单链抗体，所述跨膜区与所述胞内区连接，所述间隔区采用免疫球蛋白g(igg)的常链(fc)片段(hch3)。其中信号肽可以为iggsp，跨膜区可以是cd8α跨膜域、胞内区可以是cd28胞内信号域和cd3ζ胞内信号域。

相应的，本发明中间隔区的基因序列为igghch3-y1cdna(seqidno：6)或igghch3-y2cdna(seqidno：7)。本发明中的间隔区在现有的igghch3cdna(seqidno：5)的基础上替换核心铰链区的cac。

本发明还提供一种表达上述嵌合型抗原受体的免疫细胞。其中，所述免疫细胞包括car-t细胞、car-nk细胞、car-b细胞或car-mp细胞。其中，car-t细胞为嵌合抗原受体t细胞；car-nk细胞为嵌合抗原受体自然杀伤细胞；car-b细胞为嵌合抗原受体b细胞；car-mp(car-macrophage)细胞为嵌合抗原受体巨噬细胞。

如图3所示，所述免疫细胞的制备方法包括：

步骤301：合成嵌合型抗原受体的cdna。基于igghch3-y1cdna或igghch3-y2cdna序列合成cdna。

步骤302：用所述cdna制备慢病毒质粒。可以通过连接酶将cdna，连接到慢病毒的质粒载体中进行制备，如pccl/mndu3-x质粒载体。

步骤303：通过慢病毒质粒制备慢病毒颗粒。将慢病毒质粒转染到宿主细胞中进行增殖，获得大量的慢病毒颗粒。

步骤304：获取单个核细胞，并进行预培养。单个核细胞可以通过培养诱导为免疫细胞。

步骤305：将慢病毒颗粒转染到预培养后的单个核细胞中，经过培养，获取免疫细胞。慢病毒颗粒转染到单个核细胞后，随着单个核细胞培养为免疫细胞，本发明的嵌合型抗原受体在免疫细胞中得到成功表达。

在一个具体实施例中，如图4所示，所述慢病毒颗粒的制备方法包括：

步骤401：使用含10％胎牛血清的dmem培养液培养6x10⁶个hek293t细胞。其中，培养液中可以添加抗生素，预防细菌污染。

步骤402：第二天细胞达到聚合度80％左右时，换无10％fbs以及无抗生素的dmem培养液后，稳定2-3小时。

步骤403：所述慢病毒质粒包括pccl-car质粒，分别取终浓度为6.9μg/ml的pccl-car质粒、3.4μg/ml的pmdlg-prre质粒、2μg/ml的pmd2.g质粒和1.71μg/ml的prsv-rev质粒加入到培养液中，混匀得到质粒培养液。其中，pmdlg-prre质粒、pmd2.g质粒和pmdlg-prre质粒为常用的慢病毒包装质粒，可以从市场上购得。pccl/mndu3-x为常用的质粒载体，可以通过酶切、连接和分子克隆将cdna连接到pccl/mndu3-x载体上，但不限于此，也可以采用其它的质粒载体或包装质粒。

步骤404：取35μg浓度为1μg/μl的聚乙烯亚胺加入到1毫升dmem培养液中，混匀得到聚乙烯亚胺培养液。

步骤405：将聚乙烯亚胺培养液加入到质粒培养液中，混匀后，室温静置20分钟，获得第一转染液。

步骤406：将所述第一转染液加入到稳定后的hek293t细胞中，进行转染。

步骤407：转染4小时后，培养液更换为含10％胎牛血清的dmem培养液。

步骤408：继续培养48小时后，收集细胞培养液，0.22μm的滤膜过滤。其中慢病毒颗粒分泌到细胞培养液中。

步骤409：滤出液经26000rpm、4℃离心2小时，取沉淀。

步骤410：用xvivo15全培养液重悬所述沉淀，获得慢病毒颗粒。

在一个具体实施例中，获取免疫细胞的方法包括：

步骤501：取50ml外周血，ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单个核细胞。

步骤502：所述单个核细胞以2x10⁶/ml的细胞密度，在x-vivo15全培养液、37℃、5％co2培养2小时，收集悬浮细胞。

步骤503：悬浮细胞以1.2x10⁶/ml的细胞密度接种到培养瓶内，以细胞比磁珠为1:3的比例加入cd3/cd28磁珠，并加入终浓度100u/ml的白介素2培养过夜。其中，细胞与磁珠比例是指细胞数量和磁珠数量之比。

步骤504：加入所述慢病毒颗粒进行转染。

步骤505：细胞转染后继续培养5天，通过磁力架去除磁珠，获得免疫细胞。

但不限于此，也可以通过其它方法或载体获得慢病毒质粒或者免疫细胞。

如下表所示，建立实施例一和实施例二。其中，cd19为b淋巴细胞抗原分子，psma为前列腺特异性膜抗原(prostate-specificmembraneantigen)，实施例一中，scfv以cd19靶点，即免疫细胞的嵌合型抗原受体与cd19结合；实施例二中，scfv以psma为靶点，即免疫细胞的嵌合型抗原受体与psma结合。

其中，表中的氨基酸序列和cdna序列请查看序列表。

本发明中，对实施例一和实施例二进行了抗氧化性测试、肿瘤细胞杀伤测试和小鼠肿瘤模型测试。

抗氧化性测试的方法如下表所示。

h2o2是ros环境最主要的物质，在h2o2环境细胞培养条件下，通过检测scfv的量来观察car-t细胞中嵌合型抗原结构的完整性。proteinl能与scfv结合，elisa检测car-t细胞裂解液中的proteinl的量来测定scfv的量，如果proteinl含量减少，表明与之结合的scfv量减少。其中辣根过氧化物酶酶标抗体可以与anti-proteinl抗体相结合。其中，96孔板中设置标准孔，标准孔中加入标准proteinl，用于检测各样品中proteinl的量。

检测结果如图6和图7所示，h2o2(-)为非氧化分组、h2o2(+)为氧化分组，对照组(carcd19和carpsma)的h2o2氧化分组proteinl的量明显低于非氧化分组，说明氧化分组的scfv含量降低，h2o2破坏了car的完整性；carcd19y1、carpsmay1、carcd19y2和carpsmay2，h2o2氧化处理与否，proteinl的量无明显差异，说明本发明的优化组1和优化组2的scfv完整性不受h2o2的影响，表现出了抗氧化性。其中，图6和图7基于graphadprism8.0分析软件,2wayanova统计分析方法获得。

肿瘤杀伤测试的方法如下表：

其中，xtt为四唑氮衍生物，可以被活细胞中的代谢酶还原成水溶性的代谢产物在od450处有吸收峰，od450值降低，表明活细胞数量少，od450值高，则活细胞量多。car-t杀死肿瘤细胞，活细胞数量减少，od450值降低，因此可以通过xtt测定car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

如图8和图9所示，对照组(carcd19和carpsma)的氧化分组od450值明显高于非氧化分组，说明h2o2氧化分组的活细胞量高，氧化分组免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效力不如非氧化分组；carcd19y1、carpsmay1、carcd19y1和carpsmay2的氧化分组与非氧化分组od450值无明显差异，因此其对肿瘤细胞的杀伤不受h2o2的影响，具有抗ros性或抗氧化性。而对照组的氧化分组od450值显著高于优化组1和优化组2的氧化分组，因此对照组的氧化分组活细胞量高，其对肿瘤细胞的杀伤效力明显低于优化组1和优化组2的。

细胞因子如肿瘤坏死因子alpha(tumornecrosisfactoralpha，tnfα)和干扰素gamma(interferongamma,ifnγ)在car-t细胞抗肿瘤作用中起着重要的作用，因此tnfα和ifnγ在细胞培养液中的含量反应了肿瘤杀伤力。其中，细胞因子的elisa检测为现有技术，本发明不再赘述。如图10-13所示，carcd19和carpsma细胞，其tnfα和ifnγ含量在氧化分组中的量明显低于非氧化分组，而carcd19y1、carpsmay1、carcd19y1和carpsmay2的氧化分组与非氧化分组，其tnfα和ifnγ含量无明显变化；对照组的氧化分组的tnfα和ifnγ含量低于优化组1和优化组2的氧化分组。其中，h2o2氧化可能导致免疫细胞的抗肿瘤因子表达量降低。因此，优化组1和优化组2表现出良好的抗氧化性和肿瘤细胞抑制作用。

小鼠肿瘤模型测试：

nod/scid小鼠，后背侧皮下接种2x10⁶个前列腺癌细胞lncap，接种约2周后至肿瘤生长100立方毫米(mm³)左右。其中，通过游标卡尺测量肿瘤的长和宽，肿瘤大小由以下公式计算得到：

v＝(a×b²)÷2

其中，v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。

24只小鼠随机均分为4组：空白对照组、carpsma组、carpsmay1组和carpsmay2组。carpsma组、carpsmay1组和carpsmay2组分别注射相应的免疫细胞，空白对照组注射等体积的生理盐水。

在第4、8、12、17、21、24、26、29和31天，分别测量每只小鼠的肿瘤大小，每组取平均值。其中，空白对照组在第26天死亡，检测结果如图14所示。carpsma组的肿瘤生长明显低于空白对照组；carpsmay1组和carpsmay1组对肿瘤抑制作用效果相当，且明显优于carpsma组。因此本发明的嵌合型抗原受体和免疫细胞表现良好的实体瘤抑制效果。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>廖文强

<120>一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞

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