具有V型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针及应用的制作方法

具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针及应用
技术领域
[0001]
本发明属于新材料领域，更具体地，涉及一种具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针及应用，该探针是种基于聚集诱导发光性质的两亲/水溶性荧光探针，尤其能够在生物成像中靶向定位细胞核进行应用。


背景技术：

[0002]
细胞荧光成像已成为现代细胞生物学必不可少的技术，它能够实现细胞及其组成结构的荧光可视化，逐渐成为疾病诊断和治疗的有效工具。细胞核是细胞内体积最大、最为重要的组成部分，它是细胞代谢、遗传信息库和遗传控制中心，遗传物质脱氧核糖核酸和核糖核酸主要储存在细胞核内。dna损伤与一系列疾病有关，包括神经退行性疾病，免疫缺陷和癌症。
[0003]
常见的用于细胞核成像的染料为亲脂性染料，由于其固有的疏水作用，在生理环境下亲脂性染料会自发的发生聚集，成像过程中会有很强的背景荧光，不利于成像。需要在染色完成后用缓冲溶液洗去多余的染料，以降低背景荧光提高对比度。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针及应用，该类分子具有两亲性，亲脂性使得分子能够透过细胞磷脂膜进入细胞内，亲水性使得分子能够溶于水，由于非辐射跃迁在水溶液中不发出荧光，分子的v型结构使得分子能够卡在dna双螺旋结构的沟槽内，由于分子内运动受限，在受到激发时，能够发出很强的荧光，从而实现对细胞核的免洗标记。本发明中的探针尤其可应用于生物成像，能够单独靶向定位细胞核并进行染色，在不需要二次漂洗的情况下，就可以得到清晰的成像。
[0005]
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针材料，其特征在于，具有如式(一)或式(二)所示的结构通式：
[0006][0007]
其中m为疏水芳环，a为亲水性氮杂环阳离子；
[0008]
该探针材料是具有亲脂性和亲水性的聚集诱导发光荧光探针材料。
[0009]
作为本发明的进一步优选，所述m选自含有取代基或不含有取代基的苯环、萘环、蒽环、噻吩、噻唑、咪唑、吲哚、苯胺、二苯胺、三苯胺、咔唑、芴。
[0010]
作为本发明的进一步优选，所述m选自：
[0011][0012]
其中r1和r2为氢、氟、氯、溴、碘、硝基、氰基、羧基、羟基、酯基、烷基、端胺基烷基或端羟烷基。
[0013]
作为本发明的进一步优选，所述a选自吡啶阳离子、喹啉阳离子、嘧啶阳离子及它们的衍生物亲水性基团。
[0014]
作为本发明的进一步优选，所述a选自：
[0015][0016]
其中，r3为水溶性基团，r4为氢、氟、氯、溴、碘、硝基、氰基、羧基、羟基、酯基、烷基、端胺基烷基或端羟烷基；
[0017]
优选的，r3选自：
[0018][0019]
按照本发明的另一方面，本发明提供了上述具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针材料在制备细胞核染料中的应用。
[0020]
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针材料在制备用于细胞核成像的染料中的应用。
[0021]
作为本发明的进一步优选，所述用于细胞核成像的染料能够靶向定位细胞核。
[0022]
作为本发明的进一步优选，所述用于细胞核成像的染料在染色完成后不需要用缓冲溶液洗去多余的染料，能够直接进行后续成像。
[0023]
作为本发明的进一步优选，所述染料中荧光探针的浓度为0.1μmol/l至2mol/l，优选为5μmol/l至50μmol/l。
[0024]
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于本发明中探针结构的特殊性，使其拥有相对于其它商用细胞核荧光探针具有良好的水溶性，同时兼具亲脂性和
亲水性(即，兼具两亲性)，对细胞的生理环境具有更好的普适性，因此在靶向细胞核染色的荧光成像中相比于脂溶性的化合物具有很多突出的优势；使用本发明的荧光探针对细胞染色，可以靶向细胞核(即，单独靶向定位细胞核并进行染色)，并且没有背景荧光，能够实现免洗成像。并且，由于荧光探针其特殊的分子结构，具有聚集诱导发光的良好性质，也是一种基于聚集诱导发光的两亲性荧光探针。
[0025]
本发明中结构式如式(一)、式(二)所示的荧光探针为v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针荧光探针，具有两亲性，在水溶液中可完全溶解，在水溶液的中荧光可以忽略不记，只有与靶向目标结合后才会发出很强的荧光，可以实现免洗成像(即，本发明的探针材料能够在细胞核成像过程中，没有背景荧光，可以免除其他现有染色在染色完成后需要用缓冲溶液洗去多余的染料的步骤，成像步骤简单快捷；以商用细胞核染料dapi为例，dapi在成像过程中，要用tbst、pbs或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5min)，可以在长期监测和跟踪细胞的动态生物过程具有独特的优势。以本发明中的tpa-2oh和tpa-3oh为例，tpa-2oh和tpa-3oh的脂水分配系数(p)分别为-1.58和-2.15，化合物具有较强的水溶性。本发明中的荧光探针材料具有两亲性，能够与细胞的生理环境更加普适，商用的细胞核染料dapi对人体具有较大的刺激性，且存在荧光猝灭问题，而本发明中的荧光探针材料并不会出现随着探针溶液浓度增大而出现猝灭问题。本发明荧光探针材料在成像中的应用时，荧光探针溶液中荧光探针的浓度可以为0.1μmol/l至2mol/l，适用浓度范围广。
[0026]
具体说来，本发明能够取得以下有益效果：
[0027]
(1)本发明中的v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针，其溶解特性具有两亲性，可以在水性与油性环境中同时溶解，荧光探针的应用范围更加广泛，具有更好的普适性。
[0028]
(2)本发明中的v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针，在细胞的生理环境中也可以溶解，具有更好的生物相容性。
[0029]
(3)本发明中的v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针在缓冲溶液中基本没有荧光，在成像过程中没有背景荧光(背景荧光极低)，探针在聚集态时表现出远红色荧光发射，具有更好的信噪比和穿透度。
[0030]
(4)本发明所述的聚集诱导发光荧光探针用于靶向细胞核成像。操作简单，免于二次漂洗，且成像清晰，用于长期监测与跟踪细胞的生态过程具有独特的优势。
[0031]
综上，本发明荧光探针在细胞核成像过程中，更普适细胞的生理环境，能够靶向定位染色细胞核，且应用于靶向细胞核成像时，操作简单，成像清晰，且没有背景荧光，不需要二次清洗(即，可以实现免洗成像)。
附图说明
[0032]
图1为本发明实施例1化合物tpa-2oh与细胞核染料dapi单独染色和共同染色hela细胞的成像图，其中，图1中的(a)对应dapi单独染色的成像图，图1中的(b)对应tpa-2oh单独染色的成像图，图1中的(c)对应共同染色下的共聚焦成像图。
[0033]
图2为本发明实施例1中荧光探针tpa-2oh的分子结构示意图。
[0034]
图3为本发明实施例2中荧光探针tpa-3oh的分子结构示意图。
[0035]
图4为本发明实施例3中荧光探针分子结构示意图。
[0036]
图5为本发明实施例4中荧光探针分子结构示意图。
[0037]
图6为本发明实施例5中荧光探针分子结构示意图。
[0038]
图7为本发明实施例6中荧光探针分子结构示意图。
[0039]
图8为本发明实施例2化合物tpa-3oh与细胞核染料dapi单独染色和共同染色hela细胞的成像图，其中，图8中的(a)对应dapi单独染色的成像图，图8中的(b)对应tpa-3oh单独染色的成像图，图8中的(c)对应共同染色下的共聚焦成像图。
[0040]
图9为本发明实施例3化合物与细胞核染料dapi单独染色和共同染色hela细胞的成像图，其中，图9中的(a)对应dapi单独染色的成像图，图9中的(b)对应实施例3化合物单独染色的成像图，图9中的(c)对应共同染色下的共聚焦成像图。
[0041]
图10为本发明实施例4化合物与细胞核染料dapi单独染色和共同染色hela细胞的成像图，其中，图10中的(a)对应dapi单独染色的成像图，图10中的(b)对应实施例4化合物单独染色的成像图，图10中的(c)对应共同染色下的共聚焦成像图。
[0042]
图11为本发明实施例5化合物与细胞核染料dapi单独染色和共同染色hela细胞的成像图，其中，图11中的(a)对应dapi单独染色的成像图，图11中的(b)对应实施例5化合物单独染色的成像图，图11中的(c)对应共同染色下的共聚焦成像图。
[0043]
图12为本发明实施例6化合物与细胞核染料dapi单独染色和共同染色hela细胞的成像图，其中，图12中的(a)对应dapi单独染色的成像图，图12中的(b)对应实施例6化合物单独染色的成像图，图12中的(c)对应共同染色下的共聚焦成像图。
[0044]
图13为实施例1化合物tpa-2oh与dna作用的结构示意图。
[0045]
图14为实施例2化合物tpa-3oh与dna作用的结构示意图。
[0046]
图15为化合物tpa-2oh与tpa-3oh的紫外可见吸收光谱；其中，图15中的(a)对应tpa-2oh，曲线自下而上依次对应tpa-2oh浓度为5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm和35μm；图15中的(b)对应tpa-3oh，曲线自下而上依次对应tpa-3oh浓度为5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm和35μm。
[0047]
图16为化合物tpa-2oh与tpa-3oh的与dna含量变化的荧光光谱图；其中，图16中的(a)对应tpa-2oh，曲线自下而上依次对应dna浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml和100μg/ml；图16中的(b)对应tpa-3oh，曲线自下而上依次对应dna浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml和100μg/ml。
具体实施方式
[0048]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0049]
本发明中的荧光探针在应用于靶向细胞核荧光成像时，可以使含有该荧光探针的溶液浸染细胞，该荧光探针能够靶向染色定位细胞核，不需要二次漂洗，可以形成清晰度、对比度、信噪比均较高的细胞核荧光成像。
[0050]
本发明所述荧光探针的溶液为将所述荧光探针溶解于溶剂中获得的溶液，一些实
施例中，所述溶剂为去离子水或有机溶剂。
[0051]
优选实施例中，所述荧光探针的溶液为荧光探针的水溶液。
[0052]
一些实施例中，所述荧光探针溶液中荧光探针的浓度为0.1μmol/l至2mol/l，优选为5μmol/l至50μmol/l。
[0053]
以下为具体实施例：
[0054]
实施例1
[0055]
一种结构如图2所示的荧光探针，其名称缩写为tpa-2oh。通过将tpa-2oh与细胞核染料dapi共同染色hela细胞，其中tpa-2oh浓度为2μm，细胞核染料dapi浓度为5μm，通过共聚焦显微镜进行荧光成像。
[0056]
通过成像图图1所示，tpa-2oh的红色通道和细胞核染料dapi的蓝色通道都可以看到明显的椭圆形斑块，将两个通道成像图进行叠加，红色部分和蓝色部分重叠变为紫色，证明tpa-2oh细胞核染料dapi靶向的是同一个细胞结构，即细胞核。
[0057]
实施例2
[0058]
一种结构为如图3所示的荧光探针，其名称缩写为tpa-3oh，通过将tpa-3oh与细胞核染料dapi共同染色hela细胞，其中tpa-3oh浓度为2μm，细胞核染料dapi浓度为5μm，通过共聚焦显微镜进行荧光成像。
[0059]
通过成像图8所示，tpa-3oh的红色通道和细胞核染料dapi的蓝色通道都可以看到明显的椭圆形斑块，将两个通道成像图进行叠加，红色部分和蓝色部分重叠变为紫色，证明tpa-3oh细胞核染料dapi靶向的是同一个细胞结构，即细胞核。
[0060]
实施例3
[0061]
一种结构为如图4所示的荧光探针，通过将该探针与细胞核染料dapi共同染色hela细胞，其中探针分子浓度为2μm，细胞核染料dapi浓度为5μm，通过共聚焦显微镜进行荧光成像。
[0062]
通过成像图9所示，该探针的红色通道和细胞核染料dapi的蓝色通道都可以看到明显的椭圆形斑块，将两个通道成像图进行叠加，红色部分和蓝色部分重叠变为紫色，证明该探针分子与细胞核染料dapi靶向的是同一个细胞结构，即细胞核。
[0063]
实施例4
[0064]
一种结构为如图5所示的荧光探针，通过将该探针与细胞核染料dapi共同染色hela细胞，其中探针分子浓度为2μm，细胞核染料dapi浓度为5μm，通过共聚焦显微镜进行荧光成像。
[0065]
通过成像图10所示，该探针的红色通道和细胞核染料dapi的蓝色通道都可以看到明显的椭圆形斑块，将两个通道成像图进行叠加，红色部分和蓝色部分重叠变为紫色，证明该探针分子与细胞核染料dapi靶向的是同一个细胞结构，即细胞核。
[0066]
实施例5
[0067]
一种结构为如图6所示的荧光探针，通过将该探针与细胞核染料dapi共同染色hela细胞，其中探针分子浓度为2μm，细胞核染料dapi浓度为5μm，通过共聚焦显微镜进行荧光成像。
[0068]
通过成像图11所示，该探针的红色通道和细胞核染料dapi的蓝色通道都可以看到明显的椭圆形斑块，将两个通道成像图进行叠加，红色部分和蓝色部分重叠变为紫色，证明
该探针分子与细胞核染料dapi靶向的是同一个细胞结构，即细胞核。
[0069]
实施例6
[0070]
一种结构为如图7所示的荧光探针，通过将该探针与细胞核染料dapi共同染色hela细胞，其中探针分子浓度为2μm，细胞核染料dapi浓度为5μm，通过共聚焦显微镜进行荧光成像。
[0071]
通过成像图12所示，该探针的红色通道和细胞核染料dapi的蓝色通道都可以看到明显的椭圆形斑块，将两个通道成像图进行叠加，红色部分和蓝色部分重叠变为紫色，证明该探针分子与细胞核染料dapi靶向的是同一个细胞结构，即细胞核。
[0072]
结果分析
[0073]
测得tpa-2oh和tpa-3oh的脂水分配系数(p)分别为-1.58和-2.15，如表1所示，具有较强的水溶性。
[0074]
表1化合物tpa-2oh与tpa-3oh的脂水分配系数表
[0075][0076]
由实施例1、2、3、4、5、6可知，结构通式为和的两亲性聚集诱导发光荧光探针材料可以靶向定位细胞核，并在不需要二次漂洗的情况下由共聚焦显微镜得到清晰的、对比度较高的荧光成像。
[0077]
由图1至图12可知，将实施例1、2、3、4中合成的荧光分子探针与细胞核染料dapi对hale细胞进行共同染色后的荧光成像，根据成像图像可知，实施例1、2、3、4、5、6中合成两亲性聚集诱导发光荧光探针材料与细胞核染料dapi共同具有特异性靶向线粒体，并且对其进行定位染色的性能。该分子的溶解性具有两亲性质，在多种环境中都具有同样优良的性质的。同时，由于细胞的生理环境更接近水性环境，两亲/水溶性的荧光探针分子在环境中的溶解性更好，因此没有背景荧光，不需要进行二次漂洗。
[0078]
实施例1、2、3、4、5、6中合成的三种两亲性聚集诱导发光荧光探针材料相比市面上的商用细胞核染料dapi具有更加优良的溶解性质，以及清晰度、穿透度、对比度、信噪比更高的成像性能。除此之外，有希望用于原位观察细胞成像过程，并能够长时间追踪细胞状态。
[0079]
本发明中具有v型结构的红色荧光的水溶性细胞核靶向探针，其制备可依据这些探针具体的化学结构式，参照现有技术已知的反应类型综合设计得到，在此不再赘述。
[0080]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。