产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用。

背景技术：

褐藻酸是由古罗糖醛酸(guluronicacid，g)及甘露糖醛酸(mannuronicacid，m)通过β-1,4糖苷键连接形成的线性高分子，是褐藻细胞壁的主要成分，广泛存在于海带、马尾藻、巨藻等褐藻细胞中。通过酶法降解制备的褐藻寡糖具有多种生理活性，如促生长、增强免疫、神经保护、抗炎、抗病毒等，在食品、药品、农业、保健品、化妆品等领域具有广泛的应用价值。酶解法反应条件温和、效率高、底物专一性强，不会产生对人体和环境有害的副产物，逐渐成为工业降解褐藻胶生产褐藻寡糖的主要手段。

褐藻胶裂解酶是多糖裂解酶的一种，可通过β-消除反应将褐藻胶降解为在非还原端具有双键的不饱和寡糖。根据底物特异性，褐藻胶裂解酶可分为g嵌段特异性裂解酶(polyg)、m嵌段特异性裂解酶(polym)及mg嵌段的双功能褐藻胶裂解酶(polymg)。褐藻胶裂解酶来源广泛，已经从多种海洋动物、海洋和陆地微生物体内分离得到，海洋细菌是褐藻胶裂解酶的重要来源，如假单胞菌、黄杆菌、交替假单胞菌、弧菌、芽胞杆菌等。

目前报道的产酶细菌依然存在着酶活性较低、降解位点单一等缺陷，限制了褐藻胶裂解酶以及酶解法制备褐藻寡糖的发展。因此，筛选高效降解褐藻胶的新型菌种资源，是开发褐藻胶资源，探索高值化利用新途径的必然要求。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了产褐藻胶裂解酶菌株及其应用。该菌株hb182678及其发酵制得的褐藻胶裂解酶能够用于降解褐藻。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了产褐藻胶裂解酶菌株mangrovicoccussp.，其保藏编号为gdmccno.61000。

基于上述研究，本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株mangrovicoccussp.在制备褐藻胶裂解酶中的应用。

本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株mangrovicoccussp.在降解褐藻中的应用。

本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株mangrovicoccussp.发酵制得的褐藻胶裂解酶。

本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。

此外，本发明还提供了制备褐藻胶裂解酶的方法，采用所述产褐藻胶裂解酶菌株mangrovicoccussp.，发酵制得褐藻胶裂解酶。

在本发明的一些具体实施方案中，包括以下步骤：

步骤1、菌株活化：将所述的产褐藻胶裂解酶菌株mangrovicoccussp.接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化的菌株；

步骤2、液体培养：将所述活化的菌株接种于液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～24h，制成种子液；

步骤3、发酵培养：将所述种子液接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶的粗酶液，纯化获得褐藻胶裂解酶。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述固体培养基包括海藻酸钠3～12g/l，蛋白胨2～10g/l，酵母粉0.5～4g/l，氯化钠10～30g/l，琼脂粉18～20g/l，ph6.5～8.0。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述液体种子培养基包括海藻酸钠3～12g/l，蛋白胨2～10g/l，酵母粉0.5～4g/l，氯化钠10～30g/l，ph6.5～8.0；步骤2中所述接种为：将菌体从平板上刮下一环，接种到装有30ml种子培养基的摇瓶中，28～37℃、120～200r/min振荡培养，使od600控制在0.8～1.2之间。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述液体发酵培养基包括海藻酸钠5～12g/l，蛋白胨2～10g/l，酵母粉0.5～4g/l，氯化钠10～30g/l，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/l，七水合硫酸镁0.1～0.4g/l，ph6.5～8.0；所述种子液接种浓度为od600＝0.05。

本发明提供了一种产褐藻胶裂解酶菌株hb182678，该菌株的分类为红树林球菌属(mangrovicoccus)，保藏号为gdmccno.61000，保藏日期为2020年4月17日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。该菌所产的褐藻胶裂解酶具有较广泛的ph稳定性。本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，以及上述菌株hb182678和褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用，具有良好的应用前景。

生物保藏说明

生物材料mangrovicoccussp.hb182678，分类命名：mangrovicoccussp.于2020年4月17日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmccno.61000。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明所述菌株hb182678的电镜照片；

图2示本发明所述菌株hb182678的基于16srdna的系统发育树；

图3示不同ph值对本发明所述菌株hb182678产生的粗酶液酶活力的影响。

具体实施方式

本发明公开了产褐藻胶裂解酶菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的在于提供一种红树林球菌属(mangrovicoccus)菌株hb182678，该菌株能够有效降解褐藻胶，还可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。

本发明的目的还在于提供一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，且工艺成熟。

本发明的第三个目的在于提供上述红树林球菌属(mangrovicoccus)菌株hb182678及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶产生菌株hb182678，该菌株的分类命名为红树林球菌(mangrovicoccussp.hb182678)，保藏号为gdmccno.61000，保藏日期为2020年4月17日，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

本发明所述的红树林球菌hb182678是从海南琼海近海海域采集的褐藻样品中分离筛选得到。经微生物多相分类鉴定，鉴定菌株hb182678属于细菌域、变形菌门、α变形菌纲、红细菌目、红杆菌科、红树林球菌属的新种，暂命名为mangrovicoccussp.hb182678。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶，采用上述的红树林球菌hb182678gdmccno.61000发酵制得。

上述的褐藻胶裂解酶的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)菌株活化：将上述的红树林球菌hb182678接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化菌株；

(2)液体培养：从已纯化的平板中，挑取一环菌体接入液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～15h至对数生长期，制成种子液；

(3)发酵培养：将种子液接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，8000r/min离心10min，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液。

在该褐藻胶裂解酶的制备方法中：

步骤(1)中所述的固体培养基配方为：海藻酸钠3～12g/l，蛋白胨2～10g/l，酵母粉0.5～4g/l，氯化钠10～30g/l，琼脂粉18～20g/l，ph6.5～8.0，以蒸馏水配制。

步骤(2)中所述的液体种子培养基组成为：海藻酸钠3～12g/l，蛋白胨2～10g/l，酵母粉0.5～4g/l，氯化钠10～30g/l，ph6.5～8.0，以蒸馏水配制。

步骤(3)中所述的液体发酵培养基组成为：海藻酸钠5～12g/l，蛋白胨2～10g/l，酵母粉0.5～4g/l，氯化钠10～30g/l，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/l，七水合硫酸镁0.1～0.4g/l，ph6.5～8.0，以蒸馏水配制。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的红树林球菌hb182678以及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。褐藻包括海带、马尾藻等褐藻种类。

本发明提供的产褐藻胶裂解酶菌株及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1产酶菌株hb182678gdmccno.61000的分离筛选

褐藻样品采集于海南省琼海市近海海域。取10g样品，剪碎、溶浆，稀释成10^-3～10^-6的悬液，吸取系列悬液0.1ml，涂布于褐藻胶裂解酶分离培养基，置于30℃培养箱倒置培养2～5d。待菌落长出时，根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取生长好、形态不同的菌落进行划线纯化。

对分离获得的菌株进行褐藻胶裂解酶活力测定，筛选出酶活性较强的菌株hb182678。

具体过程如下：

挑取待检测菌株点接到褐藻胶裂解酶活性检测培养基上，30℃培养2～3d。待平板上长出明显的菌落后，测量菌落直径(d)。在平板中加入1mol/l的cacl2溶液，静置30～60min。待平板上显现出酶解圈后，测量酶解圈直径(d)，以酶解圈直径和菌落直径的比值(d/d)作为初筛指标。

其中菌株hb182678的酶解圈直径达到25mm，d/d值为9，活性明显。

所用培养基配方如下：

褐藻胶裂解酶分离培养基：海藻酸钠5g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸高铁0.01g，nacl20g，琼脂18g，以蒸馏水定容至1l，ph7.6。

褐藻胶裂解酶活性检测培养基：海藻酸钠5g，(nh4)2so45g，k2hpo42g，nacl20g，mgso4·7h2o1g，feso4·7h2o0.01g，琼脂18g，以蒸馏水定容至1l，ph7.6。

实施例2红树林球菌hb182678gdmccno.61000的鉴定

菌株hb182678gdmccno.61000在2216e琼脂培养基上生长良好，培养2d后可见清晰菌落，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑凸起，直径2～4mm。电镜下观察，细胞呈椭球形，长宽约为1.3-2.0μm×1.2-1.5μm，无鞭毛。革兰氏染色呈阴性。

通过pcr扩增、转化、测序获得hb182678的16srdna序列1425bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示。将该序列与ezbiocloud数据库中的序列进行比对，发现菌株hb182678与mangrovicoccusximenensistlg56^t同源性最高(96.3％)。选择同源性高的相关菌株，利用软件mega7.0采用neighbor-joining法构建系统发育树(图2)，可以看出，菌株hb182678与mangrovicoccusximenensistlg56^t处于同一分支上，二者亲缘关系较近。比较二者的基因组平均核苷酸相似性ani值，仅为83.5％，小于国际细菌系统分类学委员会规定的95％的种的界限。

比较两株菌的形态学、生理生化与分子特征，鉴定本发明中的菌株hb182678(gdmccno.61000)为mangrovicoccus(红树林球菌)属的一个新种，暂命名为mangrovicoccussp.hb182678。

该菌株已于2020年4月17日在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为gdmccno.61000。保存地址为广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。

实施例3褐藻胶裂解酶及其制备方法

本发明中的褐藻胶裂解酶是由实施例1中的保藏编号为gdmccno.61000的mangrovicoccussp.hb182678发酵制成的，具体方法包括以下步骤：

(1)菌株活化：将实施例1中的红树林球菌hb182678接种于固体培养基，于30℃培养48h，得活化菌株；

(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于30℃、180r/min振荡培养12～18h，制成种子液；使od600控制在0.8～1.2之间；

(3)发酵培养：将种子液接种于液体发酵培养基中，于30℃、180r/min振荡培养40h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液；所述种子液接种浓度为od600＝0.05。

步骤(1)中的固体培养基组成为：海藻酸钠5g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉1g/l，氯化钠20g/l，琼脂粉18g/l，ph7.0，以蒸馏水配制。

步骤(2)中的液体种子培养基为：海藻酸钠3g/l，蛋白胨8g/l，酵母粉1.5g/l，氯化钠20g/l，ph7.0，以蒸馏水配制。

步骤(3)中的液体发酵培养基为：海藻酸钠7g/l，蛋白胨8g/l，酵母粉1.5g/l，氯化钠20g/l，三水合磷酸氢二钾1g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，ph7.0，以蒸馏水配制。

实施例4褐藻胶裂解酶酶活测定

采用紫外吸收法进行褐藻胶裂解酶酶活力测定。过程如下：

收集发酵液，离心，以实施例3中的发酵上清液作为粗酶液。

取1.8ml底物(3.0g海藻酸钠溶于1l50mmph7.0磷酸盐缓冲液)于40℃预热5min，加入0.2ml待测粗酶液，40℃温浴10min，以灭活的酶液体系为空白对照，测定反应体系在od235下的紫外吸收值。定义在上述酶活测定方法下od235紫外吸收值每分钟增加0.01的酶量为酶的一个活力单位(1u)。

结果显示，菌株hb182678发酵40h时褐藻胶裂解酶酶活力最大，为132.2u/ml。

表1不同发酵时间对菌株hb182678产酶活力的影响

实施例5褐藻胶裂解酶的最适ph及ph稳定性

实验1：配制50mm不同ph值的缓冲液[[na2hpo4-citricacidbuffer(ph3～7)、tris-hclbuffer(ph8～9)、nahco3-naoh(ph10)]。在4℃条件下，将实施例4中收集的粗酶液在不同ph值(3、4、5、6、7、8、9、10)条件下保持24h后，分别测定褐藻胶裂解酶剩余活性，确定该酶稳定性大小。定义最适ph下测得的酶活力为100％。

实验2：测定粗酶液在含海藻酸钠3g/l的50mm的不同缓冲液中的酶活力，确定该酶最佳反应ph值。定义最佳ph下测得的酶活力为100％。

结果显示，粗酶液在ph为5～8条件下4℃保持24h，剩余酶活力均达到85％以上，ph4和ph9时酶活力仍达到70％以上，可见该酶具有较广泛的ph稳定性。

粗酶液在ph8时反应酶活性最高，在ph6～8区间内酶反应活性在80％以上，ph7时剩余酶活力最高。

表2ph值对本发明所述菌株hb182678产生的粗酶液酶活力的影响

实施例6mangrovicoccussp.hb182678对褐藻藻体的降解

将海带(laminariajaponica)、马尾藻(sargassumoligocystum)浸泡4～5h，清洗干净，剪成1cm×1cm的小块，分别加入250ml锥形瓶中，并加入适量无机盐水溶液，其成份是：(nh4)2so45g，k2hpo42g，nacl20g，mgso4·7h2o1g，feso4·7h2o0.01g，蒸馏水1l，ph7.5。得到含有不同种类的褐藻培养液。

接入按实施例3制备的mangrovicoccussp.hb182678种子液，接种浓度为od600＝0.1。180rpm，30℃培养，观察培养基的浑浊度及海藻形状的变化。

观察发现，随着培养时间的延长，12h时海藻逐渐溶解，无色培养液颜色逐渐加深变为褐色，溶液开始变浑浊，海带、马尾藻固体重量分别剩余83.7％、91.6％，；24h时海藻块变小，碎屑增多，溶液浊度加深，变得不透明，海带、马尾藻固体重量分别剩余55.9％、62.3％；48h时海藻完全被降解，溶液变为浊液，海带、马尾藻固体藻块完全消失。这表明菌株hb182678能在短时间内高效降解海带和马尾藻，是褐藻资源化利用的优势菌种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用

<130>mp2019526

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1425

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agagtttgatcatggctcagaacgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc60

gaacccttcggggttagcggcggacgggttagtaacgcgtgggaacgtgcccaaaggtag120

ggaatagcctcgggaaactgagagtaataccctatgtgcccttcgggggaaagatttatc180

gcctttggatcggcccgcgttagattaggtagttggtggggtaatggcctaccaagccta240

tgatctatagctggtttgagaggatgatcagcaacactgggactgagacacggcccagac300

tcctacgggaggcagcagtggggaatcttcggcaatgggcgcaagcctgaccgagccatg360

ccgcgtgagcgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcgccagggatgataatgaca420

gtacctggtaaagaaaccccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggggg480

ttagcgttgttcggaattactgggcgtaaagcgcacgtaggcggaccggaaagttggggg540

tgaaatcccggggctcaaccccggaactgccttcaaaactctcggtctggagttcgagag600

aggtgagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccagtg660

gcgaaggcggctcactggctcgatactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaaca720

ggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgccagtcgtcgggttgcatg780

caattcggtgacacacctaacggattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagatt840

aaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaa900

gcaacgcgcagaaccttaccaacccttgacatcctcggaccgtcccagagatgggtcttc960

cacttcggtggccgagtgacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgt1020

tcggttaagtccggcaacgagcgcaacccacacccttagttgccagcagttcggctgggc1080

actctaggggaactgccgatgataagtcggaggaaggtgtggatgacgtcaagtcctcat1140

ggcccttacgggttgggctacacacgtgctacaatggcagtgacaatgggttaatcccaa1200

aaagctgtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggaatcgctag1260

taatcgcgtaacagcatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtc1320

acaccatgggagttggttctacctgacggccgtgcgctaacccctcgggggggcagcgga1380

ccacggtaggatcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggtaacc1425