本发明涉及血小板技术领域，尤其涉及一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法。
背景技术：
轻型缺血性卒中患者发生后续卒中的短期风险很高，极有可能导致残疾，尤其是在卒中后的前90d。chance研究发现轻型缺血性卒中或短暂性脑缺血发作(tia)后24h内给予阿司匹林联合氯吡格雷治疗21d比单独使用阿司匹林能够降低32％卒中复发风险，并且未增加出血的并发症。point研究的二次分析也证实在发病以后的前21d使用双抗治疗降低缺血性事件的获益最大，而21d后继续使用双抗治疗则获益将被增加的出血风险抵消。因此，目前国内外指南均推荐对未曾接受阿替普酶静脉溶栓的非心源性轻型缺血性卒中患者，应尽早启动阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗并维持21d。然而，有文献报道3％～85％服用阿司匹林及4％～30％服用氯吡格雷的患者，即使长期规律服药，仍有脑卒中复发的风险，临床预后并没有得到改善，这可能与患者对抗血小板药物的反应性降低有关。有学者将这种患者对抗血小板药物反应性降低的现象，称为“抵抗”。阿司匹林抵抗(aspirinresistance，ar)、氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，cr)是预防和治疗部分缺血性卒中失败的重要原因，并将大大增加缺血性卒中的复发风险。有关ar及cr发生的机制比较复杂，目前尚不十分明确，以往的研究显示抗血小板药物代谢及作用过程中涉及的相关基因多态性可能是一个重要因素。目前，国内尚无根据国人状况的个体化、标准化的抗血小板治疗体系。血小板抑制作用因人而异，实现个体化抗血小板治疗是抗栓治疗急需研究解决的问题。
因此，我们提出了一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法用于解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法。
基于药物基因多态性及血栓弹力图的血小板治疗指导方法，包括以下步骤：
s1、药物基因检测：通过pcr和sanger法测序技术检测阿司匹林和氯吡格雷相关的基因多态性位点；
s2、全血基因组dna测序：取静脉血2ml于edta抗凝管中，利用全血基因组dna提取试剂盒来提取dna，再将提取的dna进行pcr扩增，最后将扩增产物使用测序仪进行测序；
s3、进行代谢型分类：根据基因型进行代谢型分类，分为强代谢型和弱代谢型；
s4、teg检测：使用teg5000型凝血分析仪对肘静脉血进行分析，2h内检测aa途径诱导的血小板抑制率(aa％)和adp受体途径诱导的血小板抑制率(adp％)；
s5、结果分析：aa抑制率＜50％，定义为ar；adp抑制率＜30％，定义为cr。
优选的，所述s1中，阿司匹林相关基因检测cox-1(a>g)、itgb3(t>c)基因，其中g、c为阿司匹林抵抗相关等位基因；氯吡格雷相关基因检测cyp2c19基因*2(681g/a)、*3(636g/a)、*17(-806c/t)。
优选的，所述s2中，dna测序前经过酶切反应，酶切反应条件：变性：94℃，5min，94℃，30s；退火：56℃，20s；延伸：72℃，20s；
共35个循环，最后72℃延伸5min。
优选的，功能缺失等位基因携带者为至少有1个功能缺失等位基因的患者：*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3、*2/*17或*3/*17；功能缺失等位基因非携带者为无功能缺失等位基因的患者：*1/*1，*1/*17，或*17/*17。
优选的，所述s4中，根据cyp2c19*2、*3和*17基因型进行代谢型分类，分为强代谢型：野生型纯合子组cyp2c19*1/*1的快代谢型、cyp2c19*1/*17的超快代谢型；
优选的，弱代谢型：野生型与突变基因杂合子组：cyp2c19*1/*2和*1/*3的中间代谢型、突变基因纯合子或杂合子组：cyp2c19*2/*2、2/*3和*3/*3的慢代谢型。
优选的，所述凝血分析试剂包括高岭土、激活剂、花生四烯酸和二磷酸腺苷。
优选的，所有数据均采用spss17.0统计软件包进行处理。
优选的，计量资料符合正态分布的采用均数±标准差
优选的，所有检验均为双侧检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。
本发明的有益效果是：根据药物基因多态性联合teg指导轻型缺血性卒中抗血小板治疗能有效降低90d内新发卒中风险，且不会增加出血风险。基因检测联合teg可及时发现对抗血小板药物治疗不敏感的患者，能为抗血小板治疗药物的选择提供新的依据，使缺血性卒中患者能更加精准、合理地选择抗血小板药物，从而制定个体化的抗血小板治疗方案，有效降低卒中复发的风险，对于缺血性卒中二级预防具有重要的指导意义，值得临床推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本实施例中，选取2018年1月至2020年04月在江苏大学附属武进医院接受治疗的250例急性轻型缺血性卒中患者的临床资料，纳入标准:(1)年龄≥18岁；(2)首次非心源性急性轻型缺血性卒中，定义为由血管原因引起的突发性局灶性神经功能障碍，美国国立卫生研究院卒中量表评分(nihss)≤3分；(3)头颅ct或mri排除出血或证实新发脑梗死；(4)发病时间≤48h，并能在症状出现后48h内开始给予抗血小板药物治疗。如果符合下列标准之一，患者将被排除在参与研究范围之外，排除标准：(1)有出血或其他情况，如血管畸形、创伤、肿瘤、脓肿、神经退行性疾病等；(2)动脉炎、遗传性急性缺血性脑血管病等非动脉粥样硬化致急性缺血性脑血管病；(3)在ct或mri基础上没有急性梗死的证据；(4)有明确的抗凝治疗指征(可能是心源性栓塞，如房颤或人工心脏瓣膜)；(5)有出血倾向、活动性消化性溃疡及近期活动性出血等氯吡格雷或阿司匹林禁忌征；(6)严重精神疾病症状临床不能配合的患者；(7)全身性传染病、自身免疫性疾病、严重的心、肝、肾疾病；(8)有颅内出血史、3个月前有消化道出血或消化道内大手术史；(9)服用质子泵抑制剂；(10)合并有血液疾病者，血小板计数＞450×10/l或＜100×10/l或血红蛋白＜80g/l；(11)长期服用非甾体类抗炎药物或阿司匹林、氯吡格雷以外的抗血小板药物；(12)筛查后3个月内有血管重建术计划可能；(13)有严重的非心血管疾病并存，预期寿命不足3个月。纳入本研究中的所有患者均符合动脉粥样硬化性急性缺血性脑卒中诊断，均在静脉溶栓时间窗之外，未接受溶栓治疗，所有患者均使用氯吡格雷和阿司匹林进行抗血栓治疗。本研究经江苏大学附属武进医院伦理委员会批准，参与本研究的患者具有完整的临床资料，所有患者或监护人签署知情同意书。
随机分组与治疗：诊断急性轻型缺血性卒中患者，在出现症状的48h内按1:1的比例随机分配给试验组或对照组。试验组是根据患者入院第1d基因多态性检测结果和第8d的teg检测adp、aa抑制率结果选择抗血小板治疗。主要目的是评估两组治疗方案对急性轻型缺血性卒中患者90d内卒中复发率的影响。所选药物为阿司匹林(商品名：拜阿司匹灵，拜耳医药有限公司)及氯吡格雷(商品名：波立维，赛诺菲安万特制药有限公司)。
药物基因检测:通过pcr和sanger法测序技术检测阿司匹林和氯吡格雷相关的基因多态性位点，pc仪和测序仪均购自美国thermofisherscientific公司。随机分组后立即抽入选试验组患者的静脉血2ml于edta抗凝管中，按照全血基因组dna提取试剂盒说明书提取dna，根据相关基因检测试剂盒(上海百傲生物科技有限公司)说明书，再将提取的dna进行pcr扩增，最后将扩增产物使用测序仪进行测序。酶切反应条件:变性：94℃，5min，94℃，30s；退火：56℃，20s；延伸：72℃，20s。共35个循环，最后72℃延伸5min。将扩增产物置于1.5％琼脂糖中进行凝胶电泳，应用凝胶成像系统扫描电泳条带，并进行分析。阿司匹林相关基因检测cox-1(a>g)、itgb3(t>c)基因，g、c为阿司匹林抵抗相关等位基因；氯吡格雷相关基因检测cyp2c19基因*2(681g/a)、*3(636g/a)、*17(-806c/t)，功能缺失等位基因携带者为至少有1个功能缺失等位基因(即*2或*3)的患者：*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3、*2/*17或*3/*17；功能缺失等位基因非携带者为无功能缺失等位基因的患者：*1/*1，*1/*17，或*17/*17。引物均由primer3软件生成(表2)。根据cyp2c19*2、*3和*17基因型进行代谢型分类，分为强代谢型：野生型纯合子组(cyp2c19*1/*1，快代谢型)+(cyp2c19*1/*17超快代谢型)；弱代谢型：野生型与突变基因杂合子组(cyp2c19*1/*2和*1/*3，中间代谢型)+突变基因纯合子或杂合子组(cyp2c19*2/*2、2/*3和*3/*3，慢代谢型)[10]。
teg检测:使用teg5000型凝血分析仪，试剂包括高岭土(含1％kadin液)、激活剂、花生四烯酸(arachidonicacid,aa)和二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，adp)，均为美国haemoscope公司产品。所有患者于第8d晨起空腹抽取6ml肘静脉血，分别放入肝素试管和枸橼酸盐试管中，2h内检测aa途径诱导的血小板抑制率(aa％)和adp受体途径诱导的血小板抑制率(adp％)。
结果判定：aa抑制率＜50％，定义为ar；adp抑制率＜30％，定义为cr。
临床资料收集及随访
收集所有入组患者的基线资料，包括年龄、性别、体重指数(bmi)、发病至入组时间、nihss评分、卒中危险因素(如高血压、糖尿病、高胆固醇血症、高同型半胱胺酸血症、吸烟、饮酒史)、病灶分布、病因分型。所有患者出院后均进行电话随访或门诊随访，了解他们90d内是否有新发脑卒中(缺血性和出血性)，以及复合心脑血管事件(包括非心源性tia、新发脑卒中、心绞痛、心肌梗死、血管性死亡)和出血事件(包括眼睛、鼻腔、牙龈、皮肤、颅内、消化道和泌尿系统出血)。血管性死亡定义为卒中(缺血性或出血性)、全身出血、心肌梗死、充血性心力衰竭、肺栓塞、猝死、心律失常所致死亡。出血性脑卒中的定义为急性血液外渗至脑实质或蛛网膜下腔，并伴有相关的神经症状。如果改良后的rankin(mrs)评分为2分或2分以上，则认为反复发作的卒中是致残的。
统计方法:所有数据均采用spss17.0统计软件包进行处理。计量资料符合正态分布的采用均数±标准差
结果
两组患者的临床基线资料比较
2017年1月至2020年4月，共有250例急性轻型缺血性卒中患者被纳入研究，按1:1的比例随机分配到试验组和对照组。总体中位数年龄66岁，39.2％的患者为女性，平均bmi为24.4±3.0kg/m2。从发生卒中到随机化入组的中位数时间为20h。总共94.4％的患者有高血压病史，43.2％有糖尿病史，48.0％有吸烟史，32.8％有饮酒史，22.4％有高同型半胱血症，41.2％有高胆固醇血症。两组患者之间在性别、年龄、体重指数(bmi)、入院时nihss评分、发病至随机入组时间、高血压、糖尿病、高脂血症、高同型半胱胺酸血症、吸烟、饮酒、病灶部位、病因分型等方面比较无统计学差异(p＞0.05，)，具有可比性。
试验组药物基因检测与teg检测结果
经cox-1和itgb3基因检测，发现cox-1的-1676a>g位点中，有69例为野生aa型，56例为变异型，占44.8％，其中42例为ag型杂合变异，14例为gg型纯合变异。-842a>g位点中，未发现有变异型等位基因。itgb3的1565t>c位点中，有111例为野生tt型，14例为变异型，占11.2％，其中12例为tc型杂合变异，2例为cc型纯合变异。只有5例均携带有cox-1和itgb3基因的变异型等位基因，共有65例携带有ar相关等位基因，占52.0％。经cyp2c19基因检测，氯吡格雷强代谢型54例，占43.20％，其中cyp2c19*1/*1共52例，cyp2c19*1/*17共2例；氯吡格雷弱代谢型71例，占56.80％，其中cyp2c19*1/*2共44例，cyp2c19*1/*3共6例，cyp2c19*2/*2共13例，cyp2c19*3/*3共2例，cyp2c19*2/*3共6例。有33例(26.4％)均携带阿司匹林抵抗和氯吡格雷弱代谢的相关等位基因。阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗第8d，经teg检测结果提示aa抑制率＜50％，有3例(2.4％)，均不携带ptgs1和itgb3基因的变异型等位基因；adp抑制率＜30％，有12例(9.6％)，有1例为cyp2c19*2/*3；未发现同时有aa抑制率＜50％和adp抑制率＜30％的病例。
随访90d内，试验组有4例(3.2％)患者发生卒中，对照组有12例(9.6％)发生卒中，与对照组相比，两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。试验组有2例(1.6％)患者发生致残性卒中，对照组有7例(5.6％)，两组相比差异无统计学意义(p＞0.05)。试验组和对照组均无出血性卒中发生。试验组有5例(4.0％)发生复合血管事件，对照组有14例(11.2％)，两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。试验组有1例(0.8％)患者发生tia，对照组有2例(1.6％)，两组相比差异无统计学意义(p＞0.05)。两组均未发生心血管事件以及血管性死亡或其他原因死亡事件。
teg是一种通过检测血栓粘弹力的变化并以图形的方式动态反映凝血、血小板聚集和纤溶功能的方法。近年来，teg越来越多地被应用于检测ar和cr。通过teg可以检测服用不同抗血小板药物后机体的反应情况，其中adp诱导的血小板聚集抑制率检测可反映机体对氯吡格雷的反应性，而aa诱导的血小板聚集抑制率可反映机体对阿司匹林的反应性。国内有研究报道非心源性缺血性卒中患者急性期给予双抗治疗后，根据teg结果选择敏感抗血小板聚集药物能提高患者临床预后，不增加出血风险。因此，本研究通过联合检测阿司匹林和氯吡格雷的相关基因多态性以及teg检测血小板抑制率，指导选择抗血小板药物和维持剂量，明确基因多态性联合teg在指导轻型缺血性卒中患者个体化抗血小板治疗中的应用价值。
根据药物基因多态性联合teg指导轻型缺血性卒中抗血小板治疗能有效降低90d内新发卒中风险，且不会增加出血风险。基因检测联合teg可及时发现对抗血小板药物治疗不敏感的患者，能为抗血小板治疗药物的选择提供新的依据，使缺血性卒中患者能更加精准、合理地选择抗血小板药物，从而制定个体化的抗血小板治疗方案，有效降低卒中复发的风险，对于缺血性卒中二级预防具有重要的指导意义，值得临床推广应用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。