重组抗CD171八价抗体及神经来源外泌体的捕获方法与流程

重组抗cd171八价抗体及神经来源外泌体的捕获方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生化分子技术领域，特别是涉及一种重组抗cd171八价抗体及神经来源外泌体的捕获方法。


背景技术：

[0002]
以阿茨海默病(alzheimer disease,ad)为代表的神经系统疾病是一种常见于老年人的神经退行性疾病，其主要病理变化是大脑皮质弥散性萎缩、神经原纤维缠结和神经细胞间大量老年斑形成等，以进行性认知障碍和记忆功能减退为其主要临床症状。痴呆症是人类的问题，也是一个全球性的问题。早期诊断、及时干预是目前唯一有效延缓疾病进展的措施。对于ad的早期诊断主要依赖于临床病史、影像方面的检测、量表的测评以及csf(脑脊液)标志物的检测。pet等影像方面的检查，不仅价格昂贵，且对设备要求高，尚不能在一般医院大规模开展。心理量表的测评虽然检测方便，但受到的影响因素较多，如受试者的文化程度、测评者的主观判断或环境影响等。而csf标志物aβ、tau等均已被验证具有极高的特异性和灵敏度，但由于腰椎穿刺有创，样品标本不易获得而限制了临床应用。血浆较脑脊液易获得，易于进行临床开展，然而对于外周血中aβ1-42(人β淀粉样蛋白1-42)的研究结果存在差异，其原因可能与血浆中aβ1-42不止来源于中枢神经系统有关。
[0003]
血浆神经系统来源外泌体标志物的检测有助于ad的无创早期诊断。外泌体作为一种细胞间交流方式，在中枢神经系统参与形成神经元-胶质信号网络，脑胶质细胞通过分泌外泌体的方式穿过血脑屏障进入到血液中，同时外泌体携带了与ad发病相关的多种标志物蛋白，如tau蛋白和aβ等。但是，目前捕获外泌体的方法仍效果不佳，难以进行高效地富集。


技术实现要素：

[0004]
基于此，有必要提供一种可用于高效捕获神经来源外泌体的重组抗cd171八价抗体。
[0005]
一种重组抗cd171八价抗体，包括两条相同的多肽链，且两条所述多肽链之间通过共价键结合；所述多肽链从一端到另一端依次包括两个第一抗体的可变区、第一接头肽和两个第二抗体的可变区；所述可变区包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区之间通过第二接头肽连接；所述第一抗体的重链可变区序列如seq id no:1所示，所述第一抗体的轻链可变区序列如seq id no:2所示；所述第二抗体的重链可变区序列如seq id no:3所示，所述第二抗体的轻链可变区序列如seq id no:4所示，所述第一接头肽包括铰链区序列和连接于所述铰链区序列一端或两端的柔性接头序列。
[0006]
本发明的重组抗cd171八价抗体是一种八价抗体，通过两条相同的双特异性scfv多肽链共价结合形成，既能与cd171蛋白上的ig样c2型第1结构域(ig-like c2-type 1)结合，又能与cd171蛋白上的纤连蛋白3型第5结构域(fibronectin type-iii 5结构域)结合。利用该重组抗体捕获神经来源外泌体具有特异性高、快速、稳定等优势，可保证捕获外泌体的高丰度，并维持超强的神经组织特异性。本发明的重组抗cd171八价抗体为外泌体神经来
源标志物的临床诊断的开展提供了更加有力的支持，可用于检测以神经来源外泌体的生物标记物的异常变化为表征的神经系统疾病早筛、进展监控或治疗效果评价等多方面的应用。
[0007]
在其中一个实施例中，所述铰链区序列如seq id no:5所示，所述柔性接头序列为(ggggs)
n
，n为1～6的自然数。
[0008]
在其中一个实施例中，所述第一接头肽的氨基酸序列如seq id no:6所示，所述第二接头肽的氨基酸序列如seq id no:7所示。
[0009]
在其中一个实施例中，所述多肽链的氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0010]
本发明还提供了上述重组抗cd171八价抗体在制备用于捕获神经来源外泌体的产品中的应用。
[0011]
本发明还提供了一种非疾病诊断和治疗目的的神经来源外泌体的捕获方法，利用上述重组抗cd171八价抗体与神经来源外泌体的特异性结合反应富集所述神经来源外泌体。
[0012]
在其中一个实施例中，包括以下步骤：将上述重组抗cd171八价抗体与固相载体偶联，然后与含有神经来源外泌体的样品混合孵育，使所述重组抗cd171八价抗体与所述神经来源外泌体特异性结合，然后分离所述固相载体。
[0013]
在其中一个实施例中，所述固相载体选自磁珠和树脂，所述含有神经来源外泌体的样品选自血清、血浆、血液、尿液、唾液和脑脊液。
[0014]
本发明还提供了一种外泌体捕获试剂盒，包括上述重组抗cd171八价抗体、缓冲液和固相载体。
[0015]
本发明还提供了一种表达载体，其含有编码所述多肽链的基因序列。
[0016]
在其中一个实施例中，编码所述多肽链的基因序列如seq id no:9所示。
[0017]
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述表达载体。
[0018]
在其中一个实施例中，所述宿主细胞为cos细胞、cho细胞、ns0细胞、sf9细胞、sf21细胞、dh5α细胞或bl21细胞。
附图说明
[0019]
图1为本发明一实施例的重组抗cd171八价抗体的结构示意图；
[0020]
图2为实施例1中重组抗cd171八价抗体的sds-page图，其分子量为200kd左右；
[0021]
图3为实施例1中重组抗cd171八价抗体表位验证westernblot图，与cd171抗体1及cd171抗体2相比，能同时与cd171表位1(ig-like c2-type 1结构域)及cd171表位2(fibronectin type-iii 5结构域)反应，表明其具有双表位；
[0022]
图4为实施例3中利用重组抗cd171八价抗体捕获外泌体后的nta检测图，显示颗粒直径介于58nm～182nm之间；
[0023]
图5为实施例3中在wb水平上不同捕获抗体对外泌体的捕获效果，表明相较于cd171抗体(5g3)及cd63抗体，利用重组抗cd171八价抗体能捕获更多的外泌体；
[0024]
图6为实施例4中配对脑脊液及血浆cd171八价抗体捕获外泌体中aβ42检测浓度的相关性图。
具体实施方式
[0025]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0026]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
[0027]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
[0028]
术语解释
[0029]“抗体”是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体以一个或者多个y字形单体存在，每个y字形单体由4条多肽链组成，包含两条相同的重链和两条相同的轻链，轻链和重链是根据它们的分子量大小来命名的。y字形结构的顶端是可变区，为抗原结合部位。每个重链有两个区即恒定区和可变区，所有同一型的抗体其恒定区都是相同的，不同型的抗体之间则存在差异。每条轻链也有两个前后相连的结构域，即一个恒定区和一个可变区。
[0030]“载体(vector)”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0031]“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
[0032]“外泌体(exosome)”是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。
[0033]
如图1所示，本发明一实施例的重组抗cd171八价抗体，包括两条相同的多肽链，且两条多肽链之间通过共价键结合，多肽链从一端到另一端依次包括两个第一抗体的可变区、第一接头肽和两个第二抗体的可变区。可变区包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区和重链可变区之间通过第二接头肽连接。第一抗体的重链可变区(vh1)序列如seq id no:1所示，第一抗体的轻链可变区(vl1)序列如seq id no:2所示；第二抗体的重链可变区(vh2)序列如seq id no:3所示，第二抗体的轻链可变区(vl2)序列如seq id no:4所示，第
一接头肽包括铰链区序列和连接于铰链区序列一端或两端的柔性接头序列。
[0034]
本发明的重组抗cd171八价抗体是一种八价抗体，通过两条相同的双特异性scfv多肽链共价结合形成，既能与cd171蛋白上的ig样c2型第1结构域(ig-like c2-type 1)结合，又能与cd171蛋白上的纤连蛋白3型第5结构域(fibronectin type-iii 5结构域)结合。利用该重组抗体捕获神经来源外泌体具有特异性高、快速、稳定等优势，可保证捕获外泌体的高丰度，并维持超强的神经组织特异性。本发明的重组抗cd171八价抗体为外泌体神经来源标志物的临床诊断的开展提供了更加有力的支持，可用于检测以神经来源外泌体的生物标记物的异常变化为表征的神经系统疾病早筛、进展监控或治疗效果评价等多方面的应用。
[0035]
在一个具体示例中，上述重组抗cd171八价抗体的两条多肽链两侧对称。
[0036]
在一个具体示例中，上述可变区从n端到c端依次包括重链可变区和轻链可变区，即多肽链从n端到c端依次包括vh1、第二接头肽、vl1、第二接头肽、vh1、第二接头肽、vl1、第一连接肽、vl2、第二接头肽、vh2、第二接头肽、vl2、第二接头肽、vh2。
[0037]
在一个具体示例中，铰链区序列如seq id no:5所示，柔性接头序列为(ggggs)
n
，n为1～6的自然数。可以理解，铰链区序列和柔性接头序列不限于此，可根据需要调整。
[0038]
在一个具体示例中，第一接头肽还可包括免疫球蛋白的ch2结构域的部分或全部序列，且ch2结构域连接于铰链区序列的c末端。
[0039]
在一个具体示例中，第一接头肽的氨基酸序列如seq id no:6所示，第二接头肽的氨基酸序列如seq id no:7所示。可以理解，第一连接肽和第二连接肽的具体氨基酸序列不限于此，可根据需要选择其他。
[0040]
在一个具体示例中，多肽链的氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0041]
本发明一实施例的神经来源外泌体的捕获方法，利用上述重组抗cd171八价抗体与神经来源外泌体的特异性结合反应富集神经来源外泌体。可以理解，该方法仅能分离得到神经来源外泌体，不包括对神经来源外泌体上的标志物进行检测分析的步骤，若不对外泌体标志物进行检测分析，并不能确定患者是否是患有某种疾病或者健康状况，因此该方法不属于专利法意义上的“疾病诊断或治疗方法”。此外，捕获的外泌体还可用于其他目的，例如作为药物载体用于药物的制备等。
[0042]
在一个具体示例中，神经来源外泌体的捕获方法具体包括以下步骤：将上述重组抗cd171八价抗体与固相载体偶联，然后与含有神经来源外泌体的样品混合孵育，使重组抗cd171八价抗体与神经来源外泌体特异性结合，然后分离固相载体。可以理解，其他利用抗原抗体特异性结合反应的方法也可根据需要选择，例如生物素-亲和素标记方法等。
[0043]
在一个具体示例中，固相载体选自磁珠和树脂，含有神经来源外泌体的样品选自血清、血浆、血液、尿液、唾液和脑脊液，但不限于此。
[0044]
本发明一实施例的外泌体捕获试剂盒，包括上述重组抗cd171八价抗体、缓冲液和固相载体。可选地，缓冲液包括磷酸盐缓冲液和gly溶液，分别作为样品稀释缓冲液和洗脱缓冲液。
[0045]
本发明一实施例的表达载体，含有编码上述多肽链的基因序列。
[0046]
在一个具体示例中，编码多肽链的基因序列如seq id no:9所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一多肽的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的
核酸序列，但不限于此。
[0047]
本发明一实施例的宿主细胞，其含有上述表达载体，或其基因组整合有编码上述多肽链氨基酸的基因序列。
[0048]
在一个具体示例中，上述宿主细胞为cos细胞、cho细胞、ns0细胞、sf9细胞、sf21细胞、dh5α细胞或bl21细胞。
[0049]
以下为具体实施例。
[0050]
实施例1重组抗cd171八价抗体表达
[0051]
分泌抗cd171蛋白ig-like c2-type 1结构域的小鼠杂交瘤细胞株克隆号为2c1，2019年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.18893。其分泌抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。分泌抗cd171蛋白fibronectin type-iii 5结构域的小鼠杂交瘤细胞株克隆号为9g12，于2019年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.18894。其分泌抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。以上两种结构域表位抗体的重链亚型均为igg1。
[0052]
图1展示了重组抗cd171八价抗体的结构示意图，其中一条多肽链从n端到c端为vh1-第二接头肽-vl1-第二接头肽-vh1-第二接头肽-vl1-第一接头肽-vl2-第二接头肽-vh2-第二接头肽-vl2-第二接头肽-vh2。其中，vh1即为原fibronectin type-iii 5结构域表位抗体的重链可变区序列，vh2为原ig-like c2-type 1结构域表位抗体的重链可变区序列，vl1为原fibronectin type-iii 5结构域表位抗体的轻链可变区序列，vl2为原ig-like c2-type 1结构域表位抗体的轻链可变区序列。第一接头肽的氨基酸序列为(ggggs)
3-vprdcgckpcict-(ggggs)
3
，第二接头肽的氨基酸序列为(ggggs)
3
。如此，则该重组抗cd171八价抗体一条多肽链的氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0053]
将含有重组抗cd171八价抗体核苷酸序列的表达载体瞬时转染至cho细胞，培养数天后，利用protein l亲和纯化细胞培养上清，获得重组抗cd171八价抗体。纯化后的抗体经sds-page验证，纯度大于90％，图2展示了重组抗cd171八价抗体的sds-page图。同时以ig-like c2-type 1和fibronectin type-iii5两个片段蛋白通过wb验证重组抗体对这两段表位的识别能力，wb(图3)显示重组抗cd171八价抗体与ig-like c2-type 1和fibronectin type-iii 5均特异反应。
[0054]
实施例2重组抗cd171八价抗体与cd171蛋白结合能力验证
[0055]
重组抗cd171八价抗体与cd171蛋白的结合通过biacore 3000进行检测。将cd171蛋白以不同浓度包被在biacore 3000的芯片上后，检测其亲和力。重组抗cd171八价抗体对cd171蛋白的亲和力显著高于母抗体，具体见表1。
[0056]
表1抗cd171八价抗体对cd171的亲和力
[0057]
抗体表位ka(1/ms)kd(1/s)kd(nm)原ig-like c2-type 1结构域表位抗体3.5
×
10
4
2.6
×
10-4
7.4原fibronectin type-iii 5结构域表位抗体1.2
×
10
4
3.8
×
10-4
32重组抗cd171八价抗体6.3
×
10
5
1.6
×
10-5
0.025
[0058]
实施例3神经来源外泌体分离及表征
[0059]
将10μg重组抗cd171八价抗体及市购抗人cd171单克隆抗体(克隆号5g3，thermo，识别表位为ig-like c2-type 1结构域)、抗人cd171单克隆抗体(克隆号uj127，thermo，fibronectin type-iii 5结构域)、抗人cd63抗体、正常小鼠igg分别偶联到m-270磁珠上。0.5ml血浆样品于2000g下离心15min，接着于12000g下离心30min，然后用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释4倍，与一组抗体-磁珠复合物旋转孵育12小时，然后用ph 2.8的甘氨酸溶液洗脱获取外泌体。
[0060]
ns500纳米颗粒分析仪定量检测外泌体：取5μl外泌体溶液按照1:200的比例加入到1ml的pbs溶液中，按照ns500仪器的操作说明进行操作。用nta软件对纳米颗粒进行粒径分析，绘制颗粒分布曲线，结果显示颗粒直径介于58nm～182nm之间，如图4所示。
[0061]
wb检测外泌体表面标志物蛋白：外泌体样品进行sds-page电泳后转膜，孵育cd171抗体和cd81抗体后，孵育二抗检测蛋白标志物。同时使用cd81蛋白检测试剂盒和cd171蛋白检测试剂盒在elisa水平上分别检测不同抗体对外泌体的捕获的效果。图5和表2分别显示了在wb水平上和elisa水平上不同捕获抗体对外泌体的捕获效果，可以看出重组抗cd171八价抗体对于神经来源外泌体具有更加高效的捕获效果。
[0062]
表2外泌体cd81和cd171蛋白含量
[0063][0064]
实施例4神经来源外泌体中aβ含量的检测
[0065]
收集ad患者血浆和csf配对样本60例，正常人血浆和csf配对样本20例，血浆神经来源外泌体采用实施例1的重组抗cd171八价抗体按照实施例3的方法进行捕获。使用aβ42检测试剂盒分别检测血浆外泌体和csf样本中标志物蛋白含量。统计外泌体标志物在各组样本中的含量分布，分析血浆外泌体检测结果与csf检测结果的一致性。统计分析外泌体标志物在正常人与ad患者样本含量分布，获得cuf-off值，并对ad检测灵敏度、特异性及整体检测符合率进行分析。结果表明：血浆外泌体样本和脑脊液样本aβ42的含量具有较好的相关性，r
2
大于0.99，如图6所示，血浆外泌体样本与脑脊液样本具有较高的一致性，ad患者血浆外泌体样本中的aβ42含量高于正常人。ad检测灵敏度、特异性及整体检测符合率分析结果见表3。神经来源外泌体中aβ42含量可反映脑损伤状态，可作为阿兹海默症疾病诊断和病情进展监控的标志物。
[0066]
表3神经来源外泌体中aβ42含量的检测统计学指标
[0067] cutoff值灵敏度特异性整体符合率auc正常人&ad患者13.7u/ml92.5％91.8％90.2％0.907
[0068]
附序列信息如下：
[0069]
seq id no:1：
[0070]
efqlqqsgpelvkpgasvkisckasgyqftqynmnwvkqsngkslewigvinpnygttsynqkfkgkatltvdqssstaymqlnsltsedsavyycaryyamdywgqgtsvtvss
[0071]
seq id no:2：
[0072]
divmtqtpaslavslgqratisyrasksqstsgqsymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswknglmlhqly
[0073]
seq id no:3：
[0074]
evqleesgpglvqpsqslsitctvsgqsltqygvhwvrqspgeglewlgviwsggstdydavfisrlsiskdnsksqvffrmnslqpndtaiyycarnwgdgpmdywgqgtsvtvssakttppsvy
[0075]
seq id no:4：
[0076]
divltqspaslavslgqratiscrasqsvqtssqsymhwyqqkpgqppkllikyasnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveevdtatyycqhsweipwtfgggtkldikradaaptvs
[0077]
seq id no:5：
[0078]
vprdcgckpcict
[0079]
seq id no:6：
[0080]
ggggsggggsggggsvprdcgckpcictggggsggggsggggs
[0081]
seq id no:7：
[0082]
ggggsggggsggggs
[0083]
seq id no:8：
[0084]
efqlqqsgpelvkpgasvkisckasgyqftqynmnwvkqsngkslewigvinpnygttsynqkfkgkatltvdqssstaymqlnsltsedsavyycaryyamdywgqgtsvtvssggggsggggsggggsdivmtqtpaslavslgqratisyrasksqstsgqsymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswknglmlhqlyggggsggggsggggsefqlqqsgpelvkpgasvkisckasgyqftqynmnwvkqsngkslewigvinpnygttsynqkfkgkatltvdqssstaymqlnsltsedsavyycaryyamdywgqgtsvtvssggggsggggsggggsdivmtqtpaslavslgqratisyrasksqstsgqsymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswknglmlhqlyggggsggggsggggsvprdcgckpcictggggsggggsggggsdivltqspaslavslgqratiscrasqsvqtssqsymhwyqqkpgqppkllikyasnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveevdtatyycqhsweipwtfgggtkldikradaaptvsggggsggggsggggsevqleesgpglvqpsqslsitctvsgqsltqygvhwvrqspgeglewlgviwsggstdydavfisrlsiskdnsksqvffrmnslqpndtaiyycarnwgdgpmdywgqgtsvtvssakttppsvyggggsggggsggggsdivltqspaslavslgqratiscrasqsvqtssqsymhwyqqkpgqppkllikyasnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveevdtatyycqhsweipwtfgggtkldikradaaptvsggggsggggsggggsevqleesgpglvqpsqslsitctvsgqsltqygvhwvrqspgeglewlgviwsggstdydavfisrlsiskdnsksqvffrmnslqpndtaiyycarnwgdgpmdywgqgtsvtvssakttppsvy
[0085]
seq id no:9：
[0086]
gaatttcaactacaacaaagtggtccagaactggtcaagcccggcgcctcagtgaagatctcctgcaag
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[0087]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0088]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。