CARD16做为分子标识用于结核的诊断与鉴别的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物card16在诊断结核病中的应用。

背景技术：

结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，m.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病。在全球，每年有逾千万结核新发病例，130万死亡病例。同时，有近四分之一的人感染结核分枝杆菌并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％的人群可能会在一生中发展为活动性结核病(activetuberculosis,atb)。活动性结核患者只是结核感染者的冰山一角，从结核分枝杆菌潜伏感染发展到活动性疾病对人类健康构成了持久的威胁，因此对结核感染及活动性结核的快速诊断是阻断结核病防控的重要组成部分之一。由于结核分枝杆菌自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前，活动性结核诊断主要依据病原学检测方法，针对结核分枝杆菌组分的检测被认为是结核诊断的“金标准”，但临床中仍有相当比例的菌阴结核患者无法被检出。而其他辅助诊断方法也有各自的使用局限性，如人体影像学诊断存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷；针对宿主的免疫检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，tst)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，igra)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要建立可用于结核病早期诊断的新方法，而新的特异性生物标识物的发现成为建立新方法的关键。

目前结核病毒诊断方法有：(一)病原学检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6－8周，应用受到限制。(二)ⅹ射线检查：胸部ⅹ线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部ct可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)肺结核病免疫学诊断：1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(ppd)试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，也容易出现假阳率。3.bactec法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。5.聚合酶链反应(pcr)，优点是敏感性可达98％-100％，缺点是特异性较差。(四)其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。

近年来随着新技术平台建立，让人们认识到机体庞大、复杂的生物系统在应对病原体入侵时会做出精确的调控和反应。找到那些关键基因，检测其表达量的变化，并应用其成为新的特异标识，将能实现结核检测及诊断的新突破。

宿主表达基因card16基因，为已知基因，编码半胱氨酸招募家族16(caspaserecruitmentdomainfamilymember16，card16)，位于人类11号染色体22.3区域，其编码蛋白长度为197个氨基酸，序列见参考文献(rachelcchiaroni-clarke,etal.,2007)¹。card16蛋白是半胱氨酸抑制剂，在炎症反应中，作为半胱天冬酶原－1/casp1激活的调节剂，促使il－1β亚基的蛋白水解成熟。同时，还可在促炎性细胞因子生成过程中诱导nf-kappa-b的活化。本发明相关数据显示该基因在活动性结核组个体中的表达量明显升高，与正常对照组及潜伏感染组差异明显，具有鉴别atb的作用。可以用于结核病的分子诊断。本基因为新发现的结核发病相关基因，现有文献库中尚未发现其与结核病相关的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供分子标记物card16在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。

本发明所述的分子标记物card16，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。

本发明更加详细的描述如下：

本发明目的在于提供，检测分子标记物card16表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

检测card16蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。

本发明所述的检测分子标记物card16表达水平方法为荧光定量pcr法。

本发明目的在于提供，检测分子标记物card16表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。

其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。

其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。

本发明目的在于提供，card16在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。

本发明目的在于提供，card16在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以card16作为诊断分子标记物。

具体的，本发明的试剂盒，包括以下成分：

cd15+细胞富集磁珠及相关试剂；

细胞总rna提取分离柱及相关试剂；

cdna合成逆转录酶及相关试剂；

odf3b序列扩增特异性引物；

实时荧光定量pcr相关试剂。

本发明的另一个目的在于提供检测方法，包括以下步骤：

(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；

(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；

(3)总rna提取：对中性粒细胞的总rna进行提取；

(4)cdna的合成：对rna进行反转录，得到样本cdna，

(5)实时荧光定量pcr：以cdna为模板，使用card16特异引物，内参引物进行实时荧光定量pcr检测，经过计算即可得到样本中card16基因的含量。

结论：

以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。

优选的，本发明的检测方法，步骤如下：

1)全血样本处理

吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6ml的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入cd15⁺磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在hulamixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，

2)磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分离液，轻轻吹匀后转移至对应2ml蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，

⑶从磁力架上取下，加入1.6ml分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，

⑷加入350μl的bufferrlt裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，

3)细胞总rna提取

采用rneasyplusminikit对磁珠分选的中性粒细胞总rna进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gdna去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μl70％乙醇，混匀，转移700μl至rneasymini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑶加入700μlbufferrw1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑷加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑸加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，

⑹将rneasymini柱放入标记好编号的1.5ml的ep管，向柱膜中心加入30μl水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得rna冰上放置备用，

4)cdna的合成

取细胞总rna，采用superscript^tmivvilo^tmmastermix进行反转录，得到细胞样本cdna，

5)card16基因表达量检测

利用实施荧光定量pcr反应，对宿主体内目标基因的真实表达情况进行检测，以步骤2.3中制备的cdna为模板，加入特异引物对或内参引物对进行实时定量pcr，获取各个样本来源模板中的card16基因及内参基因扩增常数，计算目标基因相对表达量。

其中，card16基因表达量检测，包括以下步骤：

(1)配制反应体系1和反应体系2

反应体系1(目的基因)：为20μl，由qpcr反应多聚酶fastadvancedmastermix，目的基因assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)：为20μl，由fastadvancedmastermix，assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。

其中，card16及内参基因特异引物为商业化探针(appliedbiosystems，us)，分别在预配分装的qpcr反应液中加入1ul/孔。充分混匀后，上机，收集数据。

(2)实时定量pcr检测

将步骤(1)配制的各个反应体系在quantstudio^tm6and7flex实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystems，us)上进行实时定量pcr检测。使用2^-δδct法计算各个模板中card16基因的相对表达量。

反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。

(3)统计分析使用graphpadprism7对步骤(2)的结果进行统计分析。

本发明相对于现有技术而言，有益效果在于：

现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断，病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50％；其余病原性阴性患者无法被检出。检测宿主外周血中card16基因表达量的变化，可用于区分活动性结核病患者与结核潜伏感染者以及非结核感染正常人群，作为诊断活动性结核病的候选生物标志物。

对于说明书中出现的术语，在此进行相应的解释和说明：

tb：tuberculosis，结核病

m.tb：mycobacteriumtuberculosis。结核分枝杆菌

tst：tuberculinskintest，结核菌素试验

igra：interferongammareleaseassays，γ干扰素释放试验

atb：activetuberculosis,活动性结核

ltbi：latenttuberculosisinfection，结核潜伏感染者

hc：healthcontrol，非结核感染对照组

cd15：白细胞分化抗原15

hulamixer：hula混匀器

bufferrlt：rlt缓冲液

rneasyplusminikit：rna提取试剂盒

gdna：基因组dna

bufferrw1：rw1缓冲液

bufferrpe：rpe缓冲液

superscript^tmivvilo^tmmastermix:superscript^tmivvilo^tm混合液

cdna：反转dna

fastadvancedmastermix：快速混合液

附图说明

图1：不同组样本中card16相对表达量检测情况图。

图中：hc：非结核感染正常对照组；ltbi：结核潜伏感染组；tb：活动性结核患者组。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。

实施例1、活动性结核患者、结核分枝杆菌感染者外周血免疫细胞表达水平检测。

研究对象和方法

1.研究对象

1.1研究对象及纳入标准

本研究共收取207例宿主样本，分为三组，包括活动性结核组(atb,activetuberculosis,51例)、结核感染组(ltbi,latenttuberculosisinfection,54例)及正常对照组(hc，healthcontrol,102例)。其中，活动性结核样本，来自深圳第三人民医院的确诊的肺结核住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(ws288—2017)肺结核诊断》标准，且痰样本病原学检测为阳性，即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及x射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；结核感染样本指有临床接触史，无临床症状，且igra阳性)以及正常对照组样本(体检相关指标正常，igra阴性)。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。具体样本数以及一般资料表：

表1.样本人口统计学资料

1.2标本来源

分别抽取上述研究对象(均有知情同意书)的外周血2.5ml，置于含肝素锂抗凝采血管(bdbiosciences，us)，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到外周血标本。

2.研究方法

磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。

2.1外周血中性粒细胞富集

2.1.1全血样本处理

按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6ml的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入cd15⁺磁珠(invitrogen，us)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在hulamixer(invitrogen，us)上，4℃，8rpm旋转孵育20min。

2.1.2磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分离液，轻轻吹匀后转移至对应2ml蛋白低吸附管。磁力架上静置2min，吸去上清。

⑶从磁力架上取下，加入1.6ml分离液，轻轻吹匀。磁力架上静置2min，吸去上清。重复1次。

⑷加入350μl的bufferrlt(qiagen,germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用。

2.2细胞总rna提取

采用rneasyplusminikit(qiagen,germany)对磁珠分选的中性粒细胞总rna进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gdna去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μl70％乙醇，混匀。转移700μl至rneasymini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑶加入700μlbufferrw1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑷加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑸加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min。

⑹将rneasymini柱放入标记好编号的1.5ml的ep管，向柱膜中心加入30μl水，静置1min。12,000rpm，离心1min，所得rna冰上放置备用。

2.3cdna的合成

取细胞总rna，采用superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)进行反转录，得到细胞样本cdna。

2.4.card16基因表达量检测

利用实施荧光定量pcr反应(taqman系统)，对宿主体内目标基因的真实表达情况进行检测。以步骤2.3中制备的cdna为模板，加入特异引物对或内参引物对进行实时定量pcr，获取各个样本来源模板中的card16基因及内参基因扩增常数，计算目标基因相对表达量。具体步骤如下：

(1)配制反应体系1和反应体系2

反应体系1(目的基因)：为20μl，由qpcr反应多聚酶fastadvancedmastermix，目的基因assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)：为20μl，由fastadvancedmastermix，assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。

(2)实时定量pcr检测

将步骤(1)配制的各个反应体系在quantstudio^tm6and7flex实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystems，us)上进行实时定量pcr检测。使用2^-δδct法计算各个模板中card16基因的相对表达量。

反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。

(3)统计分析使用graphpadprism7对步骤(2)的结果进行统计分析。

3.研究结果

结果表明，与非结核感染正常对照组和潜伏感染组相比，活动性结核患者组样本的中性粒细胞card16基因的相对表达量均有显著增加，具有统计学意义(p<0.0001)。

4.结论：由图1中可见，检测宿主外周血中card16基因表达量的变化，可用于区分活动性结核病患者与结核潜伏感染者以及非结核感染正常人群，作为诊断活动性结核病的候选生物标志物。

实施例2、试剂盒

本发明的试剂盒由以下成分组成：

1.特定细胞富集抗体标记磁珠，dynabeadscd15(invitrogen，us)

2.细胞总rna提取试剂盒，rneasyplusminikit(qiagen,germany)

3.cdna反转录酶，superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)

4.qpcr荧光定量pcr检测体系，包括pcr多聚酶，缓冲体系，以及assaycard16外显子区域特异性检测引物及探针。

本发明首次报道基于人体外周血内所包含的特定细胞card16基因表达量变化的检测，相比外周血全血相关基因表达变化检测更加灵敏和特异。通过系列商业化试剂的组合和流程优化，使该基因作为结核病分子诊断标识具有可能性和实用性。

参考文献：

1.rachelcchiaroni-clarke,janeemunro,raulachavez,.etal.independentconfirmationofjuvenileidiopathicarthritisgeneticrisklocipreviouslyidentifiedbyimmunochiparrayanalysis.pediatricrheumatology2014,12:53

2.philippelamesch，ningli，stuartmilstein，etal.horfeomev3.1:aresourceofhumanopenreadingframesrepresentingover10,000humangenes.genomics89(2007)307–315

3.yiwan,nrgshrine,msolerartigas,etal.genome-wideassociationstudytoidentifygeneticdeterminantsofsevereasthma.