一种微生物发酵制备蜂蛹抗氧化多肽的方法与流程

本发明涉及功能性食品技术领域，尤其涉及一种微生物发酵制备蜂蛹抗氧化多肽的方法。

背景技术：

雄蜂蛹是蜜蜂雄性幼虫封盖后到羽化出房前这一变态时期的营养体，在实际应用中作为蜂王浆生产的一种农副产品。雄蜂蛹蛋白质含量丰富，含有多种微量元素和维生素，有资料显示雄蜂蛹干物质中粗蛋白含量约41%~60%，可以作为一种优质的蛋白质食品。

蛋白质作为人体六大营养素之一，主要通过消化系统中的蛋白酶水解为小分子肽为人体吸收。因此，多肽相比于蛋白质具有更高的生物利用率，能更好的发挥出其健康效应。目前，国内外主要采用酶解法的方式对蜂蛹蛋白进行更深一步的开发利用。例如中国发明专利cn201711370239.8公开了一种酶解制备雄蜂蛹小分子抗氧化肽的方法，利用内切酶（碱性蛋白酶或中性蛋白酶）和外切酶（风味蛋白酶）复合酶解的方式获取粗肽，再进行粗滤和超滤获得分子量<1ku的小分子多肽。但是酶解法制备蜂蛹多肽往往成本很高，而微生物发酵法更加经济节约，此外，微生物来源广泛且繁殖较快，可产生多种酶系，一定程度上可避免肽制品苦味的产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种采用微生物发酵制备蜂蛹多肽的方法，采用本发明可获得分子量低于3ku的抗氧化蜂蛹多肽。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

1）将枯草芽孢杆菌菌液划线于lb琼脂培养基，一定温度下培养24h，挑取生长状况良好，形态大小正常的单菌落接种到液态培养基中，一定温度下摇瓶培养14h，获得枯草芽孢杆菌的种子液。所述培养温度为35℃~38℃，所述摇瓶转速140r/min~180r/min；

2）将雄蜂蛹粉与正己烷混合，采用索氏提取法进行脱脂；

3）将步骤2）中脱脂蜂蛹粉与水匀浆，调节其ph值为7~8，对其进行高压蒸汽灭菌；

4）将步骤1）中种子液接种于步骤3）的蜂蛹匀浆，在35℃~38℃条件下摇瓶发酵36h，得到发酵液。所述摇瓶转速140r/min~180r/min；

5）将步骤3）中得到的发酵液灭酶后，进行离心分离，将得到的上清液过滤，收集滤液，所述离心分离的转速为8000~10000rpm，所述灭酶温度为95℃~100℃；

6）将步骤4）中得到的滤液首先进行超滤分离，获得<3ku的超滤多肽液。所述超滤分离的超滤膜截留分子量为10ku、5ku以及3ku；

7）将步骤5）中得到的分子量<3ku蜂蛹多肽液进行超滤脱盐，收集截留液，所述超滤脱盐的滤膜截留分子量为0.15~0.3ku；

8）将所述步骤6)中得到的截留液减压浓缩，真空冷冻干燥获得具有抗氧化蜂蛹多肽。

优选的，所示步骤1）中摇瓶培养种子液的时间为12h-14h；

优选的，所述步骤2）中索氏脱脂的时间为8-10h；

优选的，所述步骤3）脱脂蜂蛹粉的粒度10~80μm；

优选的，所述步骤3）中蜂蛹匀浆装瓶量为（40~60）ml/250ml；

优选的，所述步骤3）脱脂蜂蛹粉与水的匀浆比例为1g：(15~20)ml；

优选的，所述步骤3）中高压蒸汽灭菌温度为110℃~115℃，时间为15min~20min；

优选的，所述步骤4）中蜂蛹匀浆与种子液的接种比例为100ml：（2~3）ml;

优选的，所述步骤4）中发酵时间32h~48h；

优选的，所述步骤5）离心分离的时间为10~12min。

优选的，所述步骤6）超滤分离的条件：滤液流速：0.5~8l/h，膜元件压力：0~0.8mpa;超滤完成后采用纯水清洗，直到流出液为无色；

优选的，所述步骤7）超滤脱盐的条件：滤液流速：0.5~8l/h，膜元件压力：0~1.2mpa；超滤完成后采用纯水清洗，直到流出液为无色。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的抗氧化蜂蛹多肽，所述抗氧化蜂蛹多肽分子量<3ku。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的抗氧化蜂蛹多肽在抗氧化活性相关功能性食品中的应用。

有益效果为：

1、降低酶解法制备蜂蛹抗氧化多肽的成本，提高经济效益；

2、采用枯草芽孢杆菌发酵法制备多肽，可产生具有独特的风味物质，具有更好的食品应用潜力；

3、微生物发酵制备多肽过程中可产生多种酶系，一定程度上可避免肽制品苦味的产生；

4、提高蜂蛹蛋白的利用度，增强蜂蛹蛋白的健康效益。

本发明提供的微生物发酵制备蜂蛹多肽的制备方法，包括以下步骤:

1）将枯草芽孢杆菌菌液划线于lb琼脂培养基，一定温度下培养24h，挑取生长状况良好，形态大小正常的单菌落接种到液态培养基中，一定温度下摇瓶培养14h，获得枯草芽孢杆菌的种子液。所述培养温度为35℃~38℃，所述摇瓶转速140r/min~180r/min；2）将雄蜂蛹粉与正己烷混合，采用索氏提取法进行脱脂；3）将所述步骤2）中脱脂蜂蛹粉与水匀浆，调节其ph值，对其进行高压蒸汽灭菌；4）将所述步骤1）中种子液接种于步骤3）的蜂蛹匀浆，在35℃~38℃条件下摇瓶发酵36h，得到发酵液；所述摇瓶转速140r/min~180r/min；5）将所述步骤3）中得到的发酵液灭酶后，进行离心分离，将得到的上清液过滤，收集滤液，所述离心分离的转速为8000~10000rpm，所述灭酶温度为95℃~100℃；6）将所述步骤4）中得到的滤液首先进行超滤分离，获得<3ku的超滤多肽液。所述超滤分离的超滤膜截留分子量为10ku、5ku以及3ku；7）将所述步骤5）中得到的分子量<3ku蜂蛹多肽液进行超滤脱盐，收集截留液，所述超滤脱盐的滤膜截留分子量为0.15~0.3ku；8）将所述所述步骤6)中得到的截留液减压浓缩，真空冷冻干燥获得具有抗氧化蜂蛹多肽。

附图说明

图1为超滤组分中不同分子量多肽的含量；

图2为超滤组分中不同分子量多肽的dpph·清除活性；

图3为超滤组分中不同分子量多肽的abts+清除活性；

图4为超滤组分中不同分子量多肽的还原力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的一种微生物发酵制备蜂蛹抗氧化多肽方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实例1

从枯草芽孢杆菌甘油冻存管中用接种环蘸取一环菌液，在lb琼脂培养平板上划线分离，在37℃条件下培养24h，挑取平板中长势良好的单菌落继续于lb琼脂平板划线分离，37℃培养24h后挑取生长状况良好，形态大小正常的单菌落接种到装瓶量60ml/250mllb液态培养基中，37℃180r/min摇瓶培养14h，获得60ml枯草芽孢杆菌；

将22~23日龄的雄蜂蛹冻干，磨成粉末状，过100目筛，食品级正己烷与蜂蛹冻干粉混合后进行索氏提取法的脱脂，脱脂时间为8h；

加入脱脂蜂蛹冻干粉20倍体积的水匀浆，用0.02m盐酸以及氢氧化钠调节ph为7.5，再115℃高压蒸汽灭菌15min，灭菌后的蜂蛹匀浆出现部分沉淀；

每250ml的发酵瓶中装入40ml已灭菌的蜂蛹匀浆，再在发酵瓶中接入1.2ml的枯草芽孢杆菌的种子液，放入温度设置37℃、转速为180r/min的发酵培养箱培养36h；

发酵终点结束后将发酵液在100℃水浴条件下灭酶10min，然后10000rpm条件下离心15min，弃去上层油脂获取上清液，上清液过6μm的滤布，将滤液依次采用截留分子量分别为10ku、5ku、3ku的超滤膜进行分离，从而获得<3ku的多肽组分，滤液流速为0.5~8l/h，膜元件压力：0~0.8mpa；每一次不同截留分子量超滤膜分离时，加入去离子水洗涤，直到滤出液无色；

将得到的<3ku分子量多肽组分采用0.15ku的纳滤膜进行浓缩脱盐，用去离子水进行数次洗涤，直到滤出液无色，滤液流速0.5~0.8l/h,膜元件压力0~1.2mpa。

将得到的蜂蛹多肽真空浓缩后冷冻干燥，得到<3ku抗氧化活性的蜂蛹多肽，得率为30.59%.

将蜂蛹多肽冻干粉配制成0.8mg/ml的蜂蛹多肽溶液，其dpph的清除能力为68.51±1.48%，其还原力od700=0.37，配置成0.5mg/ml的蜂蛹多肽溶液，其abts清除能力62.30±2.24%。本发明提供的抗氧化雄蜂蛹多肽的分子量为0.15~3ku。

在本发明中，所述雄蜂蛹为22日龄~23日龄雄蜂蛹，进行真空冷冻干燥后磨成粉末获得雄蜂蛹冻干粉。

在本发明中，所述雄蜂蛹冻干粉的粒度优选为10~80μm目，更优选15~30μm目，最优选为25μm目。本发明对所述雄蜂蛹的来源没有特定限定要求，采用本领域市售雄蜂蛹即可。

在本发明中，所述摇瓶培养枯草芽孢杆菌种子液的时间为12h-14h，更优选的时间为13h-14h。

在本发明中，所述雄蜂蛹粉的索氏脱脂时间优选为8-10h，更优选为8.5-10h，最优选为9-10h。

在本发明中，所述脱脂蜂蛹粉的质量与水的体积比例优选为1g：(15~20)ml，更优选为1g：（16~19）ml，最优选为1g：（17~18）ml。

本发明对所述匀浆的条件没有特殊限定,采用本领域技术人员常规使用的匀浆雄蜂蛹的条件即可。

在本发明中，所述蜂蛹匀浆装瓶量优选为（40~60）ml/250ml，更优选为（45~55）ml/250ml，最优选为50ml/250ml。

在本发明中,所述对蜂蛹匀浆高压蒸汽灭菌时间优选为15min~20min，更优选为16min~19min，最优选为18min。

在本发明中，所述蜂蛹匀浆与种子液的接种比例优选为100ml：（2~3）ml，更优选为100ml：（2.2~2.8）ml,最优选为100ml:(2.4~2.6)ml。

在本发明中，所述发酵时间为32~48h，更优选为36h~40h。

在本发明中，所述离心分离的转速优选为8000~10000rpm，优选为8200~9800rpm，最优选为8400~9600rpm；所述离心分离的时间优选为10~12min，更优选为11~12min。本发明中，所述离心分离除去的主要有菌体以及一些不溶杂质，上清液主要有不同分子量多肽、盐类等。

在本发明中，所述过滤使用滤布过滤或者进行减压抽滤。所述滤布孔径优选为3~8μm，更优选为4~7μm；最优选为5μm；减压抽滤真空度优选为0.04mpa~0.06mpa，更优选为0.05mpa。在本发明中，过滤除去残留的少量固态杂质。

在本发明中，所述超滤分离的超滤膜截留分子量为10ku、5ku以及3ku；在本发明中，所述超滤分离的条件优选包括：所述滤液流速为0.5~8l/h，所述膜元件压力为0~0.8mpa;所述超滤分离完成后采用纯水清洗，直到流出液为无色。

在本发明中，所述超滤脱盐超滤膜截留分子量为0.15~0.3ku；在本发明中，所述超滤脱盐的条件优选包括：所述滤液流速为0.5~8l/h，所述膜元件压力为0~1.2mpa；所述超滤分离完成后采用纯水清洗，直到流出液为无色。

在本发明中，所述减压浓缩的条件优选包括：所述真空度为0.1mpa~0.15mpa，所述温度为40℃~45℃；所述真空冷冻干燥的条件优选包括：所述预冷时间2h~4h，所述冷凝温度-70℃~-75℃，所述真空度20pa~40pa，所述真空冷冻时长：48h~60h。

本发明提供了上述制备方法制备得到的蜂蛹抗氧化多肽,所述抗氧化多肽蜂蛹分子量为0.15ku~3ku，所述蜂蛹抗氧化多肽具有一定的还原力以及清除dpph、abts自由基的能力。