一种基于分子生物学的香米纯度定量检测方法及其检测试剂盒与流程

1.本发明涉及生物检测技术，具体而言，涉及通过分子生物学的方法定量检测香米纯度的方法。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa)为世界上30多亿人口的主食，是最重要的粮食作物之一。作为栽培水稻类型之一的香米，由于其稻米具有独特的香味，在国内外市场上深受广大消费者的青睐，需求量不断增加。香米香软可口、营养丰富，市场售价比普通米高1-2倍，使得有些不法分子通过弄虚作假，将粒型外观相近的非香米掺杂到香米中销售以牟取暴利。因此，如何简单、准确而又快速地鉴定香米中的香米纯度一直是大家关注的难题。
3.目前,已建立多种方法用于检测水稻材料中的香味，其中咀嚼法和koh法是传统育种过程中最为常用的方法，但是这2种方法主要依靠人的感官来判定香味强弱，准确性较差，更难以实现香米含量的定量检测，因为香米的香味不仅受不同品种影响，还受不同年份气候等外在环境因素影响。近年来，随着水稻功能基因组和测序技术的快速发展，针对水稻香味基因的研究取得了较大进展，香米中香味的遗传基础比较复杂，但是多数研究者认为香味是由单个隐性基因控制的。位于水稻第8号染色体上的隐性基因fgr是一个与香味密切相关的基因，目前该基因已被分离克隆。进一步研究显示，基因fgr编码甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase homologue 2，badh2)。抑制fgr基因的表达或者敲除fgr基因，均会使badh2酶功能缺失，造成2-ap前体物质增加，进而积累2-ap使水稻产生香味，推断该基因控制着香味的合成。克隆分析发现，水稻香味基因上有15个外显子和14个内含子，在香米品种中由于该基因在第7个外显子上有8bp的碱基缺失和3个snps差异导致翻译提前终止，产生无正常功能的badh2蛋白，积累2-ap使水稻产生香味。
4.米业公司在收购香米时对品种鉴定有明确需求，希望能有简单容易操作、用时短的方法鉴定香米品种，来确保收购的稻谷的确是高纯度的香米。本领域仍需定性、定量检测香米掺伪的试剂和方法。


技术实现要素：

5.本发明提出一种与香米相关，能够有效用于香米检测的检测方法以及试剂盒。本发明有效地解决了香米中掺入其它非香米的定量鉴别的难题。
6.本发明提供了一种用于香米纯度定量检测的方法。
7.本发明提供的方法包括：
8.1)提取米样dna；
9.2)使用可扩增香米和非香米的差异片段序列的引物进行pcr扩增；
10.3)进行定量分析，确定待测米样香米纯度。
11.在本发明的一个具体实施方案中，所述定量分析包括测序、荧光检测中的一种或
多种。
12.在本发明的一个具体实施方案中，所述步骤2)的pcr扩增中还包括非香米特异探针和香米特异探针，以及，任选的，内源参照探针。
13.在本发明的一个具体实施方案中，所述提取米样dna包括提取待测米样dna。
14.在本发明的一个具体实施方案中，包括提取标准样品米样dna。
15.在本发明的一个具体实施方案中，所述标准样品米样为包含不同比例的香米和/或与非香米的米样。
16.在本发明的一个具体实施方案中，所述标准样品米样为包含以下比例的米样中的一个或多个，优选包含5个以上：100％香米、95％香米、90％香米、85％香米、80％香米、75％香米、70％香米、65％香米、60％香米、55％香米、50％香米、45％香米、40％香米、35％香米、30％香米、25％香米、20％香米、15％香米、10％香米、5％香米、和0％香米。
17.在本发明的一个具体实施方案中，所述标准样品米样为包含5个以上米样中。
18.在本发明的一个具体实施方案中，所述香米和非香米的差异片段序列为第8号染色体第21,748,989位点。
19.在本发明的一个具体实施方案中，所述可扩增香米和非香米的差异片段序列的引物为badh2-7-lf1和badh2-7-lr1，(1)所述引物badh2-7-lf1具有seq id no:1所示序列或与之具有70％以上序列相同性的突变体，(2)所述引物badh2-7-lr1序列具有seq id no:2所示序列或与之具有70％以上序列相同性的突变体，或(3)(1)或(2)的互补序列。
20.在本发明的一个具体实施方案中，所述引物badh2-7-lf1序列如seq id no:1所示，所述引物badh2-7-lr1序列如seq id no:2所示。
21.在本发明的一个具体实施方案中，所述非香米特异探针为badh2-7-22mgb-p，所述badh2-7-22mgb-p序列如seq id no:3所示；所述香米特异探针为badh2-7-vic-p4，所述badh2-7-vic-p4序列如seq id no:5所示，所述内源参照探针为badh2-7-cy5-p5，所述badh2-7-cy5-p5序列如seq id no:4所示，所述非香米特异探针、香米特异探针、内源参照探针所用荧光标记不同。
22.在本发明的一个具体实施方案中，所述非香米特异探针、香米特异探针、内源参照探针所用荧光标记分别为选自fam、vic、cy5中的一种。
23.在本发明的一个具体实施方案中，所述对荧光定量pcr数据进行分析为将非香米特异探针的ct值与内源参照探针的ct值相减后的值δct，再与0％香米含量的参照样本的δct相减，得到的δδct的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，用于样品中非香米含量的定量判断。将香米特异探针的ct值与内源参照探针的ct值相减后的值δct，再与100％香米含量的参照样本的δct相减，得到的δδct的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，用于样品中香米含量的定量判断。
24.本发明还提供了一种定量检测香米纯度的方法。
25.本发明提供的方法包括：
26.1)提取待测米样dna和标准样品米样dna，所述标准样品米样为包含香米和/或非香米的米样；在本发明的一个优选实施方案中，所述标准样品米样为包含以下比例的米样中的一个或多个：100％香米、95％香米、90％香米、85％香米、80％香米、75％香米、70％香米、65％香米、60％香米、55％香米、50％香米、45％香米、40％香米、35％香米、30％香米、
25％香米、20％香米、15％香米、10％香米、5％香米、和0％香米；在本发明的一个优选实施方案中，所述标准样品米样为包含以上比例中的5个以上；
27.2)分别以步骤1)中提取的dna为模板，使用引物badh2-7-lf1和badh2-7-lr1，非香米特异探针badh2-7-22mgb-p，香米特异探针badh2-7-vic-p4，与内源参照探针badh2-7-cy5-p5进行实时荧光pcr检测；
28.所述引物badh2-7-lf1序列如seq id no:1所示，所述引物badh2-7-lr1序列如seq id no:2所示；所述badh2-7-22mgb-p序列如seq id no:3所示；所述badh2-7-vic-p4序列如seq id no:5所示，所述badh2-7-cy5-p5序列如seq id no:4所示；
29.所述非香米特异探针、香米特异探针、内源参照探针所用荧光标记不同；在本发明的一个优选实施方案中，荧光标记分别为选自fam、vic、cy5、hex、texas red、rox中的一种；在本发明的一个优选实施方案中，所述非香米特异探针、香米特异探针、内源参照探针所用荧光标记分别为fam、vic和cy5中的一种；
30.3)对荧光定量pcr数据进行分析，确定待测米样中香米和/或非香米纯度。
31.在本发明的一个具体实施方案中，所述对荧光定量pcr数据进行分析为将非香米特异探针的ct值与内源参照探针的ct值相减后的值δct，再与0％香米含量的参照样本的δct相减，得到的δδct的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，用于样品中非香米含量的定量判断。将香米特异探针的ct值与内源参照探针的ct值相减后的值δct，再与100％香米含量的参照样本的δct相减，得到的δδct的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，用于样品中香米含量的定量判断。
32.本发明还提供了一种用于香米纯度定量检测的试剂盒。
33.本发明提供的试剂盒包括：
34.1)引物：badh2-7-lf1和badh2-7-lr1；和
35.2)探针：非香米特异探针badh2-7-22mgb-p，香米特异探针badh2-7-vic-p4，与内源参照探针badh2-7-cy5-p5；
36.所述引物badh2-7-lf1序列如seq id no:1所示，所述引物badh2-7-lr1序列如seq id no:2所示；所述badh2-7-22mgb-p序列如seq id no:3所示；所述badh2-7-vic-p4序列如seq id no:5所示，所述badh2-7-cy5-p5序列如seq id no:4所示。
37.本发明基因突变检测及其应用的优点：
38.本发明是利用分子生物学方法定量检测香米掺伪，从稻谷(米样)中快速提取dna，用开发的高效灵敏的香味基因特异荧光探针和引物进行荧光定量pcr扩增，通过设置内源参照基因与参照样本再对扩增数据进行定量分析，从而对香米纯度进行定量判断，结果直观客观，可避免人为判断，操作方便快捷，可大大减少错误判断的概率，且不受品种、地域、环境等带来的影响，检测更灵敏更高效。
39.本发明内源参照基因检测设计独特，和非香米特异性检测、香米特异性检测在同一段基因序列上，共用相同的引物，使内源参照序列总量正好为香米与非香米序列的总和，优于其它拷贝数未知的水稻内源参照基因，也避免了不同基因不同位点dna扩增效率不同带入的影响。
40.本发明在建立香米定量检测方法的基础上开发出“香米纯度检测试剂盒”(code no.:bwd-001)，本试剂盒是一种能够对香米纯度进行快速有效检测的产品，使用快速粗提
的dna即可检测，pcr体系为三荧光检测体系，包含非香米特异探针i、香米特异探针ii和水稻内源参照探针iii，非香米特异探针i、香米特异探针ii和水稻内源参照探针iii是的荧光分别为fam荧光、vic荧光、cy5荧光中的一种，按照一定比例配制成混合溶液真空干燥为干粉制剂，不仅使用方便，增加了检测的稳定性，更使检测试剂盒便于常温运输。
附图说明
41.图1：香米和非香米荧光探针法检测引物探针位置图。
42.图2：非香米和香米不同含量定量数据图。从左到右依次为：纯香米标样，5％非香米标样，10％非香米标样，50％非香米标样，90％非香米标样，95％非香米标样，纯非香米标样。
43.图3：不同内参基因定量数据图。从左到右依次为：纯香标样，从左到右依次为：0％非香米标样，0％非香米标样10倍稀释样，0％非香米标样100倍稀释样，5％非香米标样，5％非香米标样10倍稀释样，5％非香米标样100倍稀释样，50％非香米标样，50％非香米标样10倍稀释样，50％非香米标样100倍稀释样，95％非香米标样，95％非香米标样10倍稀释样，95％非香米标样100倍稀释样，100％非香米标样，100％非香米标样10倍稀释样，100％非香米标样100倍稀释样。
44.图4：香米盲样纯度检测。从左到右依次为：0％非香米标样，5％非香米标样，50％非香米标样，95％非香米标样，100％非香米标样，检测样品1，检测样品2，检测样品3。
具体实施方式
45.发明人通过对水稻中香味物质关键基因设计高效灵敏的非香米特异性引物和探针进行实时荧光pcr扩增，来判断香米是否掺入非香米，并通过设置检测同一位点上的内源参照探针，与参照样本比对再对扩增数据进行定量分析，从而对香米含量进行定量判断。
46.具体地，本发明涉及用于检测所述基因突变的引物和试剂盒，所述引物、试剂盒在香米纯度检测中的用途，以及检测香米纯度的方法。
47.本文中与水稻香味相关的基因突变：seq id no:11所示核苷酸序列第102位碱基tatat或aaaagattatggc。
48.本文中，基因突变，指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。例如转换、颠换、插入和缺失等。
49.本文中，水稻品种指经选育而具有不同性状的水稻品系。本文中，香米的基因突变序列是tatat，非香米的基因突变序列是aaaagattatggc。因此，通过检测样品中的上述基因突变位置，能够有效地确定水稻品种是香米还是非香米。
50.本文所述“样品”是来自对象的任意类型的含多核苷酸的样品。优选地，本文所述样品来自或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸或包含水稻植物器官、组织、细胞、核酸的产品，包括但不限于水稻叶片、根、茎、花、果实、种子、细胞、dna、rna、大米、碎米、米糠、稻壳、加工或未加工的大米食物例如米粉、米线。dna可以是基因组dna。
51.术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸聚合物(rna)，及其互补物。核酸含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的示例包括单链和双
链dna，单链和双链rna，以及具有单链和双链dna和rna的混合物的杂合分子。dna可以是编码链或非编码链。在一个或多个实施方案中，所述样品包含经片段化的基因组dna。获取基因组dna并片段化的方法本领域周知。
52.dna基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个脱氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。dna的碱基(bp)主要有腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)。在双链dna的双螺旋结构中，a与t经氢键配对，g与c经氢键配对。dna形式包括cdna、基因组dna、片段化dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
53.本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物组合物包含一种或多种引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条dna模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条dna模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(pcr)、qpcr、测序和探针合成等。引物可以为任意长度，例如5-200bp，10-100bp，20-800bp或25-50bp。
54.本发明引物用于检测基因突变。在一些实施方式中，引物具有(1)seq id no:1-2中任一项所示的核苷酸序列或与之具有70％序列相同性的突变体，或(2)(1)的互补序列。在一个或多个实施方案中，引物是引物对，引物对分别具有seq id no:1-2所示序列。
55.本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的seq id no:1-11)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。可采用例如ncbi的blastn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(a与g)的互换，嘧啶核苷酸之间的(t或u与c)的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
56.本文所述“探针”是识别目的序列(与目的序列互补)的核酸序列(dna或rna)。探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，从而显示目的基因。探针可以包括整个目的序列，也可以是目的序列的片段。探针可以是dna，也可以是由之转录而来的rna。通常，探针带有检测标记，例如荧光标记。所述荧光标记包括但不限于fam、cy5和vic。本领域知晓适用于本文探针的荧光标记以及将其与探针连接的方法。
57.本文中，探针识别seq id no:11的片段，所述片段包含seq id no:11自5’端起第102位碱基。在一个或多个实施方案中，探针选自以下的一种或多种：(1)识别seq id no:6的片段的探针，所述片段包含seq id no:6自5’端起第102-106位碱基，所述碱基是tatat，(2)识别seq id no:7的片段的探针，所述片段包含seq id no:7自5’端起第102-114位碱
基，所述碱基是aaaagattatggc，(3)(1)或(2)的互补序列。优选地，所述探针具有(1)seq id no:3或5所示的核苷酸序列或与之具有70％序列相同性的突变体，或(2)(1)的互补序列。
58.本发明另一方面提供检测样品中水稻品种的方法，包括通过对待测样品进行本文所述的基因突变的检测，确定或定量香米含量。所述方法进一步包括：(1)提取待测样品的dna；(2)利用本文所述的引物和/或探针，确定或定量所述dna中的本文所述基因突变的基因型；和(3)基于(2)的结果，确定或定量香米含量。
59.本文中，提取样品中dna的方法不受特别限制，本领域周知适用于本文的dna提取方法。
60.本领域周知适用于本文的基因突变检测方法，包括但不限于：测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(pcr single strand conformation polymorphism，pcr-sscp)、实时荧光定量pcr与高分辨率熔解曲线分析(hrm)、荧光探针法定量pcr、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(pcr-restriction fragment length polymorphism，pcr-rflp)及飞行时间质谱等。本领域知晓snp标记检测方法中所需的除引物和/或探针以外的其他试剂。
61.根据本发明的另一些具体示例，通过对待测样品进行本文所述的snp标记的检测来确定或定量水稻品种的方法，进一步包括：提取样品中的dna；利用引物seq id no:1和2，探针seq id no:3和5，以及参照探针seq id no:4，进行dna的荧光定量pcr；获得所述dna中的本文所述基因突变的基因型；以及基于所述基因突变的基因型，确定或定量香米含量。
62.本发明利用香米区别于非香米的特异序列，设计高效灵敏的香米特异性引物和探针，对样本dna进行实时荧光pcr扩增，通过设置内源参照基因与参照样本再对扩增数据进行定量分析，从而对香米纯度进行定量判断。基于分子生物学的香米纯度定量检测，有效地解决了香米中掺入非香米的定量鉴别的难题。
63.下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中未具体描述的材料、试剂和方法，均未本领域常规的材料、试剂和方法。
64.实施例
65.实施例1：材料和方法
66.1.材料
67.不同香米、非香米品种种子与大米样本均由市场购买提供。
68.2.酶与试剂
69.酶购自康为世纪公司和bio-rad公司，试剂购自国药集团化学试剂有限公司，荧光定量pcr仪bio-rad cfx96；实验中用到的引物和探针均由上海生工生物工程公司合成。
70.3.实验方法
71.3.1水稻种子(米样)dna提取
72.分别取20克水稻种子(米样)，使用研磨机磨碎，称取50mg粉末到2ml样品裂解管中，加入500μl buffer 1，涡旋仪振荡混匀30s，52℃下孵育30min，转速1200rpm；加入500μl buffer 2，涡旋仪振荡混匀30s，将混合物离心5min(12000rpm)，吸取500μl上清备用，提取所得dna溶液用灭菌纯水稀释10倍为模板dna，获得不同水稻种子的dna模板，置于样品稀释管中备用，4℃短期存放，-20℃长期保存。
73.3.2badh2基因特异性引物与探针设计
74.针对香米和非香米特异片段序列，primer5设计特异性引物。
75.探针检测法引物：
76.badh2-7-lf1：5
’-
cctgtaatcatgtataccccatc-3’(seq id no:1)；
77.badh2-7-lr1：5
’-
gagagttagtagaaagagaac-3’(seq id no:2)；
78.设计探针：
79.badh2-7-22mgb-p：5
’-
fam-aactggtaaaaagattatggct-mgb-3’；(seq id no:3)；
80.badh2-7-cy5-p5：5
’-
cy5-aaccttaaccataggagcagctg-bhq1-3’。(seq id no:4)；
81.badh2-7-vic-p4：5
’-
vic-tatgaaactggtatatatttcagc-mgb-3’；(seq id no:5)。
82.香米核酸序列(180bp)：
83.cctgtaatcatgtataccccatcaatggaaatgatattcctctcaatacatggtttatgttttctgttaggttgcatttactgggagttatgaaactggtatatatttcagctgctcctatggttaaggtttgtttccaaatttctgtggatattttttgttctctttctactaactctc(seq id no:6，图1)。
84.非香米核酸序列(188bp)：
85.cctgtaatcatgtataccccatcaatggaaatgatattcctctcaatacatggtttatgttttctgttaggttgcatttactgggagttatgaaactggtaaaaagattatggcttcagctgctcctatggttaaggtttgtttccaaatttctgtggatattttttgttctctttctactaactctc(seq id no:7，图1)。
86.内源基因sps引物：
87.sps-f：5
’-
ttgcgcctgaacggatat-3’；(seq id no:8)；
88.sps-r：5
’-
cggttgatcttttcgggatg-3’；(seq id no:9)。
89.内源基因sps探针：
90.sps-cy5-p6：5
’-
cy5-tccgagccgtccgtgcgtc-bhq1-3’(seq id no:10)。
91.实施例2：非香米和香米实时荧光定量pcr检测
92.分别以提取的dna为模板，使用引物badh2-7-lf1和badh2-7-lr1，非香米特异探针badh2-7-22mgb-p，香米特异探针badh2-7-vic-p4，与内源参照探针badh2-7-cy5-p5进行实时荧光pcr检测。pcr反应体系为20μl，其中2
×
goldstar best mastermix 10μl，badh2-7-lf1引物(浓度为10μm)1.5μl，和badh2-7-lr1引物(浓度为10μm)1.5μl，badh2-7-22mgb-p探针、badh2-7-vic-p4探针和badh2-7-cy5-p5探针(浓度为10μm)各0.25μl，模板dna 2μl，无菌水补齐至20μl。空白对照以无菌水代替模板dna。每个反应做三个重复，pcr扩增程序采用两步法：95℃预变性10min；95℃变性15s；52℃退火延伸45s，共45个循环。
93.首先对探针法进行特异性分析，非香米特异性探针badh2-7-22mgb-p只在非香米中有扩增信号，香米中均没有扩增信号，香米特异性探针badh2-7-vic-p4只在香米中有扩增信号，非香米中均没有扩增信号。对荧光定量pcr数据进行分析，可进行样品中非香米和香米含量的定量，具体方法如下：采用2-δδct
方法进行，以badh2基因badh2-7-cy5-p5探针为内源参照基因，将样品中badh2基因badh2-7-22mgb-p探针的ct值与badh2-7-cy5-p5探针的ct值相减后的值δct，再与100％非香米含量的参照样本的δct相减，得到的δδct的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，用于样品中非香米含量的定量判断。以badh2-7-cy5-p5探针为内源参照基因，将样品中badh2-7-vic-p4探针的ct值与badh2-7-cy5-p5探针的ct值相减后的值δct，再与100％香米含量的参照样本的δct相减，得到的δδct的负数进行2次方得到一个相对含量的数值，用于样品中香米含量的定量判断。
cy5-p6作为内参基因时，不同浓度稀释的样品dna检测含量有一定差异。在香米特异性检测位点同一片段上设计内参探针，与通用sps基因内参检测比对检测结果稳定，不受dna浓度影响。
99.实施例4：香米盲样纯度检测
100.对配置的3香米产品的盲样样品进行检测，按实施例2的方法进行dna提取、荧光定量pcr扩增和数据分析，结果显示(图4)，检测样品1香米纯度为95％，检测样品2香米纯度为58％，检测样品3香米纯度为77％，，三个盲样的检测结果和配比基本一致，配比的含量：米样1为95％香米，米样2含60％香米，米样3含80％香米。
101.上述结果显示：设置和非香米特异性检测、香米特异性检测在同一段基因序列上的内参探针，优于其他通用的水稻内源参照基因，避免了dna浓度的影响。用开发的高效灵敏的香米和非香米特异荧光探针和引物同时进行荧光定量pcr扩增，并设置参照样本，再对扩增数据采用2-δδct
方法进行分析，计算得出的数值即为香米的纯度含量，结果直观可靠。