一种用于快速检测胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒的制作方法

1.本发明涉及基因突变检测技术领域，涉及一种用于快速检测胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒。尤其涉及一种基于等位基因特异pcr技术的术中胶质瘤idh等位基因突变快速检测方法。


背景技术：

2.现有技术公开了神经胶质瘤简称胶质瘤，也称为胶质细胞瘤，是神经系统的头号肿瘤，其占颅脑肿瘤的40％-50％。目前通用的who分级主要根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度等特征将所述的胶质瘤分为四级；其中，i级以良性毛细胞型星形细胞瘤为主，占胶质瘤5％左右，通常可以治愈；ii级为一般的星形细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤，占胶质瘤的30～40％左右；iii级为间变型星形细胞瘤，占胶质瘤的15～25％左右，一般由ii级演变而来；iv级为胶质母细胞瘤，占胶质瘤的1/3左右。
3.有研究表明，在2-3级胶质瘤中约80％具有idh突变特征，其中多为idh1基因突变，突变主要集中于第132位氨基酸；另一部分为idh2基因突变，主要集中于第172位氨基酸，且这两种基因突变在碱基水平均存在多种突变组合；因此，临床实践中对于idh突变的检测已成为胶质瘤鉴定和分子分型的重要依据，而且以idh突变为技术的分子分型可弥补传统病理分型的不足，为治疗和手术方案的制定提供更详细、具体的参考依据。
4.有研究表明，在人类胶质瘤中，除了idh突变特征之外，还有一些重要的分子突变特征，如tert,tp53,atrx,h3基因位点以及tertpromoter区等,不同的分子突变特征对肿瘤的发生、发展与治疗有着不同的影响，因此针对不同的位点与不同的突变进行精细的检测在临床实践中具有重要的意义。
5.通常临床对于胶质瘤的诊断与分级主要通过组织病理学方法，但由于肿瘤组织的复杂性、多样性以及异质性等特征，仅依赖组织病理学有时很难提供很精准的诊断与分型。目前临床对于胶质瘤的诊断与突变分析主要集中于核酸与蛋白分子水平，常用的分子生物学技术主要有：(1)基于pcr延伸或者产物退火存在差异的荧光pcr；(2)基因芯片阵列杂交；(3)色谱-质谱单独或联用分析；(4)sanger测序；(5)高通量测序等。
6.上述用于基因突变的检测技术各有优势，但对于临床样品检测而言仍存在各方面的不足，如操作复杂、时间周期长、花费高、检测信息单一等等，尤其对于需要在术中过程中检测类似胶质瘤idh突变而言，更要面对组织样品获取量少且珍贵、在尽量短的时间内获取突变信息以及突变类型组合多样等问题，因此对于idh等突变的临床检测仍需要一种操作简单、成本低、用时短、对样品量要求低以及一次获取更多突变位点信息的新型检测技术与对应试剂盒。
7.基于现有技术的基础与现状，本技术的发明人拟提供一种用于快速检测胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒。尤其涉及一种基于等位基因特异pcr技术的术中胶质瘤idh等位基因突变快速检测方法。


技术实现要素：

8.本发明的目地是基于现有技术的基础与现状，提供一种用于快速检测胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒。尤其涉及一种基于等位基因特异pcr技术的术中胶质瘤idh等位基因突变快速检测方法。
9.具体的，
10.本发明要解决的技术问题是提供精确检测idh基因突变的试剂。
11.本发明要解决的另一个技术问题是使用上述试剂精确的确定idh的基因型。
12.为了解决上述技术问题，本发明采用人胶质瘤突变作为研究目标，采用一种基于等位基因特异pcr(aspcr)的新型基因突变与分型检测技术，提供一种人胶质瘤突变位点基因分型的方法，所述的方法包括下列步骤：
13.步骤一：针对待检测的突变位点设计引物组，所述的引物组由若干条正向引物和一条反向引物组成，形成pcr反应的引物对；
14.步骤二：获取组织样品或者细胞中的dna；
15.步骤三：以上述dna为模板进行荧光pcr反应，通过实时荧光pcr仪对pcr反应进行实时信号检测；
16.步骤四：根据反应产物的累积以及溶解曲线来对突变信息和基因分型情况进行判读。
17.较好的，所述的突变位点为3个连续的突变位点，所述的引物组由12条正向引物和1条反向引物组成。
18.较好的，本发明所采用的技术方案主要包括以下步骤：
19.1)针对待检测的突变位点设计一组用于单位点或者连续多位点突变检测与分型分析的引物组合；
20.2)对采集到的临床组织样品进行快速裂解，使所述组织样品中的基因组dna释放出来；
21.3)以裂解样品为模板，进行荧光pcr反应。通过实时荧光pcr仪对pcr反应进行实时信号检测。
22.4)根据反应产物的扩增曲线以及溶解曲线，对突变信息和基因分型情况进行确定。
23.更具体的，本发明所述的方法中包括：
24.(1)切取米粒大小的样品组织，放入适于pcr的小型反应管中；
25.(2)加入裂解液，孵育后加入裂解中和液，产物置于冰上；
26.(3)吸取裂解产物作为pcr扩增模板，配制荧光定量pcr扩增体系；
27.(4)放入荧光定量pcr仪器中进行扩增和实时荧光检测；
28.(5)将样品的扩增曲线和溶解曲线分别与阳性对照和阴性对照比对，进行结果判读。
29.较好的，本发明中，所述的人胶质瘤突变位点包括人胶质瘤idh1第132位氨基酸、h3k27m或者tert promoter区c228t和c250t。
30.本发明在软件辅助的基础上，针对重要的突变位点设计一系列引物，根据扩增结果进行引物的筛选和优化，获得一组用于检测胶质瘤idh1第132位氨基酸突变位点及分子
分型的引物组合，包含12个上游引物和一个下游引物，分别为：
31.idh1-1：aaaacctatcatcataggta(seq id no 1)；
32.idh1-2：aaaacctatcatcataggtt(seq id no 2)；
33.idh1-3：aaaacctatcatcataggtc(seq id no 3)；
34.idh1-4：aaaacctatcatcataggtg(seq id no 4)；
35.idh1-5：aaacctatcatcataggtna(seq id no 5)；
36.idh1-6：aaacctatcatcataggtnt(seq id no 6)；
37.idh1-7：aaacctatcatcataggtnc(seq id no 7)；
38.idh1-8：aaacctatcatcataggtng(seq id no 8)；
39.idh1-9：aacctatcatcataggtnna(seq id no 9)；
40.idh1-10：aacctatcatcataggtnnt(seq id no 10)；
41.idh1-11：aacctatcatcataggtnnc(seq id no 11)；
42.idh1-12：aacctatcatcataggtnng(seq id no 12)；
43.idh1-13：cctttagctaaatgtgtgta(seq id no 13)。
44.本发明的引物组合包括针对突变位点的若干条正向引物和一条反向引物，在提高检测的准确度和灵敏度的同时，兼顾成本，降低引物之间的概率。
45.与现有技术相比，本发明可通过12组pcr反应一次确定三个突变位点的序列信息，覆盖所有突变情况，也可确定对应的基因分型信息。本发明的方法对样品组织的需求量低，操作简单，成本低，用时短。
46.基于上述方式，本发明针对胶质瘤中比较重要的h3k27m和tert promoter区c228t以及c250t突变位点进行了引物的设计和优化。
47.本发明中针对h3k27m的第二引物组：
48.h3-1:ggctacaaaagccgctcgca(seq id no 14)
49.h3-2:ggctacaaaagccgctcgct(seq id no 15)
50.h3-3:ggctacaaaagccgctcgcc(seq id no 16)
51.h3-4:ggctacaaaagccgctcgcg(seq id no 17)
52.h3-5:gctacaaaagccgctcgcaa(seq id no 18)
53.h3-6:gctacaaaagccgctcgcat(seq id no 19)
54.h3-7:gctacaaaagccgctcgcac(seq id no 20)
55.h3-8:gctacaaaagccgctcgcag(seq id no 21)
56.h3-9:ctacaaaagccgctcgcaaa(seq id no 22)
57.h3-10:ctacaaaagccgctcgcaat(seq id no 23)
58.h3-11:ctacaaaagccgctcgcaac(seq id no 24)
59.h3-12:ctacaaaagccgctcgcaag(seq id no 25)
60.h3-13:cctccaggtaagattatggc(seq id no 26)。
61.本发明中针对tertpromoter区c228t和c250t的第三引物组：
62.tertp228-1：ccgccccgtcccgacccctc(seq id no 27)
63.tertp228-2：ccgccccgtcccgacccctt(seq id no 28)
64.tertp250-1：gggtccccggcccagccccc(seq id no 29)
65.tertp250-2：gggtccccggcccagcccct(seq id no 30)
66.tertp-3：ggccccaggcgccgcacgaa(seq id no 31)
67.本发明中，用于快速检测胶质瘤idh1等突变位点及分子分型的引物组合，具体序列如前所述；上述的第二引物组和第三引物组分别针对不同的基因位点，能进一步提高基因分型的准确性。
68.本发明还提供了一种快速检测胶质瘤idh1等突变位点及分子分型的试剂盒，其包括上述的引物组合。
69.本发明还提供了一种快速检测胶质瘤突变位点及分子分型的试剂盒，其包括上述的引物、荧光pcr试剂，以及阴性质控样品和野生纯合质控样品；该试剂盒中还包括有用于对临床组织样品进行裂解的裂解液、用于实现pcr反应的pcr扩增体系；较好的，该试剂盒还含有说明书、反应容器、研磨或者破碎组织的简易工具，等。
70.本发明提供了一种用于临床快速检测人胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒，同时针对idh1等位点设计了一套用于单位点或者连续多位点突变检测以及分型分析的引物组合。本发明可通过荧光pcr反应一次确定三个突变位点的序列信息，覆盖所有突变情况，也可确定对应的基因分型信息。本发明还具有对样品组织的需求量低，操作简单，成本低，所用时间短等优点。
71.本发明相对于现有技术的基因突变临床检测技术主要有以下几个优势：
72.(1)对样品组织的需求量低；
73.(2)操作简单，成本低，所用时间短；
74.(3)在未知dna突变的情况下，可以一次确定三个碱基序列，覆盖所有的dna突变情况；
75.(4)确定dna突变情况的同时，还可以分析基因的分子分型情况。
附图说明
76.图1为本发明中实施方案的流程图，
77.如图所示，本发明依次分为4个步骤：
78.1.1针对待检测的突变位点设计一组用于单位点或者连续多位点突变检测与分型分析的引物组合；
79.1.2对采集到的临床组织样品进行裂解，使组织样品细胞中的dna释放出来；
80.1.3以裂解样品为模板进行荧光pcr反应，通过实时荧光pcr仪对pcr反应进行实时信号检测；
81.1.4根据反应产物的扩增曲线以及溶解曲线，对突变信息和基因分型情况进行判读。
82.图2为本发明中引物组合设计示意图。
83.图3为本发明方法中荧光pcr扩增程序设置图。
84.图4为本发明快速检测胶质瘤idh1突变位点应用案例的扩增曲线结果图。
85.图5为本发明快速检测胶质瘤idh1突变位点应用案例的溶解曲线结果图。
86.图6为样品1第132位氨基酸对应碱基序列信息与分型解读。
87.图7为样品2第132位氨基酸对应碱基序列信息与分型解读。
具体实施方式
88.本发明提供了一种用于快速检测胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒，能够快速实现对胶质瘤idh1等位点突变信息的确认，在未知突变类型的情况下覆盖所有碱基突变组合和基因分型，对临床采取治疗和愈后的决定方案具有十分重要的实践意义。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。
89.为了对本发明的技术方案和实现方式做出更清楚地解释和说明，以下介绍实现本发明技术方案的几个优选的具体实施例。显然，以下所描述的具体实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。
90.实施例1
91.本发明检测方法主要包括以下几个步骤，其方法流程如图1所示；
92.步骤一：针对待检测的连续三个突变位点中的每一个，分别设计由一组四个正向引物组成的引物组，同时设计一个通用的反向引物，形成pcr反应的引物对；
93.如图2所示，以检测idh1第132个氨基酸突变位点为例，设计三组正向引物的序列如上所述；
94.步骤二：对采集的临床组织样品进行少量组织切取和裂解，使组织样品细胞中的dna释放出；
95.步骤三：以上述裂解产物为模板进行荧光pcr反应，通过实时荧光pcr仪对pcr反应进行实时信号检测；
96.步骤四：根据反应产物的累积(即扩增曲线)以及溶解曲线来对突变信息和基因分型情况进行判读。
97.实施例2
98.以胶质瘤idh1突变临床样品为分析对象，具体说明本发明的应用。
99.胶质瘤作为神经系统的头号肿瘤，由于具有进展快、生存短等特性使其成为一种重大难治性疾病。突变位点及分子分型的确定是治疗过程中重要依据。另外，用于检测的组织样品获取复杂且样品量很少，而且突变类型很多，主要以r132h为主。
100.本部分作为检测预实验，以两份胶质瘤临床组织样品作为反应起始材料，两份样品经预先一代测序验证为一份为突变阴性，一份为r132h(g-a)突变杂合。
101.(1)切取米粒大小的样品组织，放入200μl pcr管中；
102.(2)加入30μl的第一裂解液，50℃孵育10min，中间可以吹打混匀一次；
103.(3)95℃孵育5min，加入20μl裂解中和液，产物暂存4℃待下一步使用；
104.(4)吸取2μl裂解产物作为pcr扩增模板；
105.(5)按照下表配制pcr扩增体系：
106.[0107][0108]
(6)放入bio-rad荧光定量pcr仪器中进行扩增和实时荧光检测，设置程序如图3所示；
[0109]
(7)根据扩增曲线和溶解曲线，进行结果判读。
[0110]
结果如图4、图5所示，图4中先上升的一组曲线(7根)是阳性实验组，后上升的一组曲线是阴性实验组。阳性实验组在图4中显示都是在20左右循环开始上升，而且对应到图5所显示的溶解曲线一致；而阴性实验组在图4中显示都是在30循环之后上升，而且对应到图5所显示的溶解曲线杂乱，为非特异扩增。
[0111]
两个样品针对idh1位点序列解读与分型如图6、图7所示，此次判读结果和前期验证结一致，样品1为未突变纯合，样品2为g-a突变杂合。
[0112]
另外本实施案例中使用双链荧光染料进行信号检测，亦可使用taqman荧光探针进行信号检测，可进一步提高检测结果的灵敏性和准确性。
[0113]
本发明并不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
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