一种新棘吻虫属棘头虫的检测鉴定方法与流程

本发明属于传统形态学与分子生物学检测相结合进行鉴定的技术领域，具体涉及一种新棘吻虫属棘头虫的检测鉴定方法。

背景技术：

该新棘吻虫属棘头虫是西藏常见的一种鱼类寄生虫，靠吻部钻入宿主肠黏膜营寄生生活。大量寄生可破坏宿主肠壁，引发炎症，危害鱼类健康，甚至可引起肠穿孔、肠道堵塞，使鱼体消瘦，引发各种疾病，严重时可引起鱼类死亡。渔业发展伴随着与鱼类各种疾病的抗争，必须对所感染的寄生虫做出准确鉴定，才能够制定合理有效的治疗方案，这是水产养殖业持续健康发展的基础和前提。

形态鉴定是寄生虫鉴定的常用方法，但同属的寄生虫在形态上往往较为相似。目前在西藏土著鱼类中就发现了同为新棘吻虫属但是不同种的棘头虫，通过形态并不能准确将各个种区分开来，也就是说，对于西藏土著鱼类寄生的新棘吻虫属的物种，仅通过形态并不能精确区分和鉴定各个种，需要辅以分子生物学的方法加以验证。

目前该棘头虫还没有特异性引物用于分子生物学鉴定，而通用引物是针对某个科或属已知种类的某个基因的碱基序列高度保守的区域设计的，因而采用通用引物进行测序就可能出现同属不同种间的测序结果一致性达到99%以上的情况，根据这个结果将不同种判定为同种，出现鉴定错误。也就是说，采用通用引物鉴定不能完全有效并准确的区分物种，物种无法确定，有针对性的保护和防治工作也无法顺利开展。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新棘吻虫属棘头虫的检测鉴定方法，该鉴定方法具有实验结果准确可靠的优点。

本发明采用的技术方案是：

一种新棘吻虫属棘头虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：

a、根据形态特征，采集鱼类宿主中的新棘吻虫属棘头虫；

b、提取虫体样本的dna；

c、进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取dna的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行pcr扩增；

d、将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为该新棘吻虫属棘头虫。

本发明所述新棘吻虫属棘头虫的形态特征，白色或淡黄色，体表光滑无棘，外形似香蕉，略向腹面弯曲，身体后部略细于身体前部，体长是体宽的3倍以上，雌虫大于雄虫。体壁可见椭圆形巨核，腹面1个，背面4~5个吻短而小，呈膨大的球状。吻钩呈螺旋状排列，3排，每排6个，共18个；第一行吻钩较宽大，第二、三行吻钩等大，小于第一行吻钩。吻腺两根，呈棒状，一根有巨核1个，另一根有巨核2个；吻腺在个体间的长度存在较大差异，长的可超过躯干中部，短的不及躯干中部。雌虫体腔内可见椭圆形卵，分散排布；体腔底端可见棒棒糖状的生殖系统。雄虫的2个睾丸相连，位于躯干中部略偏下位置；睾丸下方为黏液腺，呈合胞体结构，其上分布有大核；黏液贮囊颜色较深，有时与黏液腺重叠，有时位于黏液腺下方，并伸出一条同样颜色的黏液腺管，其两侧为白色的贮精囊；雄虫交接囊可伸出体外，呈钟罩状。

本发明所述虫体样本的采集方法，刮取鱼类消化道的内容物和粘液，置于玻璃板中，并用同样大小的玻璃板挤压，使内容物和粘液分散展开，采用便携式解剖镜观察虫体形态并采集该棘头虫。

优选地，所述玻璃板的大小为10*10cm，大小适于所使用的便携式解剖镜。

本发明采用its特异性引物和cox1特异性引物分别进行pcr扩增，得到的pcr产物经序列比对，一致性均达99%以上即可确认。

优选地，所述its特异性引物为：

上游引物：5＇-actgtttctgcctttgtgcg-3＇

下游引物：5＇-aacattacaacatcatcacagc-3＇。

用于序列比对的its间隔转录区基因序列为seqid：no.5。

优选地，所述cox1特异性引物为：

上游引物：5＇-catggttgtaaccaggcac-3＇

下游引物：5＇-caacaccaccaacaacggc-3＇。

用于序列比对的cox1基因序列为seqid：no.6。

本发明的有益效果在于：

1、该方法可以非常精确的从西藏土著鱼类中寄生的新棘吻虫属不同种棘头虫中区分出该种，解决了仅依靠形态鉴定对该属不同种间难以区分的问题。

2、在对西藏寄生虫的深入研究中发现，由于线粒体的某些基因进化速度过快，出现了同一物种的同一线粒体基因序列变异较大的现象，所以再加测间隔转录区基因its，将结果与cox1基因测序结果进行互相佐证，可进一步提升鉴定的准确率。

3、该鉴定方法适用于西藏土著鱼类寄生该新棘吻虫属棘头虫的检测，准确率显著高于仅靠形态或使用通用引物进行鉴定，具有实验结果准确可靠的优点，便于西藏土著鱼类的养护工作以及人工驯养过程中对该新棘吻虫属棘头虫进行精确鉴定，从而开展有针对性的防治。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测所提取dna质量的条带图；从左至右第1-5条条带是黑斑原鮡消化道中寄生该新棘吻虫属棘头虫不同个体的dna，第6-8条是高原裸鲤消化道中寄生该新棘吻虫属棘头虫不同个体的dna，第3条是marker。

具体实施方式

为了更加清楚、详细地说明本发明的目的技术方案，下面通过相关实施例对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为具体说明本发明的实施方法，并不限定本发明的保护范围。

实施例1

一种新棘吻虫属棘头虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：

a、根据形态特征，采集鱼类宿主中的新棘吻虫属棘头虫；

b、提取虫体样本的dna；

c、进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取dna的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行pcr扩增；

d、将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为该新棘吻虫属棘头虫。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上：

所述虫体样本的采集方法，刮取鱼类消化道的内容物和粘液，置于玻璃板中，并用同样大小的玻璃板挤压，使内容物和粘液分散展开，采用便携式解剖镜观察虫体形态并采集该棘头虫。

所述玻璃板的大小为10*10cm，大小适于所使用的便携式解剖镜。

实施例3

本实施例在实施例1的基础上：

所述新棘吻虫属棘头虫的形态特征，白色或淡黄色，体表光滑无棘，外形似香蕉，略向腹面弯曲，身体后部略细于身体前部，体长是体宽的3倍以上，雌虫大于雄虫。体壁可见椭圆形巨核，腹面1个，背面4~5个。吻短而小，呈膨大的球状。吻钩呈螺旋状排列，3排，每排6个，共18个；第一行吻钩较宽大，第二、三行吻钩等大，小于第一行吻钩。吻腺两根，呈棒状，一根有巨核1个，另一根有巨核2个；吻腺在个体间的长度存在较大差异，长的可超过躯干中部，短的不及躯干中部。雌虫体腔内可见椭圆形卵，分散排布；体腔底端可见棒棒糖状的生殖系统。雄虫的2个睾丸相连，位于躯干中部略偏下位置；睾丸下方为黏液腺，呈合胞体结构，其上分布有大核；黏液贮囊颜色较深，有时与黏液腺重叠，有时位于黏液腺下方，并伸出一条同样颜色的黏液腺管，其两侧为白色的贮精囊；雄虫交接囊可伸出体外，呈钟罩状。

实施例4

本实施例在实施例1的基础上：

采用its特异性引物和cox1特异性引物分别进行pcr扩增，得到的pcr产物经序列比对，一致性均达99%以上即可确认。

实施例5

本实施例在实施例4的基础上：

所述its特异性引物为：

上游引物：5＇-actgtttctgcctttgtgcg-3＇

下游引物：5＇-aacattacaacatcatcacagc-3＇。

用于序列比对的its间隔转录区基因序列为seqid：no.5。

实施例6

本实施例在实施例4的基础上：

所述cox1特异性引物为：

上游引物：5＇-catggttgtaaccaggcac-3＇

下游引物：5＇-caacaccaccaacaacggc-3＇。

用于序列比对的cox1基因序列为seqid：no.6。

实施例7

用剪刀剪开黑斑原鮡的消化道（包括胃和肠道），以及高原裸鲤的消化道（仅有肠道），根据该新棘吻虫属棘头虫形态特征，分别采集疑似虫种样本，用0.65%氯化钠溶液清洗干净后，保存于纯酒精中。

dna提取

将虫体从纯酒精中取出，用蒸馏水冲洗干净后放入pcr管中，将多余蒸馏水吸干，使用组织细胞基因组dna快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）对样品的dna进行提取。提取完成后，通过凝胶电泳检测dna质量，见图1，未发生降解，也未混有其他杂质，可进行后续实验。操作步骤严格按照试剂盒说明进行。

特异性引物设计

对西藏水产研究所采集到的该新棘吻虫属棘头虫its间隔转录区序列的可变区进行分析，同时利用已获得的近源寄生虫，通过clustalx进行比对后，选择与同属其他物种存在较大区别的区域设计引物，设计的引物即为针对该可变区的特异性引物，对该新棘吻虫属棘头虫具有高特异性。通过该引物，成功扩增出该新棘吻虫属棘头虫的碱基序列seqid：no.5用于该棘头虫的测序后的比对鉴定。

its特异性引物为：

上游引物：5＇-actgtttctgcctttgtgcg-3＇

下游引物：5＇-aacattacaacatcatcacagc-3＇。

cox1设计方法同上，成功扩增出该新棘吻虫属棘头虫的碱基序列seqid：no.6用于该棘头虫的测序后的比对鉴定。cox1特异性引物为：

上游引物：5＇-catggttgtaaccaggcac-3＇

下游引物：5＇-caacaccaccaacaacggc-3＇。

pcr鉴定

离心机、pcr仪、恒温水浴锅、冰箱、六一电泳仪电源、移液器（10μl，100μl，1000μl）、吸头（10μl，100μl，1000μl）、pcr反应管；rtaqpolymerase(250u,takara)、ddh2o。

pcr扩增反应体系及条件的确定反应体系总体积:20µl

包括:

7.4µl双蒸水

10µl2×pcr缓冲液(mg2+,dntpplus,takara,dalian,china)

0.6µl每种引物

0.4µlrtaq聚合酶(250u,takara)

1µlofdna模板。

扩增条件:

98°c预变性2min

循环40次:

98°cfor10s

48–60°c*for15s

68°cfor1min/kb

最后68°c延伸10min。

用1×tae电泳缓冲液配制1.0%的琼脂糖（含100μl/l荧光染料），在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚好没过胶面，将5μlpcr产物加入样品孔内，电泳时以dlmarker2000作为对照，调节电压至120v，电泳0.5h；凝胶成像仪下观察电泳结果，阴性对照样本为蒸馏水，拍照并记录结果。检查到目的条带，送生工（生物工程(上海)股份有限公司）测序后跟基因序列seqid:no5和seqid:no6进行比对。黑斑原鮡的its与cox1测序结果一致性达99%，高原裸鲤的its与cox1测序结果一致性达99%，确认为该新棘吻虫属棘头虫。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110>西藏自治区农牧科学院水产科学研究所

<120>一种新棘吻虫属棘头虫的检测鉴定方法

<130>2020

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>its上游引物()

<400>1

actgtttctgcctttgtgcg20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>its下游引物()

<400>2

aacattacaacatcatcacagc22

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>cox1上游引物()

<400>3

catggttgtaaccaggcac19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>cox1下游引物()

<400>4

caacaccaccaacaacggc19

<210>5

<211>100

<212>dna

<213>新棘吻虫属棘头虫(neoechinorhynchus)

<400>5

actgtttctgcctttgtgcggtttcagtgcgtaatgtggggtgctttcatagtgtgtgcg60

tggtttgaatataccacggctgtgatgatgttgtaatgtt100

<210>6

<211>362

<212>dna

<213>新棘吻虫属棘头虫(neoechinorhynchus)

<400>6

catggttgtaaccaggcacgctattataatagtgttttttcttgttatgcctttgtttat60

aggggctttgggaaacatgttaacccctttgatagtgggtttagaggatatggtgtttcc120

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