用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法与流程

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法。

背景技术：
：

在乳杆菌菌属分类地位上，植物乳杆菌和戊糖乳杆菌同属植物乳杆菌类群，对革兰氏阳性和阴性致病菌有较好的抑制作用，通过与病原菌营养竞争，抑制病原菌的生长。此外，植物乳杆菌能通过胃并定植于肠道发挥有益作用，具有调节肠道微生态的组成的作用。食品应用方面，植物乳杆菌是工业发酵食品中的主要乳杆菌种类，被广泛用于发酵食品的制备，如酸奶、发酵香肠、面包和泡菜等，部分植物乳杆菌可作为生物防腐剂使用。戊糖乳杆菌(l.pentosus)最初被鉴定为植物乳杆菌(l.plantarum)，而后由于分子生物学的发展，利用reca基因序列差异将其重新划分为l.pentosus。戊糖乳杆菌具有特殊的抗菌和益生性质，在食品发酵和保藏过程中起到了重要的作用，且对人体健康具有促进作用。

乳杆菌属内许多种形态特征非常相似，传统生化方法往往无法准确区分。部分菌株16srdna基因序列也具有较高同源性(l.plantarum和l.pentosus具有99％的相似性)，不能实现亚型分类。乌日拉嘎等利用16srrna基因、phes和pyrg部分基因序列对10株植物乳杆菌及其近缘种进行了区分，以其管家基因phes和pyrg部分基因序列作为分子标记，结合ncbi数据库中近缘种的相应序列构建系统发育树并与以16srrna基因构建的系统发育树进行比较，结果发现基于16srrna基因序列不能区分l.plantarum及其近缘种，phes和pyrg部基因序列能够区分植物乳杆菌种及其近缘种，phes用于植物乳杆菌种内分型比pyrg效果更好。将phes和pyrg部分基因序列串联使用，试验菌株与参考菌株的分类关系更加明晰，联合基因(phes-pyrg)可作为16srrna基因辅助用于植物乳杆菌种及近缘种快速分类鉴定。部分学者根据植物乳杆菌共有的reca基因序列设计种间特异性引物，结合巢式pcr技术，可将将植物乳杆菌中l.plantarum和l.pentosus区分开来，但需要二次pcr扩增。此外，有学者利用dnak基因序列比对植物乳杆菌类群进行了分类。

技术实现要素：
：

本发明的目的是提供一种用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子标记。

本发明鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子标记，其核苷酸序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示.

本发明的第二个目的是提供一种鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的鉴定引物组，是以下7对引物中的一对以上的引物组合：

_01473-plant10-f：5'-tgcgactggcgatcattttg-3'

_01473-plant10-r：5'-cacgataacggccgcaattt-3'；

_01473-plant4-f：5'-tctcgcatacgcgactgaaa-3'

_01473-plant4-r：5'-accccgctccgaaataatgg-3'；

pspa_1-plant1-f：5'-cggcaactacctgttagcca-3'

pspa_1-plant1-r：5'-tcggtcggctttagtatcgc-3'；

pspa_1-plant3-f：5'-attagcttcgcggatcggtt-3'

pspa_1-plant3-r：5'-acgctcgtattagctggctc-3'；

pentosus_00679-2-f：5'-cccgtctttaaaccgttcgc-3'

pentosus_00679-2-r：5'-caacgcagcttggtgtttga-3'；

pentosus_00679-4-f：5'-ggtctattccccagtgacgc-3'

pentosus_00679-4-r：5'-cgtatttggcaacgcagctt-3'；

pentosus_01615-8-f：5'-gctcgtgtggatgctactga-3'

pentosus_01615-8-r：5'-aatggtcgaccttcgagtgc-3'。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的试剂盒，其包括pcr反应试剂和上述鉴定引物组。

本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的方法，其包括以下步骤：

提取待检测菌株的基因组dna，以上述鉴定引物组为扩增引物，分别进行pcr反应，观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌，如果出现预期大小的单一条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现目的条带，说明不属于目标菌。

具体是经pcr扩增和电泳检测，以引物_01473-plant10-f，_01473-plant10-r；引物_01473-plant4-f，_01473-plant4-r，引物pspa_1-plant1-f，pspa_1-plant1-r，引物pspa_1-plant3-f，pspa_1-plant3-r进行pcr扩增，分别扩增出280bp、214bp、299bp和410bp的单一目的条带，鉴定为植物乳杆菌；以引物pentosus_00679-2-f，pentosus_00679-2-r，引物pentosus_00679-4-f，pentosus_00679-4-r，引物pentosus_01615-8-f，pentosus_01615-8-r分别出现预期大小的417bp、376bp和233bp单一条带，鉴定结果为戊糖乳杆菌。

所述的pcr反应，其pcr反应体系组成为：浓度为10μmol/l的上、下游靶标dna特异性引物1.0μl，1.5utaqdnapolymerase0.5μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/l的dntp2μl，10×pcrbuffer2.5μl，dna模板2.0μl，补足无菌去离子水25μl。

所述的pcr反应程序，95℃预变性5min；95℃变性1min，55-58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明运用全基因组比对分析技术筛选了植物乳杆菌和戊糖乳杆菌特异分子检测新靶标，针对新分子靶标设计引物进行pcr扩增，可特异性鉴定两种目标菌，目前这些分子标记未见报道。与16srdnapcr方法和生理生化方法相比，本发明建立的方法具有更高特异性，且操作简单，检测周期短，无需进一步测序，检测成本降低，特别适合l.plantarum和l.pentosus快速初筛，为食品生产企业和检测机构提供了重要辅助鉴定方法。

附图说明：

图1是引物_01473-plant4扩增产物电泳图，其中01500bpmarker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；

图2是引物_01473-plant10扩增产物电泳图，其中01500bpmarker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；

图3是引物pspa_1-plant1扩增产物电泳图，其中01500bpmarker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；

图4是引物pspa_1-plant3扩增产物电泳图，其中01500bpmarker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；

图5是引物扩增电泳图，其中引物分别是_01473-plant4(上排左)、_01473-plant10(上排右)、pspa_1-plant1(下排左)、pspa_1-plant3(下排右)，1plant植物乳杆菌、2fer发酵乳杆菌(非目的条带)、3acid嗜酸乳杆菌、4rh鼠李糖乳杆菌、5pen戊糖乳杆菌、6pa副干酪乳杆菌、7单核细胞增生李斯特菌cmcc54004、8金黄色葡萄球菌atcc29213、9蜡样芽孢杆菌cmcc63301、10粪链球菌、11大肠杆菌o157atcc35150、12大肠杆菌atcc25922、01500bpmarker；

图6是引物pentosus_01615-8扩增电泳图，其中01500bpmarker、1-6pe戊糖乳杆菌、7plant植物乳杆菌、8fer发酵乳杆菌、9acid嗜酸乳杆菌、10rh鼠李糖乳杆菌、11cur弯曲乳杆菌、12leu肠膜状明串珠菌、13helv瑞士乳杆菌、14pa副干酪乳杆菌、15单核细胞增生李斯特菌cmcc54004、16蜡样芽孢杆菌cmcc63301、17粪链球菌、18金黄色葡萄球菌atcc29213、19大肠o157atcc35150、20阴性对照；

图7是引物pentosus_00679-2扩增电泳图，01500bpmarker、1-6pe戊糖乳杆菌、7plant植物乳杆菌、8fer发酵乳杆菌、9acid嗜酸乳杆菌、10rh鼠李糖乳杆菌、11cur弯曲乳杆菌、12leu肠膜状明串珠菌、13helv瑞士乳杆菌、14pa副干酪乳杆菌、15单核细胞增生李斯特菌cmcc54004、16蜡样芽孢杆菌cmcc63301、17粪链球菌、18金黄色葡萄球菌atcc29213、19大肠o157atcc35150、20阴性对照；

图8是引物pentosus_00679-4扩增电泳图，01500bpmarker、1-6pe戊糖乳杆菌、7plant植物乳杆菌、8fer发酵乳杆菌、9acid嗜酸乳杆菌、10rh鼠李糖乳杆菌、11cur弯曲乳杆菌、12leu肠膜状明串珠菌、13helv瑞士乳杆菌、14pa副干酪乳杆菌、15单核细胞增生李斯特菌cmcc54004、16蜡样芽孢杆菌cmcc63301、17粪链球菌、18金黄色葡萄球菌atcc29213、19大肠o157atcc35150、20阴性对照；

图9是奶酪中植物乳杆菌鉴定(样品+分离株)，各引物扩增电泳图，m:2000bpmarker、1-2:_01473-plant4、3-4:pspa_1-plant1、5-6:_01473-plant10、7-8:pspa_1-plant3；

图10是酸奶中戊糖乳杆菌鉴定(样品+分离株)，各引物扩增电泳图，m:2000bpmarker、1-2:pentosus_00679-4、3-4:pentosus_01615-8、5-6:pentosus_00679-2。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

(1)序列筛选

从ncbi数据库下载的植物乳杆菌、戊糖乳杆菌及近缘种的全基因组序列。采用软件(pan-genomicsanalysispipeline，pgap)中mp方法进行泛基因组分析，通过本地perl脚本对分析结果进行处理，获得所有菌株的核心基因及非必须基因信息。根据泛基因组分析结果筛选菌株特有的非必需基因，提取乳杆菌及近缘属种特有的非核心基因蛋白序列，通过本地blast分别将其比对乳杆菌的蛋白总库及ncbi非冗余蛋白数据库(nr)。除去匹配的共有蛋白的序列，筛选出植物乳杆菌和戊糖乳杆菌特定标记基因。通过数据库blast比对，验证所筛选的分子靶标属于目标菌特有核苷酸序列，其他非目标菌不含有该基因片段，表明筛选的基因片段具有高特异性。共筛选到4个特异性靶标片段(植物乳杆菌2个，戊糖乳杆菌2个)与文献比对，未见与本研究相同的分子标记。

因此通过对ncbi数据库中植物乳杆菌和戊糖乳杆菌及近缘种的全基因组序列比对筛选，获得植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子检测靶标，包括：

1、植物乳杆菌的靶标序列，其核苷酸序列如seqidno.1和2所示；

2、戊糖乳杆菌的靶标序列，其核苷酸序列如seqidno.3和4所示；

(2)引物设计

提供7套引物pcr鉴定植物乳杆菌、戊糖乳杆菌的检测引物组，该检测引物组对目标菌的新分子靶标具有特异性。

表1植物乳杆菌引物序列

表2戊糖乳杆菌引物序列

(3)鉴定方法

提供一种植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性pcr鉴定方法，以新分子靶标为目的基因，通过pcr法用上述检测引物组对菌体dna进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。

具体步骤如下：

(1)菌株dna提取

将待鉴定菌株于乳酸菌mrs肉汤复苏24h-48h，取1ml细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μl细菌dna提取试剂盒的裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清液备用，该上清液含有细菌的dna，作为模板dna。

(2)pcr扩增

pcr采用25μl反应体系，其中浓度为10μmol/l的靶标dna的上、下游特异性引物1.0μl，1.5utaqdnapolymerase0.5μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/l的dntp2μl，10×pcrbuffer2.5μl，dna模板2.0μl，无菌去离子水补足25μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

(3)pcr反应产物检测

扩增后的pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统uvi观察结果并拍照。观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌。如果扩增出现预期大小的单一目的条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现预期大小目的条带，说明不属于目标菌。

实施例1：植物乳杆菌鉴定

1、细菌dna的提取

取1ml细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μl细菌dna提取试剂盒的裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清液备用，该上清液含有细菌的dna，作为模板dna。

2、pcr扩增

pcr采用25μl反应体系，其中浓度为10μmol/l的靶标dna的上、下游特异性引物1.0μl，1.5utaqdnapolymerase0.5μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/l的dntp2μl，10×pcrbuffer2.5μl，dna模板2.0μl，无菌去离子水补足25μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。

3、电泳观察结果

扩增结束后的pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统uvi观察结果并拍照。如图1、2、3、4、5所示，以引物_01473-plant10-f，_01473-plant10-r；引物_01473-plant4-f，_01473-plant4-r，引物pspa_1-plant1-f，pspa_1-plant1-r，引物pspa_1-plant3-f，pspa_1-plant3-r进行pcr扩增，分别扩增出280bp、214bp、299bp和410bp的单一目的条带，鉴定为植物乳杆菌。这些鉴定结果与maldi-tof质谱鉴定结果一致，证明此方法数据可靠。

实施例2：戊糖杆菌鉴定

1、细菌dna的提取

取1ml细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μl细菌dna提取试剂盒的裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清液备用，该上清液含有细菌的dna，作为模板dna。

2、pcr扩增

pcr采用25μl反应体系，其中浓度为10μmol/l的靶标dna的上、下游特异性引物1.0μl，1.5utaqdnapolymerase0.5μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/l的dntp2μl，10×pcrbuffer2.5μl，dna模板2.0μl，无菌去离子水补足25μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。

3、电泳观察结果

扩增结束后的pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统uvi观察结果并拍照。如图6、7、8所示，以引物pentosus_00679-2-f，pentosus_00679-2-r，引物pentosus_00679-4-f，pentosus_00679-4-r，引物pentosus_01615-8-f，pentosus_01615-8-r分别出现预期大小的417bp、376bp和233bp单一条带，鉴定结果为戊糖乳杆菌，这一结果与maldi-tof质谱鉴定一致。

实施例3：实际样品中植物乳杆菌和戊糖乳杆菌鉴定

1、样品处理

市场销售的奶酪、酸奶样品，取1-2g加入到10mlmrs肉汤中，37℃培养48h，取1ml菌液，离心收集菌体，加入50μldna裂解液，充分悬浮混匀，于100℃水浴15min，冰浴3min，12000r/min离心10min，取上清，作为模板dna。另用接种环划线接种mrs平板，37℃培养48h，取单菌落进行dna提取、pcr鉴定和质谱鉴定。

2、pcr扩增

pcr采用25μl反应体系，其中浓度为10μmol/l的靶标dna的上、下游特异性引物1.0μl，1.5utaqdnapolymerase0.5μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/l的dntp2μl，10×pcrbuffer2.5μl，dna模板2.0μl，无菌去离子水补足25μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。

3、电泳观察结果

pcr产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统uvi观察。如图9所示，以引物_01473-plant10-f，_01473-plant10-r；引物_01473-plant4-f，_01473-plant4-r，引物pspa_1-plant1-f，pspa_1-plant1-r，引物pspa_1-plant3-f，pspa_1-plant3-r进行pcr扩增，分别扩增出280bp、214bp、299bp和410bp的单一目的条带，表明样品中存在植物乳杆菌。

如图10所示，以引物pentosus_00679-2-f，pentosus_00679-2-r，引物pentosus_00679-4-f，pentosus_00679-4-r，引物pentosus_01615-8-f，pentosus_01615-8-r分别出现预期大小的417bp、376bp和233bp单一条带，表明样品中存在戊糖乳杆菌，这些鉴定结果与maldi-tof质谱鉴定一致。

序列表

<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120>用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>867

<212>dna

<213>植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)

<400>1

atgaaagaaaaacaagtgtttcatatcaatggctatattggtctagtgttagcaatcgca60

tttgtgttagttggcggttggctggtttgggccggtgcgactggcgatcattttgcgagt120

atctttttgggcgcattgctaattattattgcggcctttggggctagttcgctaacaatt180

gtgggccccaacgaggcgcgcgtgttaacattttttggtaagtatatcgggacaattcgt240

gattcagggctgtttatgaccgttccgttaaccagtaagttttccatttcactgcgggtc300

cgcaactttaacagtgccattttaaaagttaatgacctccggggaaatcccgtggaaatt360

gcggccgttatcgtgtttaaagttgttgataccagtatggcactctttgcagtggatgat420

tatgaacaatttgttgagattcaaagtgaatcagcggtgcggcacgtggcctctgaatat480

ccatatgatacgtttgatgacgacaagaagattacgctgcggagtaatccaaccgaagtt540

tctgaccggttaacggaagaacttcaagaacggctaaatgttgcgggggtcgagatcgtt600

gagacacgcttaacgcatctcgcatacgcgactgaaatcgccagtgcgatgttacaacgc660

caacaatcttcggcaattctatctgctcgcaaggtcatcgtggaaggggccgtttcaatt720

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<213>植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)

<400>2

atgacaaccttttacgtggtacgacatggacaaacagtggccaacgcccaaaatttaaaa60

caaggcacgattaatacagccgtcacgcatttgaattcggttggcaagcagcaagcgcaa120

acgttgcacgataagtttgacattagcttcgcggatcggttgatttgtagcccgcttgac180

cggacccaggccacggcggcgattttgaatcaaggccggcaactacctgttagccaggac240

gagcggttattggaaatttcatacggccagtgggatggacaggataacgatcagttgcta300

gcggcctatccgcagtactttgatccacttttacaggacgttttgccaagctacgtggag360

gttgcgacggatggcgagacttttgagcacgtgcaacaacgggtagcagcatttttgaag420

acaacagcacaagcccatccagacgagcagatcattgtcgtgacccatggttttaccgtc480

aaagccatggccttagcgatactaaagccgaccgatccgatgagcttaccggagccagct540

aatacgagcgtcactaaagtaatggtggatgctgtccatggtcgccaatatttagcatat600

tataaccgcctacctcaattctga624

<210>3

<211>783

<212>dna

<213>戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)

<400>3

atgcaaaaacaccgattttatttaaaaggctcggccgcggaagtcgcctggctcaatcgt60

caagcagacgctggctatcaactcactgccattcatggatgcacgtatcaattcgaagcg120

acaccgactgcgaagcacgtggtcgctgaatacttgccgaagacgaccttagacctgatg180

acacccgtctttaaaccgttcgcgacccacgtctttcacgatgatttagcagtggtctat240

tccccagtgacgccggagcagcgggtggtcaatgatgatgcccagtaccggttagctgct300

tatcggcacgcgcgggacgtcgccttgaattggctgaatggctgggtgctcgccatctgg360

ttattgatgagtgccgcgatcgtcttgagttctcaattaaaagcgacaccgctattgacg420

cggattttactgactagtctgggtctgggcgccgctttgatcgtcttgggaatcgtgatt480

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ggtgattattattttgatttaagaacgaccctgagtgaattagagattcgccgcacgatt720

gccaagctagtcgctgataaggacttcacggtcatgtcgtggctcggtttgtattccatt780

tga783

<210>4

<211>738

<212>dna

<213>戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)

<400>4

atggcaaagacagcaatttgcattgtcgatcaacagcgataccaagtcgttgacggcatg60

cgattagaagaattggaatcgggactgcggcagatgatcatggccgatttcccgcaggcg120

cataacagtagttttatttgtagcgagcacctcgtccattatcggctcgccaagatggat180

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accaatgattttaaagtcaattcgatgtctgaagaagaaattcgggtgctgcactcgaag600

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cagatgttaggtgaaattcaagcccaggtcaacgaactgcggcgactgcaaccaaggcgg720

cgccggaatcaaagctag738