一种基于生物正交化学的整合型前药、制备方法及其医药用途与流程

[0001]
本发明属于药学技术领域，涉及一种包含四价铂配合物的一氧化氮(nitric oxide,no)供体的制备方法和应用，具体涉及一种新的具有肿瘤选择性的结合四价铂配合物与no供体偶氮鎓二醇盐片段的小分子，两者通过丁二酰基连接而成。


背景技术：

[0002]
目前，恶性肿瘤的发病率和死亡率一直呈现显著的上升趋势，而化疗一度是肿瘤治疗的标准疗法。但传统的小分子药物由于缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时会误杀正常细胞，引起严重的毒副作用，因此在临床上的广泛应用受到限制。生物正交化学作为新兴发展的学科，通过键生成和键断裂得方式广泛应用于标记、追踪、操纵和激活目标分子。近年来，一些通过金属催化剂催化的生物正交键断裂反应已经成功应用于肿瘤治疗。相比较于传统的细胞毒药物或者依赖酶激活的抗肿瘤药物，依赖外源性催化剂的生物正交键断裂的前药激活策略可以更好地实现靶向肿瘤的目的，最大程度地降低副作用和不良反应。
[0003]
生物正交金属催化剂
[0004]
生物正交化学金属催化剂目前应用最广泛的包括金，铜和钯等。此类金属催化剂由于结构难以修饰，而且均需要和前药分开给药，这样就极大地限制了化合物的疗效，使得在体内缺乏选择性和靶向性，同时此类金属催化剂在体内容易蓄积，较难被代谢。因此要想解决以上的问题，发现新的催化剂对于生物正交化学来说至关重要。由于铂和钯位于元素周期表的同一主族，经过一系列验证后，从而发现了顺铂可以作为一种新的生物正交催化剂。但是由于顺铂具有较强的细胞毒性，不能直接给药，因此需要对顺铂进行改造。四价铂前药可以选择性地在肿瘤细胞还原介质的作用下还原为顺铂，从而发挥催化作用。同时顺铂可以与肿瘤细胞内dna发生交联，发挥细胞毒性作用，因此我们选择了顺铂的四价前药作为催化剂的前体形式。
[0005]
四价铂前药
[0006]
四价铂前药是一类可能改善二价铂抗肿瘤药物药理性质的新型分子。相对于平面构型的二价铂配合物，四价铂配合物的中心铂离子为d6电子构型，多了两个轴向轨道，可以形成稳定的八面体配位构型。对四价铂配合物的轴向位置进行化学配体修饰可以进一步影响和调节四价铂配合物的物理和化学性能。对四价铂轴向位置进行不同配体修饰可以影响四价铂配合物的脂溶性、还原性、靶向性和其他生物活性。四价铂配合物被还原时发生两个电子的转移，被还原成具有抗肿瘤活性的二价铂，同时伴随着两个轴向配体的释放。
[0007]
no供体型药物
[0008]
no供体型药物一般是指由no供体及相关药物或某种活性化合物通过各种连接基团而形成的前药。现已发现多种结构类型的no供体，如亚硝基硫醇、硝酸酯、no-金属复合物(硝普盐)、呋咱n-氧化物、偶氮鎓二醇盐等；其中，偶氮鎓二醇盐(diazeniumdiolates)在选择性和靶向性释放no方面具有明显优势。一方面是偶氮鎓二醇盐在生理条件下极易不稳
定，能自动释放1～2分子no，其半衰期从几秒钟到几小时不等。另一方面，将偶氮鎓二醇盐的o2位(与氮鎓离子相连的o称之为o1，与烯键氮原子相连的o为o2)烷基化后，可转化成在生理条件下稳定的前药；通过体内某些特定酶识别或特殊生理环境作用下，去除o2保护基团，转化为不稳定的偶氮鎓二醇盐阴离子，从而达到选择性和靶向性释放no。迄今为止，已发展出多种o2保护新策略。
[0009]
no与癌症
[0010]
no是生物体内一种水溶性的、携带自由基的气体，具有氧化还原特性，在生理、病理方面扮演重要角色。研究表明no是一种潜在抗肿瘤剂，可以调节肿瘤相关过程，包括血管生成、凋亡、侵袭与转移、细胞周期等。no对肿瘤细胞的直接作用机制尚不清楚，目前报道的主要有3个方面：(1)no与胞内超氧阴离子作用形成过氧亚硝酸根，质子化分解为no2和羟基自由基，羟基自由基可与肿瘤细胞的多种分子结合，从而引起肿瘤细胞损伤，如脂质过氧化、蛋白质、氨基酸交联反应；(2)no极易与含有fe-s中心的蛋白质fe形成fe-no，从而引起线粒体呼吸链上fe-s辅基和顺乌头酸酶的降解，因而阻止细胞内能量的合成、诱导细胞凋亡；(3)no可以直接作用于核糖核酸还原酶，影响肿瘤细胞dna的复制，同时还可以使dna发生硝基化，抑制肿瘤细胞增殖。no抗肿瘤的另一主要机制是no介导的巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤性，具体机理是：t细胞识别抗原
→
t细胞分泌细胞因子
→
细胞因子刺激产生no
→
no杀伤肿瘤细胞。另外，有研究证明nk细胞毒性也是no依赖性的。因此，设计和研究no前体药物成为抗肿瘤药物创新的重要策略之一。美国国立癌症研究所(nci)、一些世界知名医药企业如merk、pfizer、nicox、nitromed等均投资支持no供体型药物开发。近年来，no供体型药物的研发也取得了很大进展，nci已将抗肿瘤药物js-k列入快速研发计划。


技术实现要素：

[0011]
发明目的
[0012]
本发明提供一种具有抗肿瘤疗效的包含四价铂配合物和偶氮鎓二醇盐片段的有机化合物。该化合物可以选择性地在肿瘤细胞中释放no和顺铂，从而发挥协同抗肿瘤的效果。
[0013]
技术方案
[0014]
一种包含四价铂配合物和偶氮鎓二醇盐片段的有机化合物，该化合物是以四价铂配合物和一氧化氮供体分子为基础，通过化学偶联方法，利用丁二酸酯键将一氧化氮供体分子和四价铂配合物连接起来，作为一个整体分子；所述的一氧化氮供体分子为n-甲基乙醇胺偶氮鎓二醇盐；四价铂配合物为顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂。
[0015]
第一方面，本发明提供一种以n-甲基乙醇胺偶氮鎓二醇盐为骨架的化合物，为通式i所示的化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐：
其中：r1选自甲基、烯丙基、炔丙基；r2选自顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂。进一步的，r1选自炔丙基、甲基，r2选自顺式二胺三氯羟基铂、反式二胺三氯羟基铂。
[0016]
在一些实施例中，通式i所示的化合物选自：
[0017]
第二方面，所述化合物的制备方法，通式i所示的化合物的合成路线如下：nogas：一氧化氮气体，anhydrousether：无水乙醚；ch3ona：甲醇钠；ch3oh：甲醇；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；thf：四氢呋喃；chp：顺式二胺三氯羟基铂；fhp：反式二胺三氯羟基铂；et3n：三乙胺；tbtu：2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。
[0018]
第三方面，本发明还提供一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物及药学上可接受的载体。
[0019]
第四方面，所述的化合物或其溶剂合物在制备预防和/或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
[0020]
有益效果：本发明将no供体偶氮鎓二醇盐与四价铂配合物这两个片段整合在一起，设计出了整合型生物正交化学催化的no供体药物。该类化合物在肿瘤细胞特有的还原环境下，四价铂片段被还原成顺铂，同时释放o2保护的偶氮鎓二醇盐片段。顺铂一方面发挥抗肿瘤作用，另一方面顺铂作为一种生物正交催化剂催化偶氮鎓二醇盐o2保护基的断裂，
进一步释放no，从而发挥协同抗肿瘤的疗效。这类整合型前药分子具有较高的肿瘤特异性，使得顺铂和no在肿瘤细胞内特异性释放，避免了其单独使用时的低靶向性所造成的对正常细胞的毒副作用，解决了传统生物正交反应催化剂缺乏选择性的问题。同时，整体分子的设计理念也改善了传统的生物正交化学的催化剂与前药分开给药的方式，进一步提高了此类整体生物正交型前药的成药性。
[0021]
本发明首次合成了新化合物i
5a
，通过细胞和斑马鱼实验验证了化合物i
5a
具有选择性在肿瘤细胞内被激活，从而发挥抗肿瘤的疗效。相比较正常细胞，化合物i
5a
会优先进入到肿瘤细胞中，然后四价铂被还原为顺铂，同时顺铂催化化合物释放no，从而与顺铂协同发挥抗肿瘤活性。与目前存在的生物正交前药相比较，化合物i
5a
作为整体前药分子，避免分开给药，增强了化合物的靶向性，也减少了催化剂的毒性，极大地提高了此类整合型生物正交化学催化的no供体分子的成药性。
附图说明
[0022]
图1是化合物i
5a
的设计思路。
[0023]
图2是化合物i
5a
在pbs中及l-(+)-抗坏血酸存在下的稳定性。
[0024]
图3是i
5a
在pbs中及l-(+)-抗坏血酸存在的条件下释放no的水平。
[0025]
图4是化合物i
5a
在a2780和iose80细胞中释放no水平。
[0026]
图5是不同浓度的化合物i
5a
及与细胞孵化不同时间下，释放no的水平。
[0027]
图6是no清除剂carboxy-ptio对化合物i
5a
的肿瘤细胞增殖抑制活性的影响。
[0028]
图7是a2780细胞和iose80细胞分别对化合物i
5a
和cddp的摄取量。
[0029]
图8是化合物i
5a
和cddp分别在a2780细胞和iose80细胞中dna上pt的含量。
[0030]
图9是利用顺铂探针考察化合物i
5a
在a2780细胞和iose80细胞中转化成顺铂的情况。
[0031]
图10是进一步研究化合物i
5a
在斑马鱼体内的抗肿瘤增殖抑制活性。
[0032]
图11是进一步研究化合物i
5a
在斑马鱼体内no释放情况。
具体实施方式
[0033]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0034]
通式i所示的化合物的合成路线如下：
ch3ona：甲醇钠；ch3oh：甲醇；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；thf：四氢呋喃；chp：顺式二胺三氯羟基铂；fhp：反式二胺三氯羟基铂；et3n：三乙胺；tbtu：2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯。在一些实施例中，中间体化合物i2至化合物i4的合成如下：
[0035][0036]
化合物i2的合成：将n-甲基-2-羟基乙胺(i1，20ml)、甲醇钠的甲醇溶液(5.4mol/l)50.79ml混合加入到聚四氟容器中，加入无水乙醚200ml,将反应体系n2置换后，通入一氧化氮(no)气体，使压力达到0.4-0.8mpa，温室密闭反应24h。后处理，放掉未反应的过量的no气体，使压力降为常压，打开容器后，将反应液倒入1l的无水乙醚中析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗3次，至于真空干燥箱中室温进行干燥2h，收集白色产物即为化合物i2。得到的化合物i2不经纯化直接进行下一步反应。
[0037][0038]
化合物i
3a
的合成：取1g化合物i2和5ml dmf加入到100ml两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行n2保护，然后取757.8mg溴丙炔缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下反应0.5h，然后将反应液移至室温继续反应12h。后处理，首先通过旋蒸除去dmf,剩余物制砂，柱层析得到无色油状物i
3a
。
[0039]
化合物i
3b
的合成：取1g化合物i2和5ml dmf加入到100ml两颈玻璃反应瓶中，将反应瓶置于冰浴条件并进行n2保护，然后取949.8mg碘甲烷缓缓滴加入到反应瓶中，滴毕，继续在冰浴下保温0.5h，后将反应液移至室温继续反应12h。后处理，首先通过旋蒸除去dmf,剩余物制砂，柱层析得到浅黄色油状物i
3b
。
d6)δ182.01,175.12,63.69,63.57,55.06,43.86,34.06,32.93.hrms(esi)calcd for c8h
20
cl3n5o6pt[m+h]
+
:583.0200；found:583.0191，ppm error-1.5.
[0057]
图1展示的是化合物i
5a
分别在肿瘤细胞和正常细胞中的转化过程。由上可知，化合物i
5a
在正常细胞内能够保持稳定，基本没有细胞毒性，而在肿瘤细胞内，化合物i
5a
则可以先将四价铂被还原为顺铂，同时顺铂催化化合物释放no，从而与顺铂协同发挥抗肿瘤活性。
[0058]
图2是化合物i
5a
在pbs中及l-(+)-抗坏血酸存在下的稳定性。从图2可以看出，i
5a
在pbs中在24内相对稳定；但当l-(+)-抗坏血酸存在时，可较快的降解，如在2h降解超过50％,而在24h时基本降解完全。
[0059]
图3是i
5a
在pbs中及l-(+)-抗坏血酸存在下释放no的浓度检测情况。从图3可以看出，i
5a
在没有l-(+)-抗坏血酸存在下，基本无no产生；而当l-(+)-抗坏血酸存在时，有较多的no产生；说明i
5a
首先在l-(+)-抗坏血酸作用下，产生顺铂和i
4a
，cddp进一步催化i
4a
的脱丙炔基化反应，进而释放产生no。
[0060]
表1展示的是化合物i
5a
对人卵巢癌细胞a2780和人卵巢正常细胞iose80的增殖抑制活性研究。表1
[0061]
从表1可以看出，与顺铂cddp相比，chp表现出较高的肿瘤细胞选择性。而化合物i
4a
对肿瘤细胞a2780和正常细胞iose80的ic
50
均较大，说明对2株细胞的增殖抑制活性均较弱。而当chp先与a2780预孵化10h后，再加入i
4a
，表现出较强的增殖抑制活性(i
4a
,ic
50
＝89.46
±
4.87μmvs chp+i
4a
,ic
50
＝0.81
±
0.07μm)，表明chp可以进入肿瘤细胞后可被还原为顺铂，而顺铂可催化i
4a
产生no。重要的是，i
5a
对a2780表现出比cddp和chp更强的增殖抑制活性(i
5a
,ic
50
＝0.23
±
0.01μm；cddp,ic
50
＝1.08
±
0.06μm；chp,ic
50
＝1.69
±
0.06μm)。同时，i
5a
(sf＝518)比cddp(sf＝7.8)和chp(sf＝10.9)表现出更好的肿瘤细胞的选择性。
[0062]
图4是化合物i
5a
在a2780和iose80中释放no水平。从图4中可以看出，i
4a
单独与细胞孵育时，基本无no产生。而当加入chp与a2780细胞预孵化10h后，再加入i
4a
孵育8h，则产生较多的no，而在正常细胞iose80中基本不产生no，表明顺铂催化o-丙炔基断裂可选择性在肿瘤细胞中进行。i
5a
在肿瘤细胞a2780中产生最强的mfi值(25.33),高于i
4a
+chp(mfi＝15.16)和js-k(mfi＝7.75)。
[0063]
图5是不同浓度的化合物i
5a
及与细胞孵化不同时间下，释放no的水平。从图5可以看出，化合物i
5a
在正常细胞中基本无no产生，而在肿瘤细胞中释放no的水平呈现剂量和时间依赖性，即随着浓度的升高或孵化时间的延长，no的释放量也会逐渐升高。
[0064]
图6是no清除剂carboxy-ptio对化合物i
5a
的肿瘤细胞增殖抑制活性的影响。从图6
可以看出，当加入carboxy-ptio后，可降低化合物i
5a
对肿瘤细胞a2780的抑制活性，且随着carboxy-ptio浓度的升高，对化合物i
5a
的增殖抑制活性降低越明显。结果表明，化合物i
5a
在肿瘤细胞中产生的no对产生抑制肿瘤细胞的活性具有一定的贡献。
[0065]
图7是a2780细胞和iose80细胞分别对化合物i
5a
和cddp的摄取量。从图7中，可以看出，无论是a2780的全细胞还是细胞核，对i
5a
(全细胞，763.53
±
14.81pg pt/106cells；细胞核中，84.4
±
1.77pg pt/106cells)的摄取量均显著高于cddp(全细胞，98.34
±
23.0pg pt/106cells；细胞核，24.78
±
1.55pg pt/106cells)。
[0066]
图8是化合物i
5a
和cddp分别在a2780细胞和iose80细胞中dna上pt的含量。从图8可以看出，在a2780细胞中，化合物i
5a
(22.56pg pt/μgdna)铂化dna水平显著高于顺铂(5.18pg pt/μgdna)。且化合物i
5a
在a2780肿瘤细胞中铂化dna水平(22.56pg pt/μgdna)高于其在卵巢正常细胞iose80中的水平(5.67pg pt/μgdna)。
[0067]
图9是利用顺铂探针考察化合物i
5a
在a2780细胞和iose80细胞中转化成顺铂的情况。从图9左图可以看出，0h时，a2780细胞和iose80细胞内的荧光较弱，表明细胞内几乎没有顺铂，但是3h后，a2780细胞内产生较强的荧光，表明顺铂含量较多，而iose80细胞内荧光仍较弱，表明细胞内顺铂含量较少。右图则是共聚焦显微镜图片中的荧光强度的数据统计图，可以看出3h后，a2780细胞内的荧光强度明显高于0h，同时a2780细胞内的荧光强度也是明显高于iose80细胞内的荧光强度。由上可知，化合物i
5a
在a2780肿瘤细胞中产生的顺铂明显高于在iose80正常细胞中产生的顺铂。
[0068]
实施例3：研究化合物i
5a
在斑马鱼体内的抗肿瘤增殖抑制活性。
[0069]
首先在幼年斑马鱼的卵黄部位移植入一定量的被celltracker
tm cm-dil荧光染料标记的a2780细胞，然后让斑马鱼生长24h，在共聚焦显微镜下可以看出斑马鱼卵黄部位具有强烈的黄色荧光，从而构建成功肿瘤细胞的斑马鱼实验模型。接下来将已经植入肿瘤细胞的斑马鱼分别与含有i
5a
(1μm)、顺铂(1μm)和不添加其他化合物的斑马鱼培养液饲养，72h后，在共聚焦显微镜下观察斑马鱼体内的黄色荧光分布，并统计相应的荧光强度值，从而评估化合物i
5a
抗肿瘤增殖抑制效果。图10是进一步研究化合物i
5a
在斑马鱼体内的抗肿瘤增殖抑制活性。从图10可以看出，相比于对照组，当斑马鱼与化合物i
5a
共同孵化72h后，斑马鱼体内的荧光分布明显减少，证明化合物i
5a
在斑马鱼体内有效抑制肿瘤细胞的生长，并且效果优于顺铂。右边荧光强度的统计图也验证了这一结论。
[0070]
实施例4：研究化合物i
5a
在斑马鱼体内no释放情况。
[0071]
首先在幼年斑马鱼的卵黄部位移植入一定量的被celltracker
tm cm-dil荧光染料标记的a2780细胞，然后让斑马鱼生长24h，在共聚焦显微镜下可以看出斑马鱼卵黄部位具有强烈的黄色荧光，从而构建成功肿瘤细胞的斑马鱼实验模型。将斑马鱼先与daf-fm da探针在37℃下孵化40分钟，然后在共聚焦显微镜下拍照，从而确定斑马鱼体内自身的no水平。然后将斑马鱼在纯净的斑马鱼培养液中饲养24h，使斑马鱼代谢完体内的no探针。接下来将斑马鱼分别与含有i
5a
(10μm)和不含添加其他化合物的斑马鱼培养液饲养，24h后，斑马鱼再与daf-fm da(5μm)探针在37℃下孵化40分钟，然后在共聚焦显微镜下拍照，并统计相应的荧光强度值，从而验证化合物i
5a
在斑马鱼肿瘤细胞部位是否能够选择性释放no。图11是进一步研究化合物i
5a
在斑马鱼体内no释放情况。从图11可以看出，当斑马鱼与化合物i
5a
孵化后，肿瘤部位的荧光强度明显高于对照组，从而验证了化合物i
5a
可以在斑马鱼体内具有选
择性在肿瘤部位释放no的作用，右边的荧光统计也验证了这一结论。
[0072]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。