一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的miRNA标志物及其检测引物和应用的制作方法

本发明涉及一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的mirna标志物及其检测引物和应用，具体地涉及mirna-29a在湖羊肌肉细胞增殖过程中的应用，属于畜牧兽医技术领域。

背景技术：

湖羊是世界著名的绵羊品种，不仅繁殖性能优势突出，而且肉骨比高，肉质细嫩、多汁，深受大众喜爱。然而，由于湖羊屠宰性能较差，不断制约着湖羊肉质性状的开发利用。因此，科学地开展湖羊肉质性状调控机制的研究具有重大意义。

随着分子生物学及生物信息学的快速发展，关于动物肌肉生长发育的研究也逐步深入、细化。目前生物信息学预测靶基因的方法主要是利用两种及以上的靶向基因预测软件对目标基因进行生物信息学预测，再针对预测结果通过取交集，以确保预测结果具有较高的准确性。现在已被功能验证及确定靶基因的mirna在已有的mirna库中占比仍然很小，且利用生物信息学进行理论预测mirna的靶基因难以避免存在误差，必须通过试验验证辅以相关的文献资料做进一步分析。但是，生物信息学理论预测为试验验证提供了可能和方向，同时可以极大降低人力、物力以及财力的需求。mirna结合位点通常位于mrna的3’非编码区，在进化上通常较保守，其与存在于mirna的5’端第2—7位点的6个核苷酸(该区域也称为种子区域，即seedregion)可形成碱基配对，进而参与基因调控。

本发明研究发现，yap1作为hippo通道中的主效基因，在肌肉生长发起过程中扮演重要的角色。因此，本发明将yap1作为研究线索，通过在线生物信息学分析软件预测并筛选出靶向yap1的mirna-29a，并利用rt-qpcr、双荧光素酶报告系统、westernblot以及cck-8技术为深入探究yap1参与湖羊肌肉细胞增殖的分子机制提供理论借鉴。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的mirna标志物。

本发明的目的之二在于提供mirna的应用，具体为一种鉴定湖羊肌肉生长拐点的手段，通过检测mirna分子标志物的表达水平来判断测定日龄是否到达湖羊肌肉的生长拐点。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的mirna标志物，该mirna标志物为mirna-29a，其序列如seqidno.2所示。

本发明同时还提供了一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的mirna标志物即mirna-29a的检测引物，所述的检测引物选自特异性扩增mirna-29a的引物。

本发明进一步的提供了检测mirna-29a表达的试剂在准确把握湖羊肌肉细胞增殖规律的应用。

进一步，所述试剂选自：特异性扩增mirna-29a的引物。

所述的mirna-29a序列如seqidno.2所示，其靶基因yap1的上、下游引物序列分别为seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明提供了一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖规律的产品，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测上述mirna-29a的表达水平。其中，所述产品包括但不限于芯片、制剂或试剂盒。

进一步的，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增或基于核酸序列的扩增。

本发明提供了上述mirna标志物mirna-29a在鉴定湖羊肌肉细胞增殖规律的应用。

进一步的，所述药物组合物包括mirna-29a的上调剂、下调剂。所述的上调剂选自：利用化学合成的方法构建mirna-29a双链分子即mirna-29a模拟物，其功能为进一步加强mirna-29a的功能，进而最大程度地对其靶基因的表达进行削弱，因而mirna模拟物常被用于mirna功能验证；所述的下调剂选自：同样由化学方法合成的mirna-29a抑制物，但由单链分子组成，其功能是能特异性识别并抑制与其互补的mirna分(例如mirna-29a抑制物将特异性识别并抑制mirna-29a)，进而提高mirna-29a靶基因的表达量。

上述的上、下调剂均为mirna。优选的，mirna-29a模拟物序列为由成熟体序列及其互补序列构成的双链分子序列，如seqidno.2和seqidno.5所示；mirna-29a抑制物序列为由成熟体互补序列构成的单链分子序列，如seqidno.5所示。

所述药物组合物还包括与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料，如：hdtransfectionreagent、dual-gloluciferase-assaysystem、双荧光素酶载体pmirna-rb-report、mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒等。

本发明提供了下述任意一项应用：

检测mirna-29a表达的试剂在准确把握湖羊肌肉细胞增殖规律的应用；

mirna-29a基因在鉴定湖羊肌肉细胞增殖规律的应用；

mirna标志物(mirna-29a)在鉴定湖羊肌肉细胞增殖过程中的应用，以鉴定湖羊肌肉生长拐点；

上述鉴定湖羊肌肉细胞增殖规律的产品在鉴定湖羊肌肉细胞增殖过程中的应用，以鉴定湖羊肌肉生长拐点。

本发明还提供了一种鉴定湖羊肌肉细胞增殖效率的方法，该方法包括：

用候选物质处理表达或含有mirna-29a基因的体系，所述体系选自细胞体系；

检测所述体系中mirna-29a基因的表达；其中，若mirna-29a基因的表达或活性最低，则表明湖羊肌肉细胞增殖效率最高。另外，若候选物质可降低mirna-29a基因的表达或活性，则表明该候选物质是鉴定湖羊肌肉细胞增殖效率的潜在物质；优选的，候选物质降低mirna-29a基因的表达或活性在20％以上，较佳的在50％以上，更佳的在80％以上。

上述的候选物质包括但不限于：针对mirna-29a基因或其上游或下游基因设计的核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明通过生物信息学预测靶向yap1的mirna，再利用双荧光素酶报告系统、rt-qpcr、cck-8以及westernblot技术进一步验证了mirna-29a在湖羊肌肉细胞增殖过程中表达起显著下调作用。因此，本发明提出的mirna-29a可作为生物标志物应用于鉴定湖羊肌肉细胞的增殖。

对市场实施可能性和经济效益预测分析发现：羊肌肉生长状况是肉羊养殖极为重视的一格性状，本发明提供了一种鉴定湖羊肌肉生长拐点的产品，可用于对湖羊肌肉生长发育状况进行鉴定，具有良好的经济效益。

附图说明

图1是mirna-29a模拟物和抑制物的转染效果验证荧光活性图；其中图1a是mirna-29a模拟物的转染效果验证荧光活性图，图1b是mirna-29a抑制物的转染效果验证荧光活性图，图1c是过表达和抑制mirna-29a后的相对表达情况图；

图2是利用双荧光素酶报告系统检测mirna-29a过表达与抑制条件下的荧光活性图；

图3是利用rt-qpcr检测mirna-29a过表达与抑制条件下yap1与肌肉生长基因(myog、myod以及myhc)的表达情况图；其中图3a是利用rt-qpcr检测mirna-29a过表达条件下yap1与肌肉生长基因(myog、myod以及myhc)的表达情况图，图3b是利用rt-qpcr检测mirna-29a抑制条件下yap1与肌肉生长基因(myog、myod以及myhc)的表达情况图；

图4是利用cck-8法检测mirna-29a过表达与抑制条件下湖羊肌肉细胞增殖的影响图；

图5是利用westernblot检测mirna-29a过表达与抑制条件下对yap1、myog、myod以及myhc的蛋白表达情况图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例(本发明中除特殊情况以外，所提及的“％”表示质量体积百分比)。

本发明经过广泛而深入的研究，已经发现yap1基因参与湖羊肌肉生长发育，通过使用多种生物信息学预测软件以及查阅大量相关文献，发现mirna-29a可能具有与yap1结合的位点，为确定其与湖羊肌肉增殖之间的关系，从而为鉴定湖羊生长拐点寻找更好的途径和方法。实验证明，mirna-29a能够有效地抑制湖羊肌肉细胞的增殖，为掌握湖羊肌肉细胞增殖规律提供了一种全新的分子标记物。

本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有seqidno.2指定的核苷酸序列。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明所涉及材料的来源如下：

yap1基因—yap1基因源于湖羊(登录号：nm_001267881.2)，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明中的yap1基因包括野生型、突变型或其片段。

mirna-29a—mirna-29a序列源于人类(登录号：nr_029503.1)，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95～98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术—本发明的mirna使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)和链置换扩增(sda)。

通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

试剂盒及上、下调剂—本发明提供检测mirna-29a基因表达水平的产品，均购自锐博生物公司。如本发明所用，所述的mirna-29a的上、下调剂，即模拟物与抑制物，均由锐博生物公司制作而成。

所述的mirna-29a的下调剂是指任何可下调mirna-29a的表达的物质；mirna-29a的上调剂是指任何可上调mirna-29a的表达的物质。这些物质作为对于抑制或过表达mirna-29a有用的物质，可用于探究湖羊细胞增殖规律。

实施例1筛选与yap1相关的mirna及其模拟物与抑制物的功能鉴定

1、生物信息学预测

根据findtar3、mirbase、rna22以及miranda等生物信息在线软件，预测绵羊yap1基因3’utr区存在潜在靶标关系的绵羊mirnas，并结合查阅的文献资料，筛选得到mirna-29a作为候选mirna进行后续功能验证。

2、rna样品的制备(利用mirnakit进行操作)

试验用细胞来自苏州种羊场初生湖羊的背最长肌，前期已完成湖羊肌卫星细胞的分离及鉴定。rna提取步骤具体如下：

(1)细胞复苏与培养

将细胞冻存管从液氮中取出后迅速放入37℃水浴锅中融解，约2min；800rpm，离心5min，弃上清；加5ml完全培养基(90％dmem(美国gibco公司)+10％fbs(美国sigma公司)+1％青霉素/链霉素双抗溶液(美国gibco公司))，轻轻吹散混匀，将细胞悬液置于新的培养瓶中；37℃，饱和湿度，5％co2恒温培养箱中培养，48h后更换新鲜的完全培养基。

(2)细胞转染

待复苏的湖羊肌卫星细胞生长至对数期时，用0.25％胰酶消化细胞并计数，按4×10⁵个/孔均匀转至6孔板中培养，使细胞在转染时的汇合度达80％左右。参照广州锐博生物科技有限公司的mirna产品使用说明，将mirna模拟物、抑制物配制成20um的储存液，用于转染实验。参照美国invitrogen公司lipofectarnaimaxreagent说明书进行细胞转染，转染36h提取细胞rna。转染试验分组：mirna模拟物组、mirna模拟物阴性对照组、mirna抑制物组、mirna抑制物阴性对照组。具体为：mirna-29amimic、mirna-29amimic-nc、mirna-29ainhibitor、mirna-29ainhibitor-nc。每个样品组设3个平行试验组(nc表示相应制剂的阴性对照组)。其中，mirnamimic/mirnamimic-nc的转染浓度为100nm，mirnainhibitor/mirnainhibitor-nc的转染浓度为200nm。

(3)细胞rna提取

加1ml/孔裂解液mz裂解细胞，用枪吹打，使细胞充分裂解；室温放置匀浆样品5min，确保核酸蛋白物完全分离；4℃12000rpm，离心5min，取上清，将其转至一个新的无rnase的离心管中；加入200ul氯仿，充分震荡15s，室温静置5min；4℃12000rpm离心15min，样品分层，取水相层转移至新的无rnase的离心管中，注意转移量；根据转移量，缓慢加入转移体积的0.43倍无水乙醇，混匀；将混匀液转至吸附柱mirspin中，室温12000rpm离心30s保留流出液；缓慢加0.75倍流出液体积的无水乙醇，混匀；将所得溶液及沉淀一起转至吸附柱mirelute中，室温离心30s，弃废液，保留吸附柱；向吸附柱mirelute中加500ul去蛋白液mrd，室温静置2min，12000rpm，离心30s，弃废液；加入500ul漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心30s，弃废液；重复前一步骤；将吸附柱mirelute放置于新的2ml收集管中，室温12000rpm离心1min，去废液；将吸附柱mirelute放于新的rnasefree1.5ml离心管中，向吸附柱mirelute中心滴加30ulrnase-freeddh2o，室温静置2min，12000rpm离心2min；重复上步操作一次；标注样品名称、提取时间；将提的细胞rna置于-80℃保存待用。

3、mirnacdna第一链合成

采用加a法进行mirna第一链cdna的反转录。具体操作步骤参照天根生化科技有限公司的mircute增强型mirnacdna第一链合成试剂盒说明书进行：

(1)反转录体系的配制(冰上操作)：totalrna4ul；2×mirnartreactionbuffer10ul；mirnartenzymemix2ul；rnase-freeddh2o4ul(totalrna为上一步骤所提取的细胞rna，其余试剂为试剂盒自带)。

(2)反转录程序：42℃，6min；95℃，3min。

(3)将合成的cdna置于-20℃保存。

4、rt-qpcr

mirna-29a的上游引物由天根生化科技(北京)有限公司合成，上游引物为mirna-29a：gcaccatctgaaatcggttgt。下游通用引物由天根生化科技有限公司的mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒自带。检测mirna的表达量以湖羊u6基因作为内参。具体操作步骤如下：

(1)用rnase-freeddh2o将cdna稀释4倍备用；

(2)冰上配制反应体系(20ul体系)：2×mircuteplusmirnapremix10ul(试剂盒自带)；上游引物(f)0.4ul；下游引物(r)0.4ul；mirna第一链cdna1.0ul；ddh2o8.2ul。

(3)反应条件：

5、数据分析

采用spss16.0、excel对数据进行差异显著性分析(*表示p<0.05，差异显著；**表示p<0.01，差异极显著)，采用graphpadprism6作图(见图1)。

6、结果

在湖羊肌卫星细胞中转染mirna-29amimic/mimic-nc、mirna-29ainhibitor/inhibitor-nc后，肌卫星细胞中内源性mirna-29a的表达量均得到提高或抑制，mirna-29a模拟物和抑制物可用于后续实验。

实施例2双荧光素酶报告基因检测

1、yap1目的片段载体构建

设计包含限制性内切酶位点的上下游引物(其序列如seqidno.3、seqidno.4所示)，该引物扩增总长度为535bp。

具体步骤如下：

(1)pcr反应体系(20ul)：2×gc10.5ul，dntpmix4ul，上、下游引物(其序列如seqidno.3、seqidno.4所示)(10um)各1ul，la酶0.2ul，dna模板1ul(约100ng)，用灭菌水补足20ul体系。反应条件为(降落pcr)：95℃5min预变性，循环内94℃10s变性，从62℃每个循环降1℃退火，72℃延伸45s，33个循环；72℃继续延伸10min；扩增产物置于4℃冰箱保存。pcr反应完，取5ulpcr产物进行1.5％琼脂糖电泳分析。

(2)按照天根生化科技(北京)有限公司的dna纯化回收试剂盒说明书进行产物纯化。

(3)用限制性内切酶hindш，miui对上述产物和载体进行双酶切，酶切反应体系为：10×h缓冲液2ul，dna约2ug，内切酶(10u/ul)各1ul，灭菌去离子水补足到20ul，反应条件37℃，30min；85℃，5min。

(4)酶切后回收纯化酶切产物。按照dna纯化回收试剂盒说明书进行纯化。

(5)将回收产物与pmirna-reporttm载体(购自广州锐博生物科技有限公司)连接。连接反应体系为：目的片段dna1ul(约150ng)，载体1ul(约80ng)，2×sosoomix(北京擎科sosoo重组克隆试剂盒携带)5ul，灭菌去离子水补足到10ul，50℃连接15min。

(6)取连接产物2ul加到100uldh5α感受态细胞(购自takara公司)中混匀，冰浴25min；将上述转化液置于42℃水浴45s，取出后立即置于冰浴中放置2min；向其中加入500ul37℃预热的lb培养基(不含抗生素)，150rpm、37℃振荡培养1h；混匀菌液，取适量加到含amp抗生素的lb固体琼脂培养基上(抗生素浓度100ug/ml)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12～16h。

(7)挑取上述平板上的单菌落，溶到10ml完全培养基中，37℃置培养箱中培养12～16h。取1ul做模板，进行pcr。反应体系设计参考步骤(1)。pcr反应完，取5ulpcr产物进行1.5％琼脂糖电泳分析。

(8)将阳性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序进一步鉴定。

(9)参照天根生化科技(北京)有限公司的无内毒素质粒大提试剂盒说明书，将测序成功的质粒进行大提，用于细胞转染实验。

2、靶基因yap1的3’utr上mirna-29a结合位点突变

利用pcr突变的方法，在野生型载体基础上，设计突变引物的靶序列：

oar-yap1-mutant-f：cagcaccgtgatgtctgaaggacatggtg

oar-yap1-mutant-r：caccatgtccttcaatccacacggtgctg

具体步骤如下：

(1)突变分段pcr

以野生型载体为模板，分别扩增含突变序列的两段序列。反应体系设计及反应条件参考本实施例步骤中yap1目的片段载体构建部分，然后4℃保存。

pcr反应完取pcr产物进行1.5％琼脂糖电泳分析并纯化回收。按照dna纯化试剂盒说明书进行纯化产物。

(2)突变两段拼接

反应体系设计为10ul总体系，具体参考本实施例步骤中yap1目的片段载体构建载体连接部分，然后4℃保存。

(3)拼接后pcr

反应体系设计为20ul，总体系与反应条件参考本实施例步骤中yap1目的片段载体构建部分，然后4℃保存。pcr反应完取pcr产物进行1.5％琼脂糖电泳分析并纯化回收。按照dna纯化试剂盒说明书进行纯化产物。

(4)用限制性内切酶hindш，ml对上述纯化产物和载体进行双酶切，酶切反应体系如下:10×h缓冲液2ul，dna约1ug，内切酶(10u/ul)各1ul，灭菌去离子水补足到20ul。反应条件37℃，4h。

(5)酶切后回收纯化酶切产物。按照纯化试剂盒说明书进行纯化产物。

(6)将回收产物与pmirna-reporttm载体(购自广州锐博生物科技有限公司)连接，连接反应体系为：目的片段dna2ul(约150ng)，载体1ul(约50ng)，2×sosoomix快速连接液5ul，灭菌去离子水补足到10ul，50℃连接15min。

(7)取连接产物3ul加到100uldh5α感受态细胞(购自takara公司)中，混匀，冰浴30min；将上述转化液置于42℃水浴45s，取出后立即置于冰浴中放置2min；向其中加入500ul37℃预热的lb(不含抗生素)培养基，150rpm、37℃振荡培养1h；取200ul混匀菌液，加到含amp抗生素lb固体琼脂培养基上(抗生素浓度100ug/ml)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12～16h。

(8)将质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序进一步鉴定。

(9)参照天根生化科技(北京)有限公司无内毒素质粒大提试剂盒说明书，将测序成功的突变载体进行大提，用于细胞转染。

3、细胞培养及转染

参照实施例1的方法对湖羊肌卫星细胞进行细胞培养。待细胞生长汇合度达80％时，进行细胞转染。具体转染步骤参照美国promega公司的hdtran-sfectionregeant说明书，按转染试剂：质粒的量＝3：1的比例进行转染。实验分组设置：mirna-29amimic-nc+yap1-wild+prl-tk、mirna-29amimic+yap1-wild+prl-tk、mirna-29ainhibitor-nc+yap1-mutant+prl-tk、mirna-29ainhibitor+yap1-mutant+prl-tk。

4、双荧光素酶检测

细胞转染24h后，按照美国promega公司的dual-gloluciferase-assaysystem试剂说明书进行双荧光素酶报告基因检测，具体步骤如下：

(1)吸弃旧培养基，用1×pbs缓冲液清洗细胞两次，加100ul/孔1×plb裂解液，室温震荡裂解15min，使细胞充分裂解，得到细胞裂解液。

(2)吸取20ul细胞裂解液加到96孔酶标板中，加入100ulluciferasereagent(萤火虫荧光素酶)，检测萤火虫荧光素酶活性。

(3)吸取20ul细胞裂解液加到96孔酶标板中，加入100ulstop&gloreagent(海肾荧光素酶)，检测海肾荧光素酶的活性。

(4)测定荧光素酶活性时采用1～2s延迟和5～10s读数，海肾荧光值与萤火虫荧光值的比值为相对荧光素酶活性，将比值与对照孔的比值进行统计分析，每组实验做3个重复。

5、数据分析

采用spss16.0软件进行独立样本t检验(*表示p<0.05，差异显著；**表示p<0.01，差异极显著)，采用graphpadprism6作图(见图2)。

6、结果

如图2，结果表明mirna-29a的种子区域能与yap1基因的靶标特异位点结合。

实施例3荧光定量检测mirna-29a对yap1及与肌肉相关基因相对表达量的影响

1、总rna提取

按每10cm²面积加1ml裂解液rz收集经转染36小时的湖羊肌卫星细胞，用枪吹打至溶液透明；于室温下静置5min；加200ul氯仿，在振荡器上剧烈震荡15s室温静置3min；4℃，12000rpm离心10min，转移上层水相于新的1.5ml无酶管中；加0.5倍体积无水乙醇，混匀后转入rnase-free吸附柱cr3中，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；加500ul去蛋白液rd，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；加500ul漂洗液rw，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液重复上步操作；将吸附柱放于新的2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min；将吸附柱转入新的1.5ml无酶管中，加50ulrnase-freeddh2o，室温静置2min，4℃，12000rpm离心2min；重复上步操作；标注样品名称、时间，于-80℃保存。

2、cdna第一链合成

参照天根生化科技(北京)有限公司的fastquantcdna第一链合成试剂盒说明书进行(冰上操作)。

(1)配制gdna去除反应体系混合液：

将混合液彻底混匀，并短暂离心后，于42℃放置3min，置于冰上。

(2)配置反转录反应体系：

(3)将步骤(2)的反应液加至步骤(1)的混合液中，充分混匀；

(4)42℃，孵育15min；95℃，3min，置于冰上，用于后续qpcr检测。

3、rt-qpcr

根据ncbi网站上公布的绵羊yap1序列(登录号：100913160)，利用primer3web(http://primer3.ut.ee/)设计上、下游引物。

上游引物：ggactagtccaactatgacgaccaatagctca

下游引物：cgacgcgtcgaaatagtggatgaaagaa

按照takara公司的premixextaqtmⅱ(tlirnasehplus)说明书检测yap1基因的表达量，以绵羊的gapdh基因作为内参，每个样品进行3次生物学重复，具体操作步骤如下：

(1)用rnase-freeddh2o将cdna稀释4倍；

(2)冰上配制pcr反应体系：

(3)pcr反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

4、数据分析

根据rt-qpcr测得的ct值，通过2^-δδct算法计算yap1基因的相对表达情况，利用软件spss16.0进行差异显著性分析，用graphpadprism6软件作图(见图3)。

5、结果

如图3所示，mirna-29a模拟物条件下的yap1及与肌肉相关基因表达量显著高于mirna-29a抑制物条件下的基因表达量。实施例4cck-8法检测mirna-29a在过表达和抑制条件下对湖羊肌卫星细胞增殖的影响

1、细胞培养

将各组转染24小时后的肌卫星细胞用0.25％的胰酶消化，完全培养基终止消化后离心弃培养基，加适量完全培养基制备单细胞悬液，以100ul/孔(约1×104个细胞)接种至96孔板，37℃，饱和湿度，5％co2培养箱进行培养。实验设置空白组(无细胞)、对照组(mirna-29amimic-nc、mirna-29ainhibitor-nc)和实验组(mirna-29amimic、mirna-29ainhibitor)，每组设3个平行孔。

2、细胞处理

分别在培养1、2、3、4天后弃去旧培养基，无菌pbs缓冲液清洗2遍，然后于每孔中加入10ulcck-8溶液(避免产生气泡)，继续置于37℃培养箱孵育2小时。

3、od值测定

用酶标仪在450nm处测定od值，以od值代表肌卫星细胞的相对增殖水平，并绘制细胞增殖曲线(见图4)。

4、结果

如图4所示，与阴性对照组相比，转染mirna-29amimic在1、2、3与4天的湖羊肌卫星细胞增殖水平均极显著低于nc对照(p<0.01)；转染mirna-29ainhibitor1、2、3与4天的湖羊肌卫星细胞增殖水平较nc对照组极显著升高(p<0.05)。由此可知，mirna-29a对湖羊肌卫星细胞的增殖起抑制作用。

实施例5westernblot蛋白检测

1、细胞培养及转染

参照实施例3的方法进行湖羊肌卫星细胞培养与转染。待细胞转染至36h，进行蛋白样品的制备。

2、蛋白样本提取制备

配制冷lysisbuffer：每1ml冷lysisbuffer中加10ul磷酸酶抑制剂(购自碧云天生物技术)，1ul蛋白酶抑制剂(购自碧云天生物技术)、5ul100mmpmsf，混匀，于冰上保存；从细胞培养箱中取出已转染36h的细胞，于净化工作台中吸去旧培养基，加入2ml预冷的1×pbs，振摇数次，清洗细胞两次；用细胞刮刮下细胞，将细胞转移至离心管中，800rpm离心5min，弃废液；每个离心管加1ml冷lysisbuffer，在4℃环境下剧烈振荡30s，冰上放置4min，重复5次；4℃，12000rpm离心5min，吸取上清蛋白提取物，测定蛋白浓度。

3、蛋白含量测定

(1)绘制标准曲线：取酶标板，按下表加入试剂

(2)根据样品数量，按bca试剂a：bca试剂b＝50：1配制bca工作液，充分混匀；

(3)每孔加200ulbca工作液；

(4)将酶标板置于振荡器震荡30s，37℃静置30min，562nm比色测定；以蛋白含量(ug)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；

(5)稀释待测样品，使样品总体积达20ul，加200ulbca工作液，充分混匀，37℃静置30min，以标准曲线0号管做参比，于562nm波长下比色，记录吸光值；

(6)根据所测样品吸光值，在标准曲线上查得相应蛋白含量(ug)，除以稀释液总共体积(20ul)，乘以稀释倍数即为样品试剂浓度(ug/ul)。

4、westernblotting

(1)sds-page的制备

5％浓缩胶(5ml)：30％acr/bis溶液(0.83ml)；1.0mol/ltris-hcl(0.63ml)；10％sds(50ul)；去离子水(3.4ml)；10％过硫酸胺(50ul)；temed(7ul)。

10％分离胶(10ml)：30％acr/bis溶液(3.4ml)；1.5mol/ltris-hcl(2.0ml)；10％sds(100ul)；去离子水(3.8ml)；10％过硫酸胺(100ul)；temed(7ul)。

(2)样品准备和上样电泳

将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度，取等量上样缓冲液于试管中，蛋白量为70g，并于95～100℃5min后冰上冷却上样。电泳条件：浓缩胶恒压80v约20min，分离胶100v约80min。

(3)湿电转移

转膜准备：取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15min。准备滤纸及pvdf膜，分别置入转移缓冲液及去离子水中。

湿电转移：平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、pvdf膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200ma通电，电转移1h。

(4)封闭

pvdf膜在5％脱脂奶粉封闭液中封闭(室温，1h)，弃去封闭液，不洗。

(5)抗体与靶蛋白结合

按照约0.1ml/cm²的量加入5％脱脂奶粉封闭液和适量一抗yap1(1:500)，β-actin抗体(1:4000)。摇床摇荡孵育(4℃，过夜)。pbst漂洗滤膜4次，每次5min。

将pvdf膜与hrp结合的二抗(辣根过氧化酶标记抗体，二抗用封闭液1:5000稀释)室温下摇荡孵育1-2h，然后用pbst充分洗膜，漂洗5次，每次5min。

(6)显影和图像分析

按0.1ml/cm²显影液计算用量，将显影液加于pvdf膜上，室温放置1min。用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)。暗室中迅速将膜蛋白贴在x光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带(见图5)。

4、结果

在转染mirna-29amimic条件下，yap1及与肌肉相关基因的蛋白水平显著高于在转染mirna-29amimic条件下的蛋白水平。

以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的mirna标志物及其检测引物和应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4966

<212>dna

<213>湖羊(ovisaries)

<400>1

cagcgccgcgcccgctgcttcccccgccgcggcccgtcgagccgggccgtccgggcggag60

cccgtgcccgccgggtgaggcaggagccatggatcccgggccgcccccgccacagccagc120

cccccagggccaggggccgccgcccgcacagggcccccagggccagggcccgccgtccgc180

gcctgggcagcccgcgcccccggggcccccggcggctccgcaggccccccccgccggcca240

ccagatcgtgcacgtccggggggactcggagaccgacctggaggcgctcttcaacgccgt300

catgaaccccaagacggccaacgtgccgcagaccgtgcccatgaggctccggaagctgcc360

cgactccttcttcaagcctcccgagcccaaatcccactcccgacaggccagtacggatgc420

aggcaccgctggagcactgactccgcagcacgtgcgggctcactcgtcccccgcgtccct480

gcagctgggagctgtgtctccagggacgctgacccccacgggagtggtctccggcccggc540

agccgcaccggctgctcagcaccttcgacagtcttcctttgagatccctgacgatgtgcc600

tctgccagccggctgggagatggcgaagacatcttctggtcagaggtacttcttaaatca660

catagatcagacaacaacctggcaggaccccaggaaggccatgctctcccagatgaacgt720

caccgccccgaccagcccaccggtgcagcagaacatgatgaattcggcctcgggtcctct780

tcctgacggatgggaacaagccatgactcaggatggagaaatatactatataaaccacaa840

gaacaagaccacctcttggctagaccccaggcttgaccctcgttttggtaaagccatgaa900

ccagagaatcagtcaaagtgctccagtgaaacagccacccccgctggccccccagagccc960

acagggaggagtcctgggtggtggcagttccaaccagcagcaacagatgcggctgcagca1020

gttgcagatggagaaagaaagactgcgactgaagcagcaagaactgcttcggcaggaatt1080

agctctccgtagccagttaccaacactggagcaggatggtgggactcaaaatccagtatc1140

ttctcctgggatgtctcaggaattgagaactatgacgaccaatagctcagatccctttct1200

taacagtggcacctatcactctcgcgacgagagcacagacagcggactgagcatgagcag1260

ctacagcgtccctcggacccccgacgacttcctgaacagtgttgatgagatggatacagg1320

tgacactatcaaccaaagcaccctgccctcccagcagaaccgtttcccagactatcttga1380

agccattcctgggacaaacgtggacctcggaaccctggagggagatgggatgaacataga1440

aggggaggagctgatgccgagcctgcaagaagcgttgagctccgacatcctcaacgacat1500

ggagtctgttttggccgccaccaagctagataaagaaagctttcttacatggttatagag1560

ccctcaggtagactgaattctaaatctgtgaaggatctaaggagataagacctatacctg1620

aaatttccagttaagccaggggcagtcttctggctaatacagaaaaagatgaacaaacgt1680

ccagcaggattctttcatccactattttgctcttcttgtccattgctgctgttaatatat1740

tgctgacctcttccatagttggctctaaggaatcaaaaacaaacttttgtttcttttgct1800

attataactactgtttgttttgggggctggggaaagtgagcctgtttggatgatggatgc1860

cattccttttgcccagttagatgttcaccaatcgttttaactaaatactcagacttggaa1920

gtcaaatgcttcatgtcacagcatttagtttgttcaagcaactgttcttcagctgccttt1980

ggccagtgggaaaacatgacttactggtctaacaagccaaaaatgttgtatctgatgttt2040

agtacttagactgatttgaagagctagctgaaaccaaggctgaagactgttttactttca2100

gtgggttttttttcctcctagtgctatcattagtcacatagtgaccttgattttatttta2160

ggagcttctaaggcttgagataatttccatagaaatatattaattattgccacatactct2220

agtatagattttggtgggttttattgtggggtttttgtttgtttttctttttttttttgg2280

tcttcatcggaatttttattgtcttaggggttttgttttgtttttttcttttttcctcag2340

aatctaaggcaaattaccattgtagtgcatctgtttatacttgtagctcgggacagctat2400

tatagttcctttggtaaatctacatgtcctgggtttttttaccatcttatttaaatcttg2460

gtaatcagctctctttatatatacccacacacacttaataatgtttataatagtgtgata2520

gcagaatgtatctttttttttttagttttccctactttccaatttattttaaaatggtag2580

ctatgaatgtatgcatttagaatacaagactagtagtttatatttcacaaatagtttaaa2640

tccggttggggtagtgtgcagttggtggtggtttagtgttctagaaagggctgttcttat2700

ggatagtgcctccaggagtcttgtatgccctctgggcacacagtggatattatctgctga2760

atttgaaagaagtaaacaagaaatggctttattatcccctttagctttggaagagtacct2820

ttgccttagttttggaagtaaaatctagtagtttagttctcttttataatgaacacatta2880

aacactacattgaaatattgcctacaaaattgtttttacttataagacttgctcctactt2940

ctatatgctgagaatttaccctggatagtatatgggatactgtaaggtcataagttagct3000

ggtaaagtgatcagattaatgtatattactagttgattttagcaaagaaatagagatgat3060

catgattatacttttatttttactggaagagatataactagagtatgtgtctacaggaat3120

aataatgttttccaaagagtatttttaaaggaacaaaatgagcatgaatcaacccttcag3180

tataagctatgaagtaatacttgcttgtgaattacagtggcatcagctagcacctctacg3240

attaagggtctttcagtgtttatagagtaagcccttattttcaagggtttataagacata3300

aaatctctcttttcctggctaaaactgctatgaaaagcctcagcttaggaaaacctcagg3360

tggggtttgttcgtttttttttctgattacaaaatgtaagtattttgacccttcagttta3420

gaggattgcaaaagttggaagtaaagttttatattaggtgatttcagtgctcaaaatgca3480

gtcattgtgttatatatattgattcataggttgatcattcgtaataattgactctaaggc3540

tattattaaaacagcagaaagattaaatcttgaattaagtctggggggaaatggccactg3600

tgcagatagatgtattgatttttttttttagaggaataatgaatttctgcctagaatgca3660

taattgagtttatggatgaatgatacagcatgttggcttttttatatgcagaagatcaaa3720

gctacttagaaggagtgcctacaatttgccattaagccacaaattaagatctcatcttat3780

atatcagcagagtagctttagattaggggaaagggtgggaaaatgggagggggattgtga3840

agatttagtgggaccttgatagagaactttataagcttctttttcttcaataaaaacttg3900

tcttgtatattgctgtcattaaaagcagttgttcctaaaatttcaatcacttaagtacac3960

ccacaaaacaaaaatacggagttcttcattccccctcgatttggatttacccagttatac4020

ctcagtgttgtggcagcaccgtgatgtctgaaggacatggtgctttgacctaatcgtaac4080

cgttgtactgacctgaaggagacctaagcctttctctttctgaatttgaatcacagtctt4140

gatgtggtctttcttgttttttgtccttgttcctaatgtaaaagtgtttaactgcttctt4200

ggttgtattgggtggcattggaataagattttaactgggtattcttgaattgcttttaca4260

ataaaccaattttataatctttaaatttatcagctttttacatttgtgttctttttagtt4320

agggcttattagatctacttatggttgatggagcatattgatttatagtttcagattttc4380

cagagcactatttgttataataactactttctaaacagtagtgctttaaaaaaaattgga4440

aagtaacttttatacaaattatgttgctgttttaagtattcgtactaaatagatgcattt4500

tatatggaaccttggcagaaacactaagattttaaaaataaaactaattgtgtaattcat4560

aatttacactaatcagtgttgaaactcaaacagtgcaaaagtgggaggcaatatccagtg4620

atttacagtttcatagcttctttgcatctgagaaatgaatgctcagatcaactttatctt4680

ccataagcacgtttttacaagaattgtgggtgtgcctatcttaacagttgttttctgtgt4740

cttgacaaaatattctccacattttaaatgttttatattagagaattctttaatgcacac4800

ttgtcaaatatatatatatagtaccaatgttacctttttattttttgttttagatgtaag4860

agcatgctcatatgttaggtacttacataaattgttacattatttttcttatgtaatacc4920

tttttgtttgtttatatggttcaaatatattctttctttaaacgct4966

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>人(homosapiens)

<400>2

uagcaccaucugaaaucgguu21

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caatgaaaagatcctttattaagcttgcctacaatttgccattaagcc48

<210>4

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagctcataggccggcatagacgcgtaatgccacccaatacaacca46

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aucgugguagacuuuagccaa21