一种改进的鲑鱼促性腺激素释放激素的固相合成方法与流程

本发明涉及医药
技术领域：
，特别是涉及一种改进的鲑鱼促性腺激素释放激素的固相合成方法。
背景技术：
：促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，gnrh)由下丘脑分泌，刺激或抑制垂体促性腺激素的分泌，有相当的活性潜能。促性腺激素释放激素类似物(gnrha)可以直接作用于肿瘤组织，引起细胞的凋亡。促性腺激素在胚胎工程重要用途。向雌性动物注射促性腺激素，可以促进其超数排卵。对供体雌性动物和受体动物注射促性腺激素，可以促进其同期发情，从而提高胚胎在受体雌性动物体内的成活几率。使下丘脑分泌产生的神经激素，对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为10个氨基酸的肽，目前已能人工合成。能使黄体生成素释放，也能使促卵泡激素释放。较集中分布于正中隆起外侧区，弓状核、下丘脑视前区、多突室管膜细胞、松果体等处也有分布。而对于现代的鱼类养殖业而言，通过鲑鱼促性腺激素释放激素促进亲鱼性腺发育的目的，使亲鱼发育速度快，成熟率高，性腺指数高。来提高人工繁殖的成功率批量获得优质受精卵，有很高的市场价值。比如中国鲤科养殖鱼类的繁殖一般采用人工繁殖生理生态法，整个过程分亲鱼培育、催情、授精和孵化4个环节。①亲鱼培育。是将达到性成熟年龄的亲鱼培育至性腺发育成熟的过程。②催产。对卵巢出现上述性状的亲鱼，须注射催产剂促其发情、产卵。③授精。有自然授精和人工授精两种。自然授精是催产后的亲鱼在产卵池中自行产卵、排精、完成受精作用。人工授精是在亲鱼发情高潮将要产卵时，进行采卵、采精，使成熟的精、卵在盛器内完成授精作用。④孵化。将受精卵置于孵化环道、孵化桶等工具中进行。采用以上常规的鱼类人工繁殖方法实施乌原鲤的人工繁殖，存在鱼卵受精率低，易感染水霉菌，孵化率低，鱼苗成活率低的问题，难以大规模生产鱼苗。在这种情况下，通过强化亲鱼培育管理，选择成熟亲鱼，注射适合的催情剂及剂量促其发情、产卵，采用人工授精、脱粘提高受精率，调节孵化器水的流速，预防卵膜早破，可以实现鱼苗鱼种的规模化生产。综上所述，目前合成鲑鱼促性腺激素释放激素的报道较少，需要一种高效、稳定生产的工艺来满足市场需求。技术实现要素：基于此，有必要针对
背景技术：
中存在的问题，本发明的技术方案是提供一种改进的鲑鱼促性腺激素释放激素的固相合成方法，包括以下步骤：1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成鲑鱼促性腺激素释放激素pyr-his-trp-ser-tyr-gly-trp-leu-pro-gly-nh2；2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到鲑鱼促性腺激素释放激素粗品。在其中一个实施例中，步骤1)中，保护氨基酸单体为：boc-pyr-oh，fmoc-his(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ser(but)-oh，fmoc-tyr(but)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh。在其中一个实施例中，步骤1)中，所述的脱帽试剂哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％。在其中一个实施例中，步骤1)中，所述的缩合剂为：hbtu、hatu、tatu、tbtu、pybop、bop、dic、dcc其中的一种。在其中一个实施例中，步骤2)中，所述的切肽试剂为：三氟乙酸溶液。在其中一个实施例中，步骤2)中，所述的鲑鱼促性腺激素释放激素粗品的纯度可以达到90％以上。在其中一个实施例中，步骤1)中合成步骤如下：(1).合成gly-树脂；(2).合成pro-gly-树脂；(3).合成leu-pro-gly-树脂；(4).合成trp(boc)-leu-pro-gly-树脂；(5).合成gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂；(6).合成tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂；(7).合成ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂；(8).合成trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂；(9).合成his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂；(10).合成boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成。在其中一个实施例中，步骤2)中合成步骤如下：1)将树脂肽用甲醇洗涤3～5遍，真空干燥20～30小时；2)配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)；3)取适量裂解液倒入反应器中反应20～40min，收集反应液，重复反应四遍，收集裂解液，浓缩至少量。4)加入冷乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥后得到粗品。本发明的优点和有益效果如下：1)首次报道哌嗪溶液作为脱帽试剂合成鲑鱼促性腺激素释放激素，方便购买、运输和储存，且不容易变坏，并且价格便宜；3)合成鲑鱼促性腺激素释放激素粗品的纯度高，对于后面的纯化工艺将会非常简单；4)适合大规模工业化生产，未用到任何有毒和易制毒试剂，没有剧烈的化学反应，方便自动化生产。附图说明图1为本发明的实施例1的鲑鱼促性腺激素释放激素粗品的hplc图。图2为本发明的实施例1的鲑鱼促性腺激素释放激素粗品的ms图。图3为实施例2的鲑鱼促性腺激素释放激素粗品的hplc图。具体实施方式实施例1一种改进的鲑鱼促性腺激素释放激素的固相合成方法，包括以下步骤：1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成鲑鱼促性腺激素释放激素pyr-his-trp-ser-tyr-gly-trp-leu-pro-gly-nh2；2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到鲑鱼促性腺激素释放激素粗品。5g树脂投料表如下：名称分子量质量mgrink-amideresin(取代率0.8mmol/g)5000fmoc-gly-oh2972376fmoc-pro-oh3372696fmoc-leu-oh353.42827.2fmoc-trp(boc)-oh526.64212.8fmoc-gly-oh2972376fmoc-tyr(tbu)-oh459.53676fmoc-ser(tbu)-oh383.43067.2fmoc-trp(boc)-oh526.64212.8fmoc-his(boc)-oh477.513820.08boc-pyr-oh229.21833.6hbtu379.242973.242diea129.241240.704优选地，步骤1)中，保护氨基酸单体为：boc-pyr-oh，fmoc-his(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ser(but)-oh，fmoc-tyr(but)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh。优选地，步骤1)中，所述的脱帽试剂哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；更优选地，溶剂为dmf，哌嗪溶液地质量浓度为3％。优选地，步骤1)中，所述的缩合剂为：hbtu、hatu、tatu、tbtu、pybop、bop、dic、dcc其中的一种。具体地，步骤1)合成过程如下：1.gly-树脂的合成：(1)将树脂称于50ml多肽反应器中，dmf洗涤4遍，浸泡过夜；(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。(3)称取fmoc-gly-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(4)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。2.pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-pro-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。3.leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-leu-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应3小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。4.trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。5.gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-gly-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。6.tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-tyr(tbu)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。7.ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-ser(tbu)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-his(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：称取boc-pyr-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。11.鲑鱼促性腺激素释放激素粗品合成(1)将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时；(2)配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取15ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍，收集裂解液，浓缩至少量；(3)加200ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥，称量得4.6g，产率86％，纯度94％，hplc分析图谱见附图1，ms图谱见附图2。参见图1，分析方法如下：安捷伦1260型hplc，krosmail100-5c18column4.6*250mm；流动相：缓冲液：0.1m磷酸，三乙胺调节ph至3，缓冲液:乙腈:甲醇＝70:20:10；等度洗脱；λ＝230nm；流速＝1.0ml/min。实施例2一种改进的鲑鱼促性腺激素释放激素的固相合成方法，包括以下步骤：步骤1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成鲑鱼促性腺激素释放激素pyr-his-trp-ser-tyr-gly-trp-leu-pro-gly-nh2。100g树脂投料表如下：1.gly-树脂的合成：(1)将树脂称于1000ml多肽反应器中，量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。(2)dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。(3)称取fmoc-gly-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(4)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。2.pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-pro-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。3.leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-leu-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应3小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。4.trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。5.gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-gly-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。6.tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-tyr(tbu)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。7.ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-ser(tbu)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：(1)称取fmoc-his(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。(2)量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-trp(boc)-leu-pro-gly-树脂的合成：称取boc-pyr-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。11.鲑鱼促性腺激素释放激素粗品合成用切肽试剂切肽后浓缩，得到鲑鱼促性腺激素释放激素粗品。(1)将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时；(2)配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取300ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍，收集所有裂解液；(3)浓缩，浓缩至少量时，加500ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，用乙酸乙酯将沉淀洗涤3遍；(4)过滤收集沉淀，真空干燥，称量得98.2g，产率92.6％，纯度93％，hplc分析图谱见附图3。参见图3，分析方法如下：安捷伦1260型hplc，krosmail100-5c18column4.6*250mm；流动相：缓冲液：0.1m磷酸，三乙胺调节ph至3，缓冲液:乙腈:甲醇＝70:20:10；等度洗脱；λ＝230nm；流速＝1.0ml/min。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12