NDUFB1作为结核病诊断分子标识的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物ndufb1在诊断结核病中的应用。

背景技术：

结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,m.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。活动性结核患者只是结核感染者的冰山一角，从结核分枝杆菌潜伏感染发展到活动性疾病对结核病的传播构成了持久的威胁，因此对人的结核菌感染及发病状态的快速诊断是结核病防控的重要工作。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。

目前，临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、mgit960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如genexpert等检测，是针对样本结核菌dna分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。(二)影像学检查：胸部x线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部ct可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般x线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，tst)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，igra)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。

从宿主应对m.tuberculosis感染相关的机体反应出发，寻找其中特异性变化的基因，是发现新的分子诊断标识的未来趋势和研究热点。ndufb1基因(nadhdehydrogenase[ubiquinone]1betasubcomplexsubunit1)位于人类第14号染色体的q32.12区域，基因表达蛋白编码58个氨基酸，基因序列见参考文献(loeffen,j.l.etal.cdnaofeightnuclearencodedsubunitsofnadh:ubiquinoneoxidoreductase:humancomplexicdnacharacterizationcompleted.1998，biochembiophysrescommun253,415-422)¹。其功能为编码线粒体膜复合物i的呼吸链nadh脱氢酶β亚单位1。有研究报道，在经生育酚治疗后的慢性c肝病人中基因表达量有明显的上升。我们的研究结果显示，相比结核潜伏感染者(ltbi,latenttuberculosisinfection)与非结核感染对照组(hc，healthcontrol)，在活动性结核(activetuberculosis,atb)患者体内，其基因表达量呈上升状态，同时，atb组内的表达量显著高于其他肺部感染(pn，pneumonia)组。因此，该基因可作为活动性结核诊断，鉴别活动性结核其他肺部感染的分子标识。目前尚未发现其与结核病相关的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供分子标记物ndufb1在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。

本发明所述的分子标记物ndufb1，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。

本发明更加详细的描述如下：

检测分子标记物ndufb1表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

检测ndufb1蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。

检测分子标记物ndufb1表达水平方法为荧光定量pcr法。

检测分子标记物ndufb1表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。

其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。

其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。

其中，该试剂盒还包括如下组分：

cd15+细胞特异抗体筛选磁珠(invitrogen.)；

rneasyplusminikit(qiangen.)

superscript^tmivreversetranscriptase(invitrogen.)

taqmandnapolymerase

taqman探针及基因扩增特异引物。

本发明还提供ndufb1在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。

本发明还提供ndufb1在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以ndufb1作为诊断分子标记物。

凡是能够检测体内ndufb1基因含量的检测方法都包含在本发明之内，如本发明提供的以下方法：

(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；

(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；

(3)总rna提取：对中性粒细胞的总rna进行提取；

(4)cdna的合成：对rna进行反转录，得到样本cdna，

(5)实时荧光定量pcr：以cdna为模板，使用ndufb1特异引物，内参引物进行实时荧光定量pcr检测，经过计算即可得到样本中ndufb1基因的含量。

结论：

以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。

本发明还提供相应的检测方法，步骤如下：

1)全血样本处理

按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6ml的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入cd15⁺磁珠(invitrogen，us)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在hulamixer(invitrogen，us)上，4℃，8rpm旋转孵育20min，

2)磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分离液，轻轻吹匀后转移至对应2ml蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，

⑶从磁力架上取下，加入1.6ml分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，

⑷加入350μl的bufferrlt(qiagen,germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，

3)总rna提取

采用rneasyplusminikit(qiagen,germany)对磁珠分选的中性粒细胞总rna进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gdna去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μl70％乙醇，混匀，转移700μl至rneasymini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑶加入700μlbufferrw1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑷加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑸加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，

⑹将rneasymini柱放入标记好编号的1.5ml的ep管，向柱膜中心加入30μl水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得rna冰上放置备用，

4)cdna的合成

取细胞总rna，采用superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)进行反转录，得到细胞样本cdna，

5)实时荧光定量pcr检测ndufb1基因的相对表达量

采用上步中制备的cdna为模板，对ndufb1特异引物对或内参引物对进行实时定量pcr，进而得到各个样本模板中ndufb1基因的相对表达量。其中，实时荧光定量pcr检测ndufb1基因的相对表达量，具体步骤如下：

(1)配制反应体系1和反应体系2

反应体系1(目的基因)为20μl，由qpcr反应多聚酶fastadvancedmastermix，目的基因assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)为20μl，由fastadvancedmastermix，assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。

其中，ndufb1及内参基因特异引物为商业化探针(appliedbiosystems，us)，分别在预配分装的qpcr反应液中加入1ul/孔。充分混匀后，上机，收集数据。

(2)实时定量pcr检测

将步骤(1)配制的各个反应体系在quantstudio^tm6and7flex实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystems，us)上进行实时定量pcr检测。使用2^-δδct法计算各个模板中ndufb1基因的相对表达量。

反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。

(3)统计分析使用graphpadprism6对步骤(2)的结果进行统计分析。

本发明相对于现有技术而言，有益效果在于：

现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断，病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50％；其余病原性阴性患者无法被检出。ndufb1基因可区分活动性结核病患者与结核潜伏感染，活动性结核与非结核感染者，以及活动性结核与其他肺部感染，可以作为活动性结核病诊断的候选生物标志物，故将ndufb1基因申请专利。本发明为结核诊断的宿主分子标识，不限于病原学检测阳性人群，同时能够应用于结核菌病原检测阴性人群的分子诊断，可有效提高临床结核病检出率。

对于说明书中出现的相关术语，在此进行相应的解释和说明：

tb：tuberculosis，结核病

m.tb：mycobacteriumtuberculosis。结核分枝杆菌

tst：tuberculinskintest，结核菌素试验

igra：interferongammareleaseassays，γ干扰素释放试验

atb：activetuberculosis,活动性结核

ltbi：latenttuberculosisinfection，结核潜伏感染者

hc：healthcontrol，非结核感染对照组

pn：pneumonia，肺部感染

cd15：白细胞分化抗原15

hulamixer：hula混匀器

bufferrlt：rlt缓冲液

rneasyplusminikit：rna提取试剂盒

gdna：基因组dna

bufferrw1：rw1缓冲液

bufferrpe：rpe缓冲液

superscript^tmivvilo^tmmastermix:superscript^tmivvilo^tm混合液

cdna：反转dna

fastadvancedmastermix：快速混合液

附图说明

图1、实时定量pcr结果图，

注：tb：活动性肺结核患者；ltbi：潜伏感染者；hc：非活动性肺结核非潜伏感染者；pn：肺炎患者。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。

实施例1、

1.研究对象和方法

1.1.研究对象

研究对象及纳入标准

本研究对象包括atb、ltb、pn及hc。atb组由医院确诊住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(ws288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及x射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；ltbi组为有临床接触史，无临床症状，且igra阳性；pn组，为排除atb，临床确诊的肺部感染(排除病毒性肺炎)；hc组，为体检相关指标正常，igra阴性。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。

样本信息

本研究共收取265例宿主样本，分为4组，包括atb，51例；ltbi，54例；pn，58例及hc，102例。年龄、性别等详细信息见表1

表1.样本人口统计学资料

标本来源

分别抽取上述研究对象的外周血2.5ml，置于含肝素锂抗凝采血管(bdbiosciences，us)，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到外周血标本。

1.2研究方法

磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。

本发明所述的试剂盒，包括以下组分：cd15+细胞富集磁珠及相关试剂，细胞总rna提取分离柱及相关试剂，cdna合成逆转录酶及相关试剂，ndufb1序列扩增特异性引物及实时荧光定量pcr相关试剂。

1.2.1.1全血样本处理

按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6ml的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入cd15⁺磁珠(invitrogen，us)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在hulamixer(invitrogen，us)上，4℃，8rpm旋转孵育20min。

1.2.1.2磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分离液，轻轻吹匀后转移至对应2ml蛋白低吸附管。磁力架上静置2min，吸去上清。

⑶从磁力架上取下，加入1.6ml分离液，轻轻吹匀。磁力架上静置2min，吸去上清。重复1次。

⑷加入350μl的bufferrlt(qiagen,germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用。

1.2.2总rna提取

采用rneasyplusminikit(qiagen,germany)对磁珠分选的中性粒细胞总rna进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gdna去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μl70％乙醇，混匀。转移700μl至rneasymini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑶加入700μlbufferrw1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑷加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑸加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min。

⑹将rneasymini柱放入标记好编号的1.5ml的ep管，向柱膜中心加入30μl水，静置1min。12,000rpm，离心1min，所得rna冰上放置备用。

1.2.3cdna的合成

取细胞总rna，采用superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)进行反转录，得到细胞样本cdna。

1.2.4实时荧光定量pcr检测ndufb1基因的相对表达量

采用步骤1.2.3中制备的cdna为模板，对ndufb1特异引物对或内参引物对进行实时定量pcr，进而得到各个样本模板中ndufb1基因的相对表达量。具体步骤如下：

(1)配制反应体系1和反应体系2

反应体系1(目的基因)为20μl，由qpcr反应多聚酶fastadvancedmastermix，目的基因assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)为20μl，由fastadvancedmastermix，assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。

(2)实时定量pcr检测

将步骤(1)配制的各个反应体系在quantstudio^tm6and7flex实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystems，us)上进行实时定量pcr检测。使用2^-δδct法计算各个模板中ndufb1基因的相对表达量。

反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。

(3)统计分析使用graphpadprism6对步骤(2)的结果进行统计分析。

2.研究结果

将定量pcr结果处理后，使用graphpadprism6对数据进行分析，结果见图1.由图可见，与ltbi和hc组相比，活动性结核病组的ndufb1基因的相对表达水平升高，差异显著(p<0.0001)。同时，与肺炎组相比，活动性结核组中检测的基因表达量显著升高(p<0.01)。

实施例2、试剂盒

本发明的试剂盒由以下成分组成：

1.特定细胞富集抗体标记磁珠，dynabeadscd15(invitrogen，us)

2.细胞总rna提取试剂盒，rneasyplusminikit(qiagen,germany)

3.cdna反转录酶，superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)

4.qpcr荧光定量pcr检测体系，包括pcr多聚酶，缓冲体系，以及assayndufb1外显子区域特异性检测引物及探针。

本发明首次报道基于人体外周血内所包含的特定细胞ndufb1基因表达量变化的检测，相比外周血全血相关基因表达变化检测更加灵敏和特异。通过系列商业化试剂的组合和流程优化，使该基因作为结核病分子诊断标识具有可能性和实用性。

参考文献：

1loeffen,j.l.etal.cdnaofeightnuclearencodedsubunitsofnadh:ubiquinoneoxidoreductase:humancomplexicdnacharacterizationcompleted.biochembiophysrescommun253,415-422,doi:10.1006/bbrc.1998.9786(1998).