基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用的制作方法

本发明涉及抗体产业化应用，特别涉及基于基因重组抗covid-19和其他冠状病毒igy抗体及其他小分子抗体产业化应用，属于生物技术领域。

背景技术：

抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它(免疫球蛋白不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应b细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其b细胞的细胞膜表面，抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。

在covid-19中，病毒表面的s蛋白介导受体识别和膜融合，在病毒感染过程中，三聚体s蛋白被切割成s1和s2亚基，s1蛋白的受体结合域(rbd)，直接与靶细胞表面受体ace2的肽酶域(peptidasedomain，pd)结合，而s2负责膜融合，但是目前通过无法实现通过构建和表达s蛋白实现对sars-cov特异性igy抗体的生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供基于基因重组抗covid-19和其他冠状病毒igy抗体及其他小分子抗体产业化应用，以解决上述背景技术中提出的目前通过无法实现通过构建和表达s蛋白实现对sars-cov特异性igy抗体的生产的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：包括以下步骤：

s1：新冠病毒s蛋白基因的克隆表达；

s2：抗原的制备，通过生物反应器进行昆虫细胞的baculovirus-insectcell(杆状病毒昆虫细胞)表达、his-tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在93％；

s3：动物的选择，选择高产母鸡，鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳；

s4：对选择的动物进行免疫，使用油佐剂、免疫增强剂免疫，免疫的周期为2个月左右，免疫的次数为3次，第三次免疫结束后，时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋；

s5：对母鸡进行抗体的检测，用elisa(酶联免疫吸附测定)方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度，elisa测od(光密度)值，公式为：样品od值/阴性对照od值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表；

s6：抗体的制备；

s7：抗体含量的测定，抗体纯度的测定；

s8：加入各种添加剂，包括防腐剂和稳定剂。调整igy含量大于3mg/ml，0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s1中新冠病毒s蛋白基因的克隆表达，根据已知探针克隆新冠病毒s蛋白基因，首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组dna杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤s6中包括一次离心和二次离心，一次离心包括以下步骤：

a1：对收集的鸡蛋进行称重；a2：配pbs(磷酸缓冲盐溶液)；a3：将鸡蛋打到玻璃器皿中，且将蛋黄与蛋清分离；a4：对分离的蛋黄进行搅拌，搅拌时长控制在0.5小时；a5：对搅拌的蛋黄进行沉淀，沉淀时间控制为0.5小时；a6：对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理；a:7：对离心处理后的蛋黄进行过滤处理；a8：加入添加剂，调节igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量，并进行定容，定容时长为12小时，a9：对定容的蛋黄加入0.45um、0.22um膜过滤除菌；a10：通过巴斯德消毒，控制消毒时间为0.5小时，消毒后进行灌装打包。

作为本发明的一种优选技术方案，所述二次离心包括以下步骤：b1对收集的鸡蛋进行称重；b2：配pbs(磷酸缓冲盐溶液)；b3：将鸡蛋打到玻璃器皿中，且将蛋黄与蛋清分离；b4：对分离的蛋黄进行搅拌，搅拌时长控制在0.5小时；b5：对搅拌的蛋黄进行沉淀，沉淀时间控制为0.5小时；b6：对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理，并在离心时，加入0.45um膜过滤；b7：对上清液加入沉淀剂，搅拌，通过离心机进行二次离心，对二次离心的清液进行溶解沉淀，溶解沉淀时长为至少12小时；b8：加入添加剂，调节igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量；b9：加入0.22um膜过滤除菌；b10通过巴斯德消毒，控制消毒时间为0.5小时，消毒后进行灌装打包。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a8中加入添加剂，调节igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量，对步骤a7过滤后的稀释蛋黄添加氧化钠试剂，加入氧化钠试剂和进行沉淀，沉淀后进行定容，保证igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量在90％左右。

作为本发明的一种优选技术方案，所述igy检测方法，包括电泳、sec、结合活性、假病毒中和活性、ace2竞争活性和hplc法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明基于基因重组抗covid-19和其他冠状病毒igy抗体及其他小分子抗体产业化应用，通过构建和表达s蛋白，纯化获得高纯度抗原蛋白免疫母鸡，使鸡蛋中持续产生特异性的针对s蛋白的特异性卵黄抗体，经过纯化提取针对sars-cov特异性igy抗体，制备成喷雾剂，用于人口腔喷雾消毒。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为本发明的igy抗体纯化流程图；

图3为本发明的hplc法igy蛋白纯度检测图；

图4为本发明图elisa法检测sars-cov2-rbd蛋白和抗体结合活性检测图；

图5为本发明的igy和sec活性图

图6为本发明的igy与rbds1h结合活性图；

图7为本发明的igy假病毒中活性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-7，本发明提供了基于基因重组抗covid-19和其他冠状病毒igy抗体及其他小分子抗体产业化应用的技术方案：

根据图1-7所示，包括以下步骤：

s1：新冠病毒s蛋白基因的克隆表达；

s2：抗原的制备，通过生物反应器进行昆虫细胞的baculovirus-insectcell(杆状病毒昆虫细胞)表达、his-tag(多聚组氨酸标签)纯化、确保抗原的纯度保持在93％；

s3：动物的选择，选择高产母鸡，鸡龄为刚产蛋的鸡龄为最佳；

s4：对选择的动物进行免疫，使用油佐剂、免疫增强剂免疫，免疫的周期为2个月左右，免疫的次数为3次，第三次免疫结束后，时间间隔为2周后收集免疫母鸡生产的鸡蛋；

s5：对母鸡进行抗体的检测，用elisa(酶联免疫吸附测定)方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度，elisa测od(光密度)值，公式为：样品od值/阴性对照od值>2.1判断为阳性,以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度,并制作免疫周期内抗体滴度变化表；

s6：抗体的制备；

s7：抗体含量的测定，抗体纯度的测定；

s8：加入各种添加剂，包括防腐剂和稳定剂。调整igy含量大于3mg/ml，0.2um滤膜过滤除菌、病毒灭活后灌装。

步骤s1中新冠病毒s蛋白基因的克隆表达，根据已知探针克隆新冠病毒s蛋白基因，首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组dna杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体。

步骤s6中包括一次离心和二次离心，一次离心包括以下步骤：a1：对收集的鸡蛋进行称重；a2：配pbs(磷酸缓冲盐溶液)；a3：将鸡蛋打到玻璃器皿中，且将蛋黄与蛋清分离；a4：对分离的蛋黄进行搅拌，搅拌时长控制在0.5小时；a5：对搅拌的蛋黄进行沉淀，沉淀时间控制为0.5小时；a6：对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理；a:7：对离心处理后的蛋黄进行过滤处理；a8：加入添加剂，调节igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量，并进行定容，定容时长为12小时，a9：对定容的蛋黄加入0.45um、0.22um膜过滤除菌；a10：通过巴斯德消毒，控制消毒时间为0.5小时，消毒后进行灌装打包。

二次离心包括以下步骤：

b1对收集的鸡蛋进行称重；b2：配pbs(磷酸缓冲盐溶液)；b3：将鸡蛋打到玻璃器皿中，且将蛋黄与蛋清分离；b4：对分离的蛋黄进行搅拌，搅拌时长控制在0.5小时；b5：对搅拌的蛋黄进行沉淀，沉淀时间控制为0.5小时；b6：对沉淀的蛋黄通过离心机进行离心处理，并在离心时，加入0.45um膜过滤；b7：对上清液加入沉淀剂，搅拌，通过离心机进行二次离心，对二次离心的清液进行溶解沉淀，溶解沉淀时长为至少12小时；b8：加入添加剂，调节igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量；b9：加入0.22um膜过滤除菌；b10通过巴斯德消毒，控制消毒时间为0.5小时，消毒后进行灌装打包。

步骤a8中加入添加剂，调节igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量，对步骤a7过滤后的稀释蛋黄添加氧化钠试剂，加入氧化钠试剂和进行沉淀，沉淀后进行定容，保证igy(鸡卵黄免疫球蛋白)含量在90％左右。

igy检测方法，包括电泳、sec、结合活性、假病毒中和活性、ace2竞争活性和hplc法。

在本发明的描述中，需要理解的是，指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。