一种评价猪达100kg体重日龄的分子标记及其应用

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与猪校正达100kg体重日龄相关的snp标记及其检测方法和应用。


背景技术：

2.在我国，猪肉消费量占肉类总量的68％左右，人口的增长及对猪肉需求的上升意味着养猪业有着更大的潜在市场。而在影响养猪业生产效率的诸多因素中，猪种的遗传因素起着主导作用，只有充分地利用现有的猪种资源，培育出具有优良生产性能的品种或品系，才能在同样饲养条件和投入下，获得养猪生产最大的产出和效益。因此，对猪品种的遗传改良格外重要。
3.若要改良群体的生产性能，必须在每一个世代对群体中每个个体的遗传价值进行评定，选择理想的个体作为种畜，从而保证群体的遗传水平向期望的方向发展。100kg体重日龄，是待测目标猪群体重在80-105kg范围内时，对其体重进行测量，然后按照达100kg体重日龄校正公式计算得到。该性状可以反映猪个体生长速度，同时也可以作为产肉速率这一生长性状的重要指标。
4.目前，基于高通量测序技术开发出的snp芯片，使全基因组关联分析(genome-wideassociation studies,gwas)逐渐成为一种鉴定畜禽经济性状重要候选基因的主流策略。gwas是指将基因组范围内的单核苷酸突变作为分子标记，与人类及畜禽上一些疾病及复杂性状进行关联分析，从而鉴定出与目标性状相关的遗传变异。早在1996年，risch等首次提出了全基因组关联分析的概念。其基本原理是：在特定群体中选择病例组或对照组，比较全基因组范围内snp位点的基因型频率在不同分组间的差异，若某个位点的基因型在不同分组中的差异显著，则认为该位点与目标性状相关，并根据其物理位置推断候选基因。
5.目前，在猪的遗传改良中，对猪达100kg体重日龄相关基因的研究不足，缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪达100kg体重日龄相关的snp标记。


技术实现要素：

6.为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，提出了一种与猪达100kg体重日龄相关的snp标记及其应用、检测所述snp标记的多态性或基因型的物质及其应用、鉴定或辅助鉴定猪的生长速度的方法、筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种的方法、猪的遗传改良方法等。所述与猪达100kg体重日龄相关的snp标记位于猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处，存在a/g突变，该snp位点的基因型为aa的猪达100kg体重日龄显著低于ag和gg基因型个体。利用所述snp标记能够进行标记辅助选择，缩短猪育种周期，显著提高猪的生长速度，加快猪的遗传进展，有效提高猪育种的经济效益，从而完成了本发明。
7.具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
8.本发明提供了一种snp标记，其为猪基因组上的一个snp位点，所述snp标记与猪达
100kg体重日龄相关。
9.其中，所述snp标记位于猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处，碱基类型为a或g。
10.其中，所述snp标记的基因型是aa、ag和gg，
11.snp标记的基因型为aa的猪达100kg体重日龄显著低于ag和gg基因型个体。
12.本发明还提供了一种检测上述snp标记的多态性或基因型的物质，其中，所述物质为：
13.扩增包括所述snp标记在内的猪基因组dna片段的引物对；
14.包括上述引物对的pcr扩增试剂；或
15.包括上述引物对或pcr扩增试剂的试剂盒。
16.其中，所述引物对为p1和p2，其核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2所示。
17.本发明还提供了一种上述snp标记或检测上述snp标记多态性或基因型的物质的应用，其中，所述应用为如下(1)至(6)中的至少一种：
18.(1)鉴定或辅助鉴定猪的生长速度；
19.(2)筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种；
20.(3)猪育种；
21.(4)制备鉴定或辅助鉴定猪生长速度的产品；
22.(5)制备筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种的产品；
23.(6)制备猪育种的产品。
24.其中，所述猪为杜洛克猪、长白猪和大白猪中的一种或多种。
25.本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定猪的生长速度的方法，其中，所述方法包括检测猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记的多态性或基因型的步骤。
26.本发明还提供了一种筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
27.选择猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记的基因型为aa的猪进行育种。
28.本发明还提供了一种猪的遗传改良方法，所述方法包括以下步骤：
29.确定种猪核心群中种猪4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记，并根据猪snp标记做出相应的选择。
30.本发明所具有的有益效果包括：
31.(1)本发明提供的与猪达100kg体重日龄显著相关的snp标记，能够进行标记辅助选择，缩短猪育种周期，显著提高猪的生长速度，促进达100kg体重日龄低的猪品种的选育；
32.(2)本发明提供的与猪达100kg体重日龄显著相关的snp标记，其多态性直接以dna的形式表现，在猪的各个组织及各个发育阶段均可检测到，有利于更方便快捷的预测猪达100kg体重日龄；
33.(3)本发明提供的猪的遗传改良方法，能够加快猪达100kg体重日龄的遗传进展，减少猪生长性状的育种时间，从而有效提高猪育种的经济效益。
附图说明
34.图1示出本发明实施例1中所述的100kg日龄的lea(lion eyes area)全基因组关联分析曼哈顿图。
具体实施方式
35.下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
36.在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
37.本发明的第一方面，提供了一种snp标记，其为猪基因组上的一个snp位点，与猪达100kg体重日龄显著相关。
38.根据本发明一种优选的实施方式，所述snp标记位于猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处，碱基类型为a或g，记为wu_10.2_4_7185799。
39.在进一步优选的实施方式中，所述snp标记的基因型是aa、ag和gg，
40.snp标记的基因型为aa的猪100kg体重日龄显著低于ag和gg基因型个体。
41.其中，aa基因型是猪基因组中snp标记为a的纯合型，gg基因型是猪基因组中snp标记为g的纯合型，ag基因型是猪基因组中snp标记为a和g的杂合型。
42.本发明人研究发现，所述位于猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处的snp位点处于头重、总肌纤维数和单位面积肌纤维数等已知qtl区域，通过检测该位点的基因型来为猪100kg体重日龄的选择提供科学依据。
43.为了排除表型选择中饲养环境、饲料、疾病等因素对猪优良基因的误淘和误选，需要对snp位点进行基因分型，以增强目标选择的准确性。
44.基因分型的方法有多种，如直接测序法、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应、飞行时间质谱、芯片技术等，本发明中优选采用高密度snp芯片技术进行基因分型，其可以在很短的时间周期内对大量的snp进行分型，效率高，成本低。
45.优选地，本发明中采用纽勤公司的snp 80k芯片(neogen_pop80k)进行基因分型。
46.本发明的第二方面，提供了一种检测上述snp标记的多态性或基因型的物质，所述物质为：
47.扩增包括上述snp标记在内的猪基因组dna片段的引物对；
48.包括上述引物对的pcr扩增试剂；或
49.包括上述引物对或pcr扩增试剂的试剂盒。
50.根据本发明一种优选的实施方式，所述引物对为p1和p2，其核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2所示。
51.在进一步优选的实施方式中，所述pcr扩增试剂包括pcr缓冲液、dntp、引物对和dna聚合酶。
52.本发明的第三方面，提供了一种第一方面所述snp标记或第二方面所述检测snp标记的多态性或基因型的物质在如下(1)至(6)任一中的应用：
53.(1)鉴定或辅助鉴定猪的生长速度；
54.(2)筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种；
55.(3)猪育种；
56.(4)制备鉴定或辅助鉴定猪生长速度的产品；
57.(5)制备筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种的产品；
58.(6)制备猪育种的产品。
59.根据本发明一种优选的实施方式，所述猪为杜洛克猪、长白猪和大白猪中的一种或多种。
60.本发明的第四方面，提供了一种鉴定或辅助鉴定猪的生长速度的方法，所述方法包括检测猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记的多态性或基因型的步骤。
61.其中，所述猪的生长速度优选通过达100kg体重日龄来体现。
62.优选地，所述检测待测猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记的多态性或基因型的方法可以采用直接测序法或采用上述引物对对待测猪进行等位基因特异性扩增。
63.更优选地，所述方法包括以下步骤：
64.步骤1，提取待测猪的基因组dna；
65.步骤2，以基因组dna为模板，进行pcr扩增；
66.步骤3，确定待测猪所述snp标记的基因型；
67.步骤4，根据基因型确定待测猪的生长速度。
68.其中，步骤2中，采用上述引物对p1和p2进行pcr扩增，扩增得到的核苷酸片段包括上述snp标记。
69.步骤4中，若待测猪的上述snp位点的基因型为aa，则待测猪的达100kg体重日龄低；
70.若待测猪的上述snp位点的基因型为ag或gg，则待测猪的达100kg体重日龄高。
71.本发明的第五方面，提供了一种筛选或辅助筛选达100kg体重日龄低的猪品种的方法，所述方法包括以下步骤：
72.选择猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记的基因型为aa的猪进行育种。
73.本发明的第六方面，提供了一种猪的遗传改良方法，所述方法包括以下步骤：
74.确定种猪核心群中种猪的上述snp标记，并根据猪snp标记做出相应的选择。
75.优选地，种猪的继代选育猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处snp标记的基因型为aa的个体，淘汰该位点的ag和gg个体，以逐代提高该位点的等位基因a的频率，从而降低后代猪的达100kg体重日龄。
76.实施例
77.以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
78.实施例1与猪达100kg体重日龄相关的snp位点的发现
79.1、试验群体
80.本实施例中采用的试验猪群体为1,173头来自河北美神原种猪场的猪，其中，杜洛克公猪23头，杜洛克母猪177头，长白公猪15头，长白母猪363头，大白公猪2头，大白母猪593
头。
81.2、表型性状的测定
82.称重前禁食12小时，采用电子称重台称重，记录猪的体重和测定时的实际日龄。然后对猪达100kg体重的实际日龄进行校正，利用河北省地方标准(db-13/t 2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，
83.具体按下述校正公式进行：
84.校正日龄＝测定日龄(d)-[(实测体重(kg)-100)/cf]
[0085]
其中，公猪cf值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]
×
1.826040；
[0086]
母猪cf值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]
×
1.714615。
[0087]
对测定后的表型数据进行质量控制：清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
[0088]
3、基因组dna提取
[0089]
本实施例采用北京百泰克生物技术有限公司的dp1902型号细胞/组织基因组dna提取试剂盒，从猪的耳组织中提取dna，用紫外分光光度计和凝胶电泳进行dna质量检测，将检测合格的dna放置于-20℃保存，以用于后续分型测定。
[0090]
4、基因分型
[0091]
取检测合格的dna，利用纽勤公司的neogen_por80k芯片进行基因型分型。
[0092]
5、表型数据和基因型数据的质量控制
[0093]
表型数据的质量控制标准：清除表型值缺失的个体；清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
[0094]
snp芯片分型的过滤标准：清除基因型检出率小于95％的snp位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率小于(minimum allele frequency，maf)小于1％的个体；清除哈代-温伯格平衡(hardy
–
weinberg equilibrium，hwe)卡方检验p值小于1.0e-4的snp位点；清除性染色体上的snp位点。
[0095]
6、全基因组关联分析
[0096]
采用r语言包gapit version 3(华盛顿大学研发)进行全基因组关联分析，此软件包的统计模型为压缩混合线性模型，gapit的设计目的是在大数据集上准确地执行gwas和基因组预测。混合线性模型(mixed liner model，mlm)包括固定和随机效应，将个体包括为随机效应使得mlm能够整合关于个体之间关系的信息。关于关系的这种信息通过亲属关系(k)矩阵传递，该矩阵在mlm中用作个体之间的方差-协方差矩阵。当基于遗传标记的亲属矩阵(k)与种群结构(通常称为“q”矩阵，并且可以通过结构或进行主成分分析)一起使用时，“q+k”矩阵方法的统计功效要比仅与“q”矩阵的方法高。可以使用henderson的矩阵表示法描述mlm，如下所示：
[0097]
统计分析模型为：
[0098]
y＝xβ+zμ+e
[0099]
其中y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(q矩阵)和截距；μ是来自个体或者系的多个背景qtl的随机加性遗传效应的未知值；x和z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
[0100]
采用gapit统计分析软件的混合线性模型对所有分型snp位点进行100kg体重日龄关联分析，统计分析模型同上所述。
[0101]
结果如图1所示，由图1可知：snp位点wu_10.2_4_7185799(a/g；chr2：7,185,799)与100kg体重日龄有显著相关性(1.86e-03)。
[0102]
实施例2 snp位点wu_10.2_4_7185799的效应分析
[0103]
通过r语言提取多态性位点(wu_10.2_4_7185799)的序列，并统计其基因型频率和基因频率分布，结果如表1所示：
[0104][0105]
其中，aa基因型为猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处的snp位点为a的纯合型，gg基因型是猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处的snp位点为g的纯合型，ag基因型是猪参考基因组10.2版本4号染色体的核苷酸7,185,799处的snp位点为a和g的杂合型。
[0106]
由表1可知，等位基因a的频率为43.99％，等位基因g的频率为56.01％，ag基因型为实验群体优势基因型，g为优势等位基因。
[0107]
进一步地，采用rstudio软件对基因型数据和表型数据利用kruskal-wallis方法进行snp位点不同基因型个体间的100kg体重日龄差异显著性检验，p-value＜0.01表明差异极显著，结果如表2所示。
[0108]
表2
[0109][0110][0111]
表2示出了wu_10.2_4_7185799位点a/g在猪群体中对100kg体重日龄的影响效应，可以看出：wu_10.2_4_7185799位点与100kg体重日龄之间存在极显著相关(p《0.01)，在wu_10.2_4_7185799不同基因型个体中，aa型个体的100kg体重日龄极显著小于ag型个体和gg型个体。
[0112]
因此，在猪群体中，继代选育wu_10.2_4_7185799位点的aa型个体，可逐步降低100kg体重日龄。若与100kg体重日龄相关的snp标记的gg型个体全部选育成aa型个体，则每
头猪的平均达100kg体重日龄可以降低12.6天，显著提高猪的生长速度，提高猪的生产效益。
[0113]
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。