一种高镉抗性大型真菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于重金属污染修复
技术领域：
，具体涉及一种高镉抗性大型真菌菌株及其应用。
背景技术：
：随着现代工业化的快速发展，我国土壤、水体均受到重金属污染，其中，镉是重金属污染中最主要的元素之一。镉是一种剧毒污染物，近几年，我国已经发生了多起镉污染事件，严重影响人类健康。近年来，利用生物技术修复含镉土壤或水体越来越受到关注，其较化学和物理修复方法更为安全环保且廉价。目前对含镉土壤或水体的生物修复主要依靠植物品种，通过筛选培养高镉抗性的植物品种，利用其生长过程对镉元素的吸收使土壤中的镉含量降低，从而实现对含镉土壤或水体的修复。而同时具有高效重金属富集特性和高生长速度的植物品种较少，且其筛选和培养过程一般耗时较长，成本较高。现有研究将大型真菌用于修复含镉土壤或水体，大大缩短了修复时间，但是由于菌株耐受及富集能力的限制，修复效率有待进一步提高。因此，急需一株抗性强吸附能力强的新型大型真菌用于修复含镉土壤或水体，以降低土壤或水体中的镉含量。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高镉抗性大型真菌菌株及其应用，将该菌株用于修复含镉土壤或者水体，其效果较佳，且成本低。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：采用cd浓度梯度定向诱变的方法获得一种高镉抗性大型真菌菌株，该菌株命名为糙皮侧耳(pleurotusostreatus)pleu-jn21-2f1，于2020年08月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20239。本发明还提供了上述大型真菌菌株pleu-jn21-2f1在修复含镉污染土壤或水体中的应用。当用于含镉土壤时，可将大型真菌菌株pleu-jn21-2f1发满菌丝的培养基质(菌棒)埋入土壤中进行出菇管理，随菌体生长，重金属被富集进入菇体及培养基质(菌棒)中，最终通过收获菌棒和菌体移除重金属，即可起到修复的作用；当用于水体修复时，也可以直接将培养获得的菌丝直接加入水体中，即可起到修复的作用。具体如下：当修复含镉土壤时，将大型真菌菌株pleu-jn21-2f1接种于固体pda培养基中进行活化，将活化后的菌丝体接种于栽培基质中培养，获得菌棒，将菌棒进行原基诱导，待原基出现后将菌棒移入含镉土壤中进行出菇管理。当修复水体时，将大型真菌菌株pleu-jn21-2f1接种于固体pda培养基中进行活化，在活化后的菌块重新接种于液体pda培养基中，获得菌丝球，将菌丝球直接加入含镉水体中，即可起到修复作用。本发明提供的高镉抗性大型真菌菌株及其应用，具有以下有益效果：用本发明提供的大型真菌菌株pleu-jn21-2f1去修复含镉土壤或水体，其操作过程简单，成本低，该菌株对镉的富集效果好，可以提高土壤或水体修复的效率。附图说明图1为同心圆盘cd梯度培养基。图2为抗性突变初选菌株与原始菌株cd胁迫下对比培养结果图。图3为突变菌株issr分析结果图。图4为原始菌株与高cd抗性突变菌株2f1生长曲线图。图5为不同cd浓度下，原始菌株与高cd抗性突变菌株2f1的生长情况。具体实施方式实施例1一、试验方法1、供试菌株本发明使用的原始菌株为实验室前期筛选获得的一株高镉抗性平菇菌株，其于2018年7月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmccno.16084。2、菌种活化将供试菌株转接在固体pda培养基上，于28℃活化培养，连续转接3次。其中，1l固体pda培养基含马铃薯浸粉3g、葡萄糖20g、琼脂粉15g，最终调ph至6.0±0.2。3、重金属母液的配制精确称取10.16gcdcl2·2h2o溶于10ml去离子水(试剂为分析纯)，过0.22μm的滤膜(以去除水中微生物)，得到浓度500g/l的重金属母液，4℃保存，备用。4、定向诱变及cd抗性突变菌株的初级筛选定向诱变采用同心圆盘cd浓度梯度培养基(见图1)，其制作方法如下：(1)准备灭菌的培养皿(直径19cm)；准备大小不同的可灭菌的圆环状模具，用于同心圆培养基制作时的模具及不同培养基间的隔离，并高温高压灭菌。(2)配制pda培养基，121℃高压灭菌20min，待培养基冷却到65℃左右加入不同体积的重金属母液，配制成含cd浓度为0、20、80、160、240mg/kg的培养基。(3)同心圆盘培养基制作：在灭菌的培养皿底部先倒入一薄层不含cd的固体培养基，待培养基凝固后以培养皿中心为圆心在薄层培养基中插入不同直径的灭菌的圆环模具，并从中心圆到外侧圆环依次倒入cd浓度为0、20、80、160、240mg/kg的培养基，做成同心圆cd梯度诱变培养基。底部的薄层固体培养基可防止不同培养基在倒入培养皿时因底部封闭不严外流而造成培养基间污染。同时为了避免底部封口培养基因长时间大面积受热而溶解，采用待一种培养基凝固后再倒入另一种培养基的方式。培养基全部凝固后，将模具圆环取出。(4)已活化的菌株cgmccno.16084(前期实验证明该菌株在160mg/kgcd下不能生长)取0.5cm的接种块接种于同心圆培养基的中心位置，28℃避光培养，使菌丝向边缘延伸。当有菌丝延伸到最边缘最大cd浓度时诱变结束。(5)当有菌丝或菌落扩增到含高于原菌株最大耐受浓度诱变剂的培养基时，沿圆环圆心向外边缘突出点辐射划线，沿线每个浓度取直径0.5cm的菌块接种于cd160mg/kg的pda培养基上，初步筛选抗性增强菌株，将初步选出的突变菌株接种于cd浓度为120mg/kg的pda培养基上，同一培养皿中同时接种原始菌株，28℃避光培养20d。如果能够生长且明显优于原始菌株则初步判定为抗性增强的阳性突变菌落。5、抗镉阳性突变菌株分子鉴定issr(简单重复序列间扩增，intersimplesequencerepeat)分子鉴定用以确定基因结构发生变异的突变株。具体操作如下所示。将所有阳性突变子在160mg/kgcd的pda平皿连续转接两次，待性状稳定后，对每个阳性菌株及原始菌株(cgmccno.16084)菌丝dna提取(植物基因组dna提取试剂盒dp305,tiangen)，采用不同的issr引物序列，以原始株和突变株的dna为模板，pcr扩增以获得基因结构发生变异的突变株。issr引物序列如下表所示。表1菌株issr引物序列6、高镉抗性阳性突变菌株评价6.1抗cd突变株生长曲线测定将确定的高cd抗性突变株在普通pda平皿中活化培养后，取0.5cm的接种块接种于普通pda培养基平皿(内径8.5cm)中央，以原始菌株作为对照，每个菌株设置三个重复，28℃避光培养。每天观察菌丝生长情况，记录菌落直径，直至菌丝布满平板为止。绘制菌株生长曲线，确定生长速度。6.2cd最大耐受浓度评价最大耐受浓度指菌丝体对某种重金属的耐受临界浓度，即在最大耐受浓度时，菌丝体有生长，略高于该浓度时，则生长被完全抑制。配制pda培养基，121℃高压灭菌20min，待培养基冷却到65℃左右加入不同体积的重金属母液，配制含cd浓度为0、10、160、240、280、320、360、400、440、480mg/kg的20ml的pda固体平板。将活化的原菌株(cgmccno.16084)与阳性突变株在菌丝生长尖端取0.5cm接种块分别接种于含上述cd浓度的培养皿(内径8.5cm)中，每个浓度每个菌株设置3个重复。28℃避光培养24d，记录各浓度各菌株的菌落直径。二、试验结果1、cd抗性突变株的初步确定通过在cd浓度为160mg/kg的pda培养基中初步抗性筛选，共获得了6株抗性增强的突变子，分别为2f1-3b-2、2f1-3b-9、2f1-3d-1、2f1-3d-2、2f1-3d-3、2f1-3d-7。6株抗性突变株分别与原始菌株在cd含量为120mg/kg的pda培养基中对峙培养20d(见图2，每个培养皿中左为突变株，右为原始株，上面的三个培养基从左到右分别为2f1-3b-2、2f1-3b-9、2f1-3d-1，下面的三个培养基从左到右分别为2f1-3d-2、2f1-3d-3、2f1-3d-7)，突变株菌落直径明显比原始菌株大，说明突变株cd抗性明显增强。2、高cd抗性突变菌株2f1获得通过issr分子鉴定，issr引物p7和p24扩增结果(见图3，a、b图分别为引物p7和p24扩增结果)显示，6个突变株与原菌株相比，电泳条带均有明显的缺失，说明6个菌株均已发生基因结构的变异，并且由于基因结构变异造成菌株cd抗性增强。但是，6个突变菌株间电泳图谱无明显差异，也就是说6个突变株突变位点可能差异较小或相同。因此，我们将此6个突变株视为一株，菌株为平菇，命名为糙皮侧耳(pleurotusostreatus)pleu-jn21-2f1(以下简称2f1)，于2020年08月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20239。3、高cd抗性突变菌株2f1生长速度减慢对获得的高cd抗性菌株2f1生长速度进行测试，构建了该菌株的生长曲线。结果表明，2f1突变株生长速度比原始菌株明显变慢(见图4)。4、突变株2f1cd抗性明显增强实验结果显示(见图5)，原始菌株在cd浓度为160mg/kg时停止生长(接种块直径为0.5cm，如菌落直径为0.5cm则说明菌块无生长)，而突变株2f1在cd浓度为480mg/kg时停止生长，cd抗性较原始菌株增强了3倍。突变株2f1的cd最大耐受浓度为440mg/kg。5、突变株2f1cd抗性高于其他大型真菌平均水平突变株2f1的cd抗性能力(最大耐受浓度440mg/kg)远高于其他大型真菌cd抗性水平，仅低于一株在城市垃圾堆旁分离的菌株pleurotussp.(cd最大耐受浓度700mg/kg)，可能由于该菌株在污染环境下长期进化的结果。表2大型真菌菌丝体cd耐受能力试验例1修复镉土壤一、试验方法1、土壤处理1.1土壤准备土壤风干，磨碎后过2mm的筛子，除去土壤外的杂质。1.2土壤ph测定取5g干土于50ml离心管中，加入25ml超纯水，上下颠倒几次后静置1h，待溶液澄清，ph计测定上清液中ph值。1.3最大持水量测定取50g已准备好的土壤于装有滤纸的漏斗中，漏斗下加软管，软管用夹子夹住。向土中倒入50ml水，水在土中平衡1h后，打开夹子使水自然流出，并收集。待水分不再滴出，收集水分完成。土壤最大持水量＝(最初加水体积-最终收集水体积)/最初土壤质量。1.4土壤cd处理精确称取一定量土壤，加入cd溶液，充分混合，使土壤cd含量分别为0、60、160、240、320、360、400、420、440mg/kg。土壤平衡30天后对各cd浓度土壤进行ph测定后备用。2、菌种准备2.1pda培养基(1l)制作取马铃薯浸粉3g、葡萄糖20g、琼脂粉15g，加900ml蒸馏水混匀，然后调ph至6.0±0.2，再用蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min。2.2菌株活化将经低温保藏的菌株2f1接种到pda培养基中央，28℃避光培养。2.3菌丝体获得在活化后的菌株培养基中取直径0.5cm的接种块接种于pda培养基中，28℃避光培养7天获得菌丝材料。3、菌棒准备3.1栽培基质配方及制作将78％棉籽壳、20％麸皮、1％石膏及1％蔗糖混匀作为栽培基质，再加入栽培基质1.6倍重量的水，充分混匀，自然放置30min使水分充分渗入基质。取少量混好的基质烘干后进行cd含量测定，其余混合后基质分装入130×240×0.045mm的聚丙烯菌袋中，尽量压实，基质中央打孔，扎紧袋口，每袋基质湿重350±5g，121℃高压灭菌100min。3.2菌棒接种及培养待基质冷却后将已培养好的含突变株2f1菌丝体的接种块接种到该基质中，菌袋扎口，28℃恒温避光培养28天，获得栽培菌棒。4、盆栽4.1将发满菌的菌棒移入菇房，菇房温度18℃，湿度80％-85％，适应2天，菌棒在扎口处开口，进行原基诱导。原基诱导温度18℃，湿度80％-85％，每天早晚各通风一次，每次1h，通风时，温度5-8℃，湿度50％左右。带原基出现，进行盆栽处理。4.2盆栽处理选择原基大小一致的菌棒，切去2/3菌袋，移入内径为210×160mm的花盆中，置于花盆中央，花盆其余部分填充cd处理平衡好的土壤，菌棒采用半地下栽培方式，没有去掉菌袋的部分露在外面。每盆加入已平衡好的干土1080g，加水达最大持水量的65％。在距菌棒1cm处的土壤中插入土壤水分采集器，每盆1个，从菌棒入土第一天起到第三茬子实体收割完成止每隔7天取土壤水溶液，每次取5ml，用于土壤水溶液cd含量，每个cd处理浓度设置3个重复。4.3盆栽培养菌棒入土后，进行出菇管理，保持出菇管理。保持出菇房温度18℃，湿度湿度85％-95％，每天早晚各通风一次，每次0.5h。每潮子实体收割完成，对子实体编号并置于烘箱烘干后称重，同时进行下一潮菇的原基诱导及出菇管理。收获三潮子实体后将菌棒在土壤中取出烘干，用于cd含量测定；每盆土壤收集烘干，ph测定。5、cd含量分析取烘干后的每个处理每个收割茬次的子实体、接种前培养基质及收割后的培育基质各0.3g，转移至消解管中，加入8ml65％的硝酸浸泡过夜，置于电热板上消解，加漏斗消解24h后高温赶酸，并补加5ml65％的硝酸继续加热至蒸干。用5ml超纯水溶解，每个样品消解3个重复。cd含量的分析用zeenit700p原子吸收分光光度计火焰法测量。6、数据分析利用spss16.0进行数据分析。采用单因素方差分析进行数据比较，检验标准p＜0.05。二、试验结果1、土壤最大持水量及子实体生长情况经测定土壤的最大持水量为47％。菌棒进入出菇室后，每潮子实体原基诱导需8天，子实体成长需8天。从第一潮子实体现原基后移入土中，到第三潮子实体收割菌棒在土壤中共经历40天。2、试验土壤为碱性土壤，ph为8.6。菌株2f1子实体培养能使土壤ph降低，降低0.5左右。土壤cd处理前和处理后ph无明显差别，但出菇后土壤ph有明显降低，可见该菌株的生长过程能降低土壤ph，增加土壤中有效态的cd，利于菌株对土壤cd的吸收，从而起到修复碱性土壤的作用。3、子实体富集能力随收割潮数的增加而增加，随土壤cd浓度的增大而增大，具体结果见表3。表3不同土壤镉处理浓度下不同潮菇富集镉的量cd浓度(mg/kg)第一潮菇(mg)第二潮菇(mg)第三潮菇(mg)100.0040.0080.0101600.0070.0180.0122400.0090.0210.0132800.0120.0280.0143200.0130.0320.0143600.0150.0380.0164000.0160.0400.0174200.0170.0420.0164400.0200.0450.0174800.0190.0400.015上述每一潮菇富集镉的量是每一潮菇中单个菌棒生产的子实体聚集镉的量。由表3可知，菌株2f1对镉的富集能力随收割潮数的增加而增加，但第三潮菇的富集能力不如第二潮菇，可能是前二潮菇出菇时消耗了培养料中的大量营养物质，导致影响了菌株的整体代谢能力，进而影响了其对镉的富集能力。因本发明菌株2f1对镉有很强的富集能力，因此，其子实体对镉的富集能力随土壤cd浓度的增大而增大。4、菌棒富集能力随土壤中cd含量的增加而增加，土壤镉浓度为160mg/kg，单个菌棒在40天内，富集cd的浓度为12mg/kg；当土壤镉浓度为420mg/kg，单个菌棒在40天内，富集cd的浓度为30mg/kg；当土壤镉浓度为440mg/kg，单个菌棒在40天内，富集cd的浓度为34mg/kg；当土壤镉浓度为480mg/kg，单个菌棒在40天内，富集cd的浓度为32mg/kg。5、土壤水溶液中cd浓度随培养天数的增加呈现先上升后下降的趋势，在32天时达到最大，说明土壤水溶液中的cd为解离态，表明子实体的生长活动能将土壤中螯合态的cd解离出来，以在菌棒和子实体中进行富集，解离到一定程度后由于菌棒和子实体的富集和吸收等因素，土壤水溶液中的cd浓度下降。6、本发明菌株2f1在镉含量分别为0、60、160、240、320、360、400、420、440和480mg/kg的土壤中，依然能保持较好的生长状态，不会影响子实体的生长发育。试验例2菌株2f1在液体中对镉的吸附一、试验方法1、将活化的菌株2f1接种于液体pda培养基中，培养基中添加不同浓度的镉，镉的浓度分别为0、30、60、90、120、140、160mg/l，然后置于28℃暗培养7天，每个浓度设置3个平行，然后取上清液，测定剩余镉浓度，计算移除率。二、试验结果当镉浓度在一定范围内，随着镉浓度的增加，菌株2f1对镉的去除率也会增加，说明菌株2f1对镉有很好的吸附性，但当镉浓度为140mg/l时，菌株2f1对镉的去除率达到最高，其说明菌株2f1在液体中对镉的耐受浓度为140mg/l，具体结果见表4。表4液体培养条件下菌株2f1菌丝对镉的移除率浓度30mg/l60mg/l90mg/l120mg/l140mg/l160mg/l移除率3.5％15.9％20.1％27.8％52.1％——序列表<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心<120>一种高镉抗性大型真菌菌株及其应用<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgcacacacacacac15<210>2<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtgacacacacacac15<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggatgcaacacacacac17<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccagtggtggtggtg15<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agagagagagagagagg17<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gagagagagagagagaac18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7acacacacacacacaccg18<210>8<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8acacacacacacacacc17<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9acacacacacacacacct18<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cacgagagagagagaga17当前第1页12