1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种以暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)为活性成分的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术：
2.禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的菌落初期为白色，菌丝白絮状或绒状，后期呈粉红、黄、紫色等。它的菌属种类很多，能引起田间作物病害，其有性世代即小麦赤霉病和玉米赤霉病。在贮粮当中，能使粮食霉坏变质，尤以小麦、玉米等为害严重。此菌为好氧性中温性菌。生长繁殖最适温度20～40℃，少数为低温性。
3.禾谷镰刀菌不仅直接危害农作物的产品与品质，更严重的是，禾谷镰刀菌在一定生长条件下可分泌大量毒素，如玉米赤霉烯酮(zearalenone)。其中玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其在玉米的阳性检出率为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用，可造成家禽和家畜的雌激素水平提高。目前发现，猪对此毒素较为敏感。玉米赤霉烯酮作用的靶器官主要是雌性动物的生殖系统，同时对雄性动物也有一定的影响。在急性中毒的条件下，对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用。主要的机理是它会造成神经系统的亢奋，在脏器当中造成很多出血点，使动物突然死亡。主要的原因还是由于雌激素水平过高而造成的。玉米赤霉烯酮中毒分为急性中毒和慢性中毒。在急性中毒时，动物表现为兴奋不安，走路蹒跚，全身肌肉振颤，突然倒地死亡。同时还可发现粘膜发绀，体温无明显变化。动物呆立，粪便稀如水样，恶臭，呈灰褐色，并混有肠粘液。频频排尿，呈淡黄色。同时还表现为外生殖器肿胀，精神萎顿，食欲减退，腹痛腹泻的特征。在剖检时还能发现淋巴结水肿，胃肠粘膜充血、水肿，肝轻度肿胀，质地较硬，色淡黄。而在慢性中毒时，主要对母畜的毒害较大。它会导致母畜外生殖器肿大。充血，死胎和延期流产的现象大面积产生，并且伴有木乃伊胎的现象。50％的母畜患卵巢囊肿，频发情和假发情的情况增多，育成母畜乳房肿大，自行泌乳，并诱发乳房炎，受胎率下降。同时对公畜也会造成包皮积液、食欲不振、掉膘严重和生长不良的情况。
4.由此可见，禾谷镰刀菌不仅对农作物的产量和品质造成巨大影响，其产生的毒性物质可进一步污染粮食加工产品，不仅影响人类健康，并且对以玉米为主要饲料来源的畜禽养殖业带来巨大危害。而目前对于禾谷镰刀菌的防治方法，除了保持作物及粮食产品干燥、通风、低温条件外，尚无有效的方法。
5.自然界的微生物是一个天然的活性功能物质的宝库，从丰富多样的微生物资源中筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗和抑制作用的功能微生物，则是解决禾谷镰刀菌污染危害的可行办法。
技术实现要素：
6.本发明主要是提供一种暹罗芽孢杆菌菌剂及其制备方法和在抑制禾谷镰刀菌方面的应用。
7.为达到上述目的，本发明采用的一个技术方案为：
8.一种微生物菌剂，其活性成分为暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)，以下简称iae-m-bs。
9.微生物菌剂的制备方法：
10.1)lb培养基(g/l)制备：水1l，胰蛋白胨10g酵母提取物5gnacl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/l的naoh调ph至7.0；固体培养基加入20g琼脂；
11.2)微生物斜面种子的制备：将iae-m-bs接种在lb固体培养基斜面上，35℃-37℃培养24小时后获得种子斜面；
12.3)微生物液体种子的培养：取1环iae-m-bs斜面种子转接到装有200ml lb液体培养基的500ml三角瓶中，于180r/min，37℃培养24小时；
13.4)微生物菌剂：发酵液经4000g离心10min后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的生理盐水中，制备细胞悬液。
14.微生物菌剂的应用：本发明的微生物菌剂通过对所述菌剂可以作为禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的抑菌实验，发现其能良好的抑制禾谷镰刀菌的生长。所述菌剂可以施用于农田土壤中，抑制禾谷镰刀菌生长，防止因禾谷镰刀菌导致的作物病害的发生。
15.本发明的菌剂高效、无毒、环境友好且制备工艺简单，该菌剂对禾谷镰刀菌具有较好的拮抗效果，可以施用于农田土壤中，抑制禾谷镰刀菌生长，防止因禾谷镰刀菌导致的作物病害的发生。
16.本发明的有益效果是：1)本发明菌剂其活性成分为暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs，对人体和哺乳动物安全无害，在很大程度上保护了生态环境和农产品的安全。2)本发明菌剂使用灵活、简单、高效。3)本发明菌剂施用于农田土壤中，可长时间的抑制禾谷镰刀菌生长，防止小麦赤霉病和玉米赤霉病等作物病害的发生，保障粮食生产产量和质量的安全。
附图说明
17.图1为暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs与禾谷镰刀菌对峙效果图。
18.菌落4-6为暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs；菌落12为禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)，
具体实施方式
19.下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
20.请参阅图1，本发明实施例包括：
21.实施例1
22.微生物菌剂的制备方法：
23.1)lb培养基(g/l)制备：
24.lb液体培养基：水1l，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，于容器中共混，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/l的naoh调ph至7.0，得lb液体培养基；
25.lb固体培养基：于上述液体培养基中加入20g琼脂融化，得lb固体培养基；
26.2)微生物斜面种子的制备：将暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs接种在lb固体培养基斜面上，35℃-37℃培养24小时后获得种子斜面；
27.3)微生物液体种子的培养：用接种环取1环暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs斜面种子转接到装有200ml lb液体培养基的500ml三角瓶中，于180r/min，37℃培养24小时，得发酵液；
28.4)微生物菌剂：发酵液经4000g离心10min后，弃上清，沉淀悬浮于上清液同体积的生理盐水中，制备细胞悬液，即微生物菌剂。
29.实施例2
30.1)马铃薯培养基(g/l)制备：
31.马铃薯浸出液的制备：将200g马铃薯去皮切块，加1000ml蒸馏水，煮沸15min；用纱布过滤去除固体，液体补加蒸馏水至1000ml，得马铃薯浸取。
32.马铃薯液体培养基：马铃薯浸取液1l，葡萄糖20g，ph自然，121℃高压灭菌20min；，得lb液体培养基。
33.马铃薯固体培养基：于上述液体培养基中加入15g琼脂，得马铃薯固体培养基。2)病原菌培养方法：用接菌环挑取禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的菌丝体，接种于含马铃薯固体培养基的90mm直径的平皿中，于28℃培养箱中，连续培养4-5天，直至菌丝几乎铺满整个平皿，此为活化的禾谷镰刀菌。
34.3)禾谷镰刀菌菌饼制备：选用直径8.5mm的不锈钢打孔器，事先灭菌后冷却至室温，用打孔器在新鲜活化的禾谷镰刀菌平皿上，靠近菌落边缘位置，打孔并取出直径8.5mm菌饼，平置于含新鲜马铃薯固体培养基的90mm直径的平皿中央位置。
35.4)抑菌实验：将以上放置了禾谷镰刀菌菌饼的马铃薯固体培养基的平皿，四周距离平皿(平皿规格为90mm直径)边缘1.5cm处(于一以平皿中心为圆心的同一圆周上)等距离打4个直径为7mm的孔，分别接种0.2ml由实施例1中制备的暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs的菌剂细胞悬液(菌落4-6)，以及同样接菌量的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)(菌落4-7)，蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)(菌落4-8)，凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)(菌落4-9)，28℃恒温培养。7天以后观察。
36.结果：暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)iae-m-bs对禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)具有抑制效果，在以上操作条件下，暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)的抑菌圈(菌落4-6)直径可达30.32mm，具有显著抑制活性。而同样接菌量的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)(菌落4-7)，蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)(菌落4-8)，凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)(菌落4-9)都没有表现出明显的抑菌圈，不具有抑制禾谷镰刀菌生长的活性。
37.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。