一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法与流程

本发明涉及一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法。
背景技术：
：柑橘黄龙病(citrushuanglongbing，hlb)是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生产上危害最严重和最具破坏性的毁灭性病害。黄龙病被认为是由一种专生于柑橘韧皮部组织的细菌引起。其传播途径包括嫁接和柑橘木虱传播。目前所有已知的柑橘品种及柑橘近缘种都受到黄龙病病菌的浸染。感病后的植株不仅不能产生经济价值，且易感程度高的品种如脐橙、葡萄柚等会在几年内逐渐衰亡，尚无黄龙病治疗康复的相关报道。因此对于黄龙病病菌的快速、准确和定量检测，对于黄龙病的防控和研究具有重要的意义。目前针对柑橘黄龙病病菌检测方法主要包括田间诊断、血清学诊断等，随着分子生物学检测方法广为流行，最常用的是基于普通pcr技术的检测方法，这种方法操作简单快捷，可以准确的鉴定出植株是否携带黄龙病病菌，但仅限于进行定性检测，不能对植株体内含菌量进行定量评估。因此如何对柑橘属植物体内黄龙病病菌含量进行评估，对于田间及实验室研究具有重要作用。技术实现要素：本发明实施例提供一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，可以实现对未知病菌浓度的植物组织中病菌含量定量检测，结果准确，操作方便。本文所述的柑橘黄龙病病菌是指韧皮部杆菌(candidatusliberibacterspp.)。本发明实施例提供一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，包括：提供系列已知浓度的柑橘黄龙病病菌dna；对所述dna进行琼脂糖凝胶电泳；对所得电泳条带进行分析，得到对应的条带亮度值；构建所述dna的浓度与所对应的条带亮度值的标准曲线；提供待测样品的dna和柑橘黄龙病病菌的特异性扩增引物，进行pcr扩增；对所述pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对所得电泳条带进行分析，得到待测样品的条带亮度值；根据所述标准曲线获得待测样品的dna浓度。在一些实施例中，所述系列已知浓度的柑橘黄龙病病菌dna可以通过荧光定量pcr扩增获得。在一些实施例中，经试剂盒纯化的柑橘黄龙病病菌dna的浓度可以通过仪器nanodrop2.0测得。在一些实施例中，可以利用imagej软件对琼脂糖凝胶电泳的电泳条带进行分析，得到条带亮度值。在一些实施例中，所用的特异性扩增引物为：hlbsf5'→3'tgtaaagctctttcgccggahlbsr5'→3'cttgacgtcatccccacctt在一些实施例中，可采用植物dna提取试剂盒进行dna提取，得到dna样品。在一些实施例中，取含柑橘黄龙病病菌的组织(例如叶片或枝条)，提取dna，采用上述特异性扩增引物hlbsf/hlbsr进行pcr扩增(反应循环数为30)，得到扩增产物，并通过琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到纯化的dna扩增产物；用仪器nanodrop2.0检测纯化扩增产物中dna浓度，然后用ddh2o(超纯水)将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的工作液；分别以所述dna浓度1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的工作液为模板，采用上述特异性扩增引物进行pcr扩增(例如反应循环数为30)；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(例如上样量5μl/每份)，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用imagej软件对扩增条带进行分析，得到每个对应的条带亮度数值，以模板dna浓度为横坐标、所对应的条带亮度数值为纵坐标，构建标准曲线。在一些实施例中，取待测含柑橘黄龙病病菌的组织(例如叶片或枝条)，提取dna，采用上述特异性扩增引物进行pcr扩增(例如反应循环数为30)，得到扩增产物；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(例如上样量5μl/每份)，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用imagej软件对扩增条带进行分析，得到对应的条带亮度数值；将所得的条带亮度数值代入上述标准曲线，获得待测含柑橘黄龙病病菌的组织的dna浓度。在一些实施例中，柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法包括：1)取感染柑橘黄龙病的植物叶片，磨碎，用试剂盒(例如starspin柱式植物dna提取试剂盒)进行dna提取，得到dna样品；以已提取的dna为扩增模板，采用上述特异性扩增引物hlbsf/hlbsr，进行pcr扩增反应；扩增反应结束后，取pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收纯化(例如使用琼脂糖凝胶回收试剂盒，starprep快速胶回收试剂盒)；对胶回收产物进行dna浓度测量(可用仪器nanodrop2.0)，将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl工作液(可用ddh2o，超纯水进行配制)；分别以浓度1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的dna为模板，采用上述特异性扩增引物hlbsf/hlbsr，进行pcr扩增；pcr扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用imagej软件对扩增条带进行分析，得到每个条带亮度对应的数值，以模板浓度为横坐标、亮度值为纵坐标，构建标准曲线；2)另取待测样品的柑橘黄龙病菌dna，按照上述程序进行pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳、扩增条带亮度分析，获得条带亮度值，根据所述标准曲线获得待测样品的dna浓度。本发明是基于pcr扩增技术、imagej图像分析技术的植物组织含菌量的定量检测方法，可以快速的对黄龙病菌进行定量分析，同时对植株感病程度进行有效区分。本发明能够实现对植物组织内菌含量的定量检测分析，可以用于判断植物病情，以及病害等级划分。本发明方法为快速评估带菌植株的菌含量、感病程度以及病害防控提供一种有效的评价方法。本发明方法为黄龙病等植物病害的早期检测提供经济快速的定量，同时也为其防治提供准确的评价手段。本发明通过用已知浓度的柑橘黄龙病菌dna模板构建浓度与pcr扩增条带亮度之间的标准曲线，通过对未知浓度细菌dna进行pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过与标准曲线进行对比，实现对未知浓度病菌的快速定量检测。附图说明图1为本发明实施例柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法流程示意图。图2为本发明实施例1所构建的dna浓度与所对应的条带亮度值的标准曲线。图3、图4分别为本发明实验例中引物a2/j5，p1/p2，16sf/16sr，hlbsf/hlbsr灵敏度分析结果、引物浓度优化电泳结果。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。实施例1本实施例提供一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，具体流程示意图参见图1。(1)材料：两年生感染柑橘黄龙病的纽荷尔脐橙植株。温室无菌苗作为阴性对照。(2)磨样处理：取脐橙叶中脉剪成1mm左右碎片，分别放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，在震荡研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30hz。(3)dna提取：将研磨好的植物样本用试剂盒进行dna提取，所用试剂盒为starspin柱式植物dna提取试剂盒，得到50μldna样品。(4)pcr反应体系：反应体系总提取为20μl。用已提取的dna为扩增模板，加入4μl；选取特异性扩增引物hlbsf(5'→3'tgtaaagctctttcgccgga)/hlbsr(5'→3'cttgacgtcatccccacctt)各加入0.4μl，2×taq预混pcr反应体系10μl(无染料添加)，加入ddh2o(超纯水)5.2μl，配制成20μl反应体系，进行常规pcr(聚合酶链式反应)反应，反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min,pcr产物保存于4℃，反应循环数为30。扩增反应结束后，取5μlpcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(starprep快速胶回收试剂盒，康润生物)对目标条带进行回收纯化。(5)dna模板定量：用仪器nanodrop2.0对胶回收产物、阴性对照进行dna浓度测量，并用ddh2o(超纯水)将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl工作液，待用。(6)标准菌浓度曲线的构建：分别以1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl浓度dna为模板进行pcr扩增，反应体系为模板4μl、引物hlbsf(5'→3'tgtaaagctctttcgccgga)/hlbsr(5'→3'cttgacgtcatccccacctt)各0.4μl，2×taq预混pcr反应体系10μl(无染料添加)，ddh2o(超纯水)5.2μl，配制成20μl反应体系，30个循环。pcr结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，上样量5μl/每份，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用imagej软件对扩增条带进行分析，得到每个条带亮度对应的数值，以模板浓度为横坐标、亮度值为纵坐标，构建标准曲线，如图2所示。通过选取未知菌浓度的柑橘黄龙病菌dna按照上述程序进行pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳、扩增条带亮度分析，发现亮度值为320，带入标准曲线对应的菌dna浓度为6.7ng/μ。表明本实施例方法可以快速的对黄龙病菌进行定量分析，同时对植株感病程度进行有效区分。实验例引物筛选实验(引物a2/j5、p1/p2、16sf/16sr为常用引物，引物hlbsf/hlbsr是本发明新设计的。)1)分别对以上引物进行灵敏度实验。将已知浓度的柑橘黄龙病病菌的dna溶液稀释(10、100、200、500、800、1000、1500、2000、2500、5000、8000、10000)倍，分别作为模板，20μlpcr体系：10μlmix，4μl模板，各引物的最佳浓度，用ddh2o补足至20μl，确定各引物所能扩增出目标产物的最低模板浓度，检测浓度最低的引物为灵敏度最佳引物。实验结果见图3。图3中，左上为引物a2/j5，右上为引物p1/p2，左下为引物16sf/16sr，右下为引物hlbsf/hlbsr；1-12稀释倍数依次为10、100、200、500、800、1000、1500、2000、2500、5000、8000、10000。结果表明，引物hlbsf/hlbsr的灵敏度最高。2)分别对以上引物最优浓度进行筛选。在20μl的pcr反应体系(同前)下，引物的加入量分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0μl，pcr反应结束后，取5μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(70v，50min)，扩增条带最清晰，引物二聚体亮度最低的浓度即为引物的最适浓度。实验结果见图4。图4中，注：左上图为引物16sf/16sr浓度优化结果，右上为a2/j5浓度优化结果，左下为p1/p2浓度优化结果，右下为hlbsf/hlbsr浓度优化结果；1-6引物浓度依次为0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5μm，m为dnamarker。结果表明，相较于其它三对引物，hlbsf/hhlbsr浓度在0.2μm时，灵敏度最高、扩增效果最好，可检测出每纳克总dna中的柑橘黄龙病菌数在426～755范围。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京农业信息技术研究中心<120>一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法<130>khp201115068.4<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgtaaagctctttcgccgga20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cttgacgtcatccccacctt20<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tctgttttcttcgaggttggtgag24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4accgcaagactccttaccaggaag24<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcgagcgcgtatgcaatacg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6atttcacctctaacttaatc20<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tataaaggttgacctttcgagttt24<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8acaaaagcagaaatagcacgaacaa25当前第1页12