Hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法和应用与流程

hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及一种hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法和应用。


背景技术：

2.硫酸乙酰肝素糖蛋白
‑
2(heparan sulfate proteoglycan 2，hspg2)基因定位于人1p36.12，编码perlecan蛋白，具有4391个氨基酸，是一种多功能硫酸乙酰肝素蛋白多糖，可与许多不同的分子相互作用，包括基底膜成分(如laminin31)，细胞表面受体(如整合素)，生长因子(如fgf2，fgf7，pdgf等)。hspg2基因在小鼠4号染色体正链上，全长43.4kb，ncbi id:15530。该基因有3个转录本。
3.系统性红斑狼疮(system lupus erythematosus，sle)是一种好发于育龄期女性，女性、男性发病比，约为9:1，以多系统受累和血清中多种自身抗体阳性为特征的弥散性结缔组织病。狼疮性肾炎(lupus nephritis，ln)是sle最常见和最严重的并发症，约50％sle患者出现临床肾脏损害，近100％合并肾组织损害，5％～22％的ln患者确诊后5～10年发展至esrd，ln也是sle患者主要死亡原因。但sle和ln的病因和发病机制尚未完全阐明。一般认为与遗传因素、性激素、环境因素等相互作用引起机体免疫调节功能紊乱有关。
4.sle小鼠模型的研究对于探索人类sle的病因、发病机制和治疗有重要意义。狼疮性肾炎鼠模型可分自发性和化学物质诱导性模型两类，近40年来国内外研究较充分的自发性小鼠模型主要有bxsb/mpj，nzb/w.f1和mrl/lpr 3种品系，这类模型来源较困难，价格昂贵，不可能大规模应用，并且与人类发病的性别差异等临床特点不相符。自发性小鼠狼疮从本质上说是一种遗传性疾病，而化学物质诱导性模型，尚不能很好的反映人类狼疮性肾炎特点。因此急需建立一个类似于人类狼疮肾炎动物模型，深入研究其发生的机制，为防治狼疮肾炎提供一个新的思路。
5.crispr
‑
cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定dna修饰的技术，crispr
‑
cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶(zfn)技术、talen基因编辑技术之后又一重大突破。该技术通过rna指导cas9核酸酶对靶向基因进行特定dna编辑。crispr
‑
cas9系统的基因编辑效率更高，cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。通过导向rna(sgrna)介导核酸内切酶cas9蛋白进行目标dna序列识别并造成dna双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损dna，从而对目标位点实现基因的定点敲入、以及基因修正等多种修饰。使用crispr/cas9技术进行基因敲入需要两个关键因素，首先是有效的sgrna引导序列，再就是cas9蛋白的存在。
6.因此通过crispr/cas9技术通过体外转录的方式，获得cas9mrna和sgrna构建稳定敲入hspg2基因小鼠模型，为进一步研究hspg2的功能奠定了良好的基础。目前国际上关于hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法目前还未见报道。


技术实现要素：

7.基于现有技术中存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种用于构建hspg2基因敲入小鼠动物模型的特异性靶位点导向rna(sgrna)；本发明的第二目的在于提供一种hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法；本发明的第三目的在于提供所述构建方法构建得到的hspg2基因敲入小鼠动物模型在作为筛查防治狼疮性肾炎药物和/或研究临床狼疮性肾炎发生发展病程的动物模型中的应用。
8.本发明的目的通过以下技术手段得以实现：
9.一方面，本发明提供一种用于构建hspg2基因敲入小鼠动物模型的特异性靶位点导向rna，其包括sgrna6和sgrna12，所述sgrna6和所述sgrna12的核苷酸序列如下：
10.sgrna6：agaatgacggcactgccccaggg(seq id no:6)；
11.sgrna12：tggactgtaactcccaagctggg(seq id no:12)。
12.另一方面，本发明还提供一种hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法，其包括以下步骤：
13.将上述sgrna6、所述sgrna12与cas9核酸酶体外转录成mrna，获得有活性的sgrna和cas9 mrna；
14.构建hspg2基因敲入的打靶载体；
15.将有活性的sgrna、cas9 mrna和打靶载体注射入小鼠受精卵中，培育受精卵并进行传代，构建获得hspg2基因敲入的小鼠动物模型。
16.上述的构建方法中，sgrna6、sgrna12、cas9 mrna、打靶载体的用量根据实际操作常规选择。
17.上述的构建方法中，优选地，构建hspg2基因敲入的打靶载体的步骤包括：
18.根据打靶策略设计引物，构建同源臂片段lr、同源臂片段rr以及引入点突变的序列片段a；
19.将同源臂片段lr、同源臂片段rr和点突变的序列片段a通过克隆组装到tv
‑
4g载体上，构建获得打靶载体；
20.通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建成功。
21.上述的构建方法中，所述打靶策略为：根据人hspg2基因上的点突变对应找到小鼠的同源点突变，将小鼠hspg2基因的第2936位氨基酸gly突变为glu，即：g2936e，相对应的碱基由ggg变为gag，即g8807a。
22.上述的构建方法中，优选地，根据打靶策略设计引物，包括：
23.构建同源臂lr片段的引物序列如下：
24.ege
‑
djh
‑
027
‑
lr
‑
f：
25.tttaagaaggagatatacatgctcgagatgaattggtcaaggatgtgggacc(seq id no:17)；
26.ege
‑
djh
‑
027
‑
lr
‑
r：
27.tgacggcactgccgatatccctctagcaggccagggctaacaggatgaaatgtac(seq id no:18)；
28.构建点突变的序列片段a的引物序列如下：
29.ege
‑
djh
‑
027
‑
a
‑
f：
30.ctgttagccctggcctgctagagggatatcggcagtgccgtcattctgcgtttta(seq id no:
19)；
31.ege
‑
djh
‑
027
‑
a
‑
r(in)：
32.cacttcagatctacagtctgctcttcagtcaaatgggaggaggag(seq id no:20)；
33.ege
‑
djh
‑
027
‑
a
‑
f(in)：
34.cctcccatttgactgaagagcagactgtagatctgaagtgcgtgg(seq id no:21)；
35.ege
‑
djh
‑
027
‑
a
‑
r：
36.tgtaactcccaaagatctggatccgtcgacgctgggacctgaaataagtcctccc(seq id no:22)；
37.构建同源臂rr片段的引物序列如下：
38.ege
‑
djh
‑
027
‑
rr
‑
f：
39.tcaggtcccagcgtcgacggatccagatctttgggagttacagtccatcaaagca(seq id no:23)；
40.ege
‑
djh
‑
027
‑
rr
‑
r：
41.ttgttagcagccggatctcaggcggccgccagcctccaaggtcagctcagattc(seq id no:24)。
42.上述的构建方法中，优选地，所述小鼠受精卵是通过小鼠促排卵并经过体外受精培育获得的。
43.上述的构建方法中，优选地，培育受精卵并进行传代的步骤包括：
44.取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为f0代小鼠；
45.提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物进行测序鉴定，获得阳性f0代小鼠或疑似阳性f0代小鼠；
46.将阳性f0代小鼠或疑似阳性f0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得f1代小鼠；
47.提取f1代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物进行测序鉴定，获得稳定基因型的阳性f1代小鼠；
48.将稳定基因型的阳性f1代小鼠杂交获得f2代小鼠；
49.提取f2代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物进行测序鉴定，获得f2代纯合子基因型的小鼠，即为hspg2基因敲入小鼠动物模型。
50.上述的构建方法中，优选地，提取f0代小鼠或f1代小鼠尾部dna进行pcr扩增的引物序列包括：
51.ege
‑
djh
‑
027
‑
l
‑
gt
‑
f：cagggggctggagcactgattg(seq id no:25)；
52.ege
‑
djh
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027
‑
l
‑
gt
‑
r：tcccaaagatctggatccgtcgacg(seq id no:26)；
53.ege
‑
djh
‑
027
‑
r
‑
gt
‑
f：gccctggcctgctagagggatatcg(seq id no:27)；
54.ege
‑
djh
‑
027
‑
r
‑
gt
‑
r3：aggtgtgggggtgataggaaaaggt(seq id no:28)。
55.上述的构建方法中，优选地，提取f2代小鼠尾部dna进行pcr扩增的引物序列包括：
56.ege
‑
djh
‑
027
‑
gt
‑
f：ggagatttccttggctgatgtggct(seq id no:29)；
57.ege
‑
djh
‑
027
‑
gt
‑
r：agatacctggttcccacgatcccat(seq id no:30)。
58.再一方面，本发明还提供上述构建方法构建得到的hspg2基因敲入小鼠动物模型在作为筛查防治狼疮性肾炎药物和/或研究临床狼疮性肾炎发生发展病程的动物模型中的应用。
59.本发明方法构建获得的hspg2基因敲入小鼠动物模型能够在16～24周内模拟人类
狼疮性肾炎，其在20周出现自身抗体水平升高，肾小球有自身抗体免疫复合物沉积，并出现肾脏病理性改变，有蛋白尿出现。与人类狼疮肾炎相符合，能模拟临床狼疮性肾炎发生发展病程，可以单独研究该基因缺陷在狼疮性肾炎发病机制中的作用，为防治狼疮性肾炎提供一个新的思路。
附图说明
60.图1为hspg2基因敲入设计策略示意图。
61.图2a为体外转录cas9、sgrna1～sgrna6的电泳结果图。
62.图2b为体外转录cas9、sgrna7～sgrna12的电泳结果图。
63.图3为sgrna的rna制备的电泳结果图。
64.图4为构建的打靶载体的电泳结果图。
65.图5为打靶载体的电泳图。
66.图6为f0代小鼠基因型鉴定引物设计原则图。
67.图7a为引物为ege
‑
djh
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027
‑
l
‑
gt
‑
f/ege
‑
djh
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027
‑
l
‑
gt
‑
r的鉴定电泳图。
68.图7b为引物为ege
‑
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027
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r
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‑
f/ege
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r
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‑
r3的鉴定电泳图。
69.图8a为引物为ege
‑
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‑
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‑
f/ege
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‑
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l
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gt
‑
r的鉴定电泳图。
70.图8b为引物为ege
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027
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r
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gt
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f/ege
‑
djh
‑
027
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r
‑
gt
‑
r3的鉴定电泳图。
71.图9为f2代小鼠纯合子基因型鉴定引物设计原则图。
72.图10a为引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
gt
‑
f的鉴定电泳图。
73.图10b为引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
gt
‑
r的鉴定电泳图。
74.图11为hspg2基因敲入小鼠动物模型3月龄小鼠的肾脏pas染色图。
75.图12为hspg2基因敲入小鼠动物模型4月龄小鼠的肾脏igg1荧光染色图。
具体实施方式
76.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。文中未注明的产品信息均为本领域常规市售获得，文中未注明具体条件的实验方法通常为本领域常规方法和条件。除非另行定义，文中所使用的所以专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
77.实施例1：
78.本实施提供一种基于crispr/cas9基因敲除技术建立hspg2基因敲入小鼠模型的方法，具体步骤如下：
79.1、敲入的hspg2基因的基本信息如下：
80.(1)敲入基因名称(gene id号)：hspg2(15530)
81.(2)敲入基因名称(ensembl)：hspg2(ensmusg00000028763)
82.(3)敲入针对的转录本(ensembl号)：hspg2
‑
203(ensmust00000171332.1)
83.(4)敲入针对的exon：exon 67(ensmuse00001044242)
84.野生型鼠hspg2基因核苷酸序列如seq id no:31所示。其中，该序列第60～62位为起始密码子，第13209～13211位为终止密码子。
85.野生型hspg2基因氨基酸序列如seq id no:32所示。
86.2、cas9/sgrna的设计与构建：
87.hspg2基因敲入设计策略示意图，如图1所示。
88.(1)打靶策略具体为：根据人hspg2基因上的点突变对应找到小鼠的同源点突变，将小鼠hspg2基因的第2936位氨基酸gly突变为glu，相对应的碱基由ggg变为gag。
89.c.g8807a，p.g2936e突变的鼠hspg2基因核苷酸序列如seq id no:33所示。其中，该序列第60～62位为起始密码子，第13209～13211位为终止密码子，seq id no:31序列中编码氨基酸的第8807位(即序列顺序中的第8866位)的g突变为a，即为该seq id no:33序列。
90.c.g8807a，p.g2936e突变的鼠hspg2基因氨基酸序列如seq id no:34所示。其中，seq id no:32氨基酸序列中的第2936位的g突变为e，即为该seq id no:34序列。
91.sgrna设计在exon65上游和exon69下游的非保守序列中，5'端和3'端的同源臂分别为约为1.3kb和1.5kb。具体在5'靶位点和3'靶位点区域分别设计了8条sgrna，如下表1和表2所示。
92.表1：
93.5'靶位点区域序列(5'
→
3')sgrna1gggtagttatcgctggggcgagg(seq id no:1)sgrna2tggctcagggtagttatcgctgg(seq id no:2)sgrna3attggagtttccatcccggctgg(seq id no:3)sgrna4gctcagggtagttatcgctgggg(seq id no:4)sgrna5tgaaatgtactacacgtgattgg(seq id no:5)sgrna6agaatgacggcactgccccaggg(seq id no:6)sgrna7gtggcacctcagatctgttgtgg(seq id no:7)sgrna8ctgtgggatagcaacaactgtgg(seq id no:8)
94.表2：
95.3'靶位点区域序列(5'
→
3')sgrna9catatcaacactataacggaagg(seq id no:9)sgrna10caacactataacggaaggcaagg(seq id no:10)sgrna11atggactgtaactcccaagctgg(seq id no:11)sgrna12tggactgtaactcccaagctggg(seq id no:12)sgrna13acttatttcaggtcccagcttgg(seq id no:13)sgrna14tgatatgatcaaatacccagagg(seq id no:14)sgrna15cttatttcaggtcccagcttggg(seq id no:15)sgrna16aggagagcaactgggggttctgg(seq id no:16)
96.(2)按照上述表1和表2中设计的sgrna序列合成oligos，通过gibson的方式连入pcs
‑
3g载体，连接产物转化后送样测序验证其正确性。
97.对表1和表2设计的sgrna进行活性检测，电泳结果如图2a和图2b所示。综合sgrna的特异性、活性和基因组所在的位置最终选取sgrna6和sgrna12作为构建hspg2基因敲入小鼠动物模型的导向rna。
98.(3)将sgrna6、sgrna12和cas9质粒通过megashortscript t7 kit(life technologies)体外转录试剂盒进行体外转录，得到进行显微注射的cas9 mrna、有活性的sgrna6和sgrna12，并通过megaclear kit试剂盒进行纯化回收，rna电泳图如图3所示。
99.3、打靶载体的构建
100.(1)设计引物构建打靶载体：
101.根据图1的hspg2基因敲入设计策略示意图，设计构建同源臂lr片段的引物、构建点突变序列片段a的引物和构建同源臂rr片段的引物，引物设计如下表3所示：
102.表3：
[0103][0104][0105]
(2)基于表3中设计的引物，按照本领域常规方法，构建同源臂片段lr、同源臂片段rr以及引入点突变的序列片段a；电泳图如图4所示。
[0106]
(3)将同源臂片段la、同源臂片段rr和点突变的序列片段a通过本领域常规方法克隆组装到tv
‑
4g载体(市售获得)上，构建获得打靶载体；按照本领域常规方法进行酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。打靶载体的电泳图如图5所示。
[0107]
4、hspg2基因敲入的小鼠动物模型构建过程：
[0108]
(1)将上述体外转录的有活性的sgrna6、sgrna12、cas9 mrna和构建的打靶载体按照本领域常规注入剂量显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠
体内，产出小鼠，即为f0代小鼠。
[0109]
(2)提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物进行测序鉴定，获得阳性f0代小鼠或疑似阳性f0小鼠；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的f0小鼠为嵌合体。故以f0小鼠鼠尾dna进行鉴定得到的f0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待f1小鼠基因型鉴定后确定。
[0110]
f0代小鼠基因型鉴定具体过程如下：
[0111]
①
鉴定引物设计：
[0112]
引物设计原则如图6所示。
[0113]
②
引物信息如下表4所示：
[0114]
表4：
[0115][0116]
③
pcr条件：
[0117]
pcr聚合酶：kod
‑
fx。
[0118]
pcr扩增条件如下表5所示。
[0119]
表5：
[0120]
[0121]
④
f0代小鼠鼠尾基因型鉴定，鉴定结果如下：
[0122]
引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
l
‑
gt
‑
f/ege
‑
djh
‑
027
‑
l
‑
gt
‑
r的鉴定电泳图如图7a所述；引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
r
‑
gt
‑
f/ege
‑
djh
‑
027
‑
r
‑
gt
‑
r3的鉴定电泳图如图7b所述。
[0123]
由图7a和图7b可以看出：通过pcr产物和测序表明，e5h27
‑
048、e5h27
‑
052、e5h27
‑
053和e5h27
‑
061为点突变(mki)的阳性f0代小鼠；e5h27
‑
056和e5h27
‑
062为点突变(mki)的疑似阳性f0代小鼠。
[0124]
(3)将上述阳性f0代阳性小鼠或疑似阳性f0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得f1代小鼠；提取f1代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物进行测序鉴定，获得具有稳定基因型的阳性f1代小鼠。
[0125]
f1代小鼠基因型鉴定具体过程如下：
[0126]
鉴定引物设计及pcr条件同f0代小鼠基因型鉴定过程。鉴定结果如下：
[0127]
引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
l
‑
gt
‑
f/ege
‑
djh
‑
027
‑
l
‑
gt
‑
r的鉴定电泳图如图8a所述；引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
r
‑
gt
‑
f/ege
‑
djh
‑
027
‑
r
‑
gt
‑
r3的鉴定电泳图如图8b所述。
[0128]
由图8a和图8b可以看出：通过pcr鉴定以及点突变位点测序结果表明1e5h27
‑
028，1e5h27
‑
029，1e5h27
‑
030，1e5h27
‑
031，1e5h27
‑
032，1e5h27
‑
033，1e5h27
‑
034和1e5h27
‑
035为点突变(mki)的阳性f1代小鼠。
[0129]
(4)将阳性f1代小鼠杂交获得f2代小鼠，对f2代小鼠进行纯合子基因型的鉴定，获得f2代纯合子基因型的小鼠，即为hspg2基因敲入小鼠动物模型。
[0130]
纯合子基因型鉴定具体过程如下：
[0131]
①
鉴定引物设计：
[0132]
引物设计原则如图9所示。
[0133]
②
引物信息如下表6所示：
[0134]
表6：
[0135][0136]
③
pcr条件：
[0137]
pcr聚合酶：2x taq plus master mix ii(dye plus)。
[0138]
pcr扩增条件如下表7所示。
[0139]
表7：
[0140][0141]
④
f2代纯合子小鼠基因型鉴定结果鉴定结果如下：
[0142]
引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
gt
‑
f的鉴定电泳图如图10a所述；引物为ege
‑
djh
‑
027
‑
gt
‑
r的鉴定电泳图如图10b所述。
[0143]
由图10a和图10b可以看出：通过pcr鉴定以及点突变位点测序结果表明l1l3、l1l6、l2l4、l3l9、l4l6、l4l7、l5l9和2rf2为点突变(mki)的f2代纯合子小鼠。
[0144]
实施例2：
[0145]
取实施例1构建获得的hspg2基因敲入小鼠动物模型3月龄的小鼠对其肾脏进行pas染色和4月龄小鼠对其进行igg1荧光染色，实验结果如图11和图12所示。图11为hspg2基因敲入小鼠肾脏pas染色(periodic acid
‑
schiff stain)
×
400图；图12为hspg2转基因小鼠肾小球中沉积的igg1的免疫荧光图。
[0146]
由图11和图12可以看出：本发明方法构建获得的hspg2基因敲入小鼠动物模型能够在16～24周内模拟人类狼疮性肾炎，其在20周出现自身抗体水平升高，肾小球有自身抗体免疫复合物沉积，并出现肾脏病理性改变，有蛋白尿出现。与人类狼疮肾炎相符合，能模拟临床狼疮性肾炎发生发展病程，可以单独研究该基因缺陷在狼疮性肾炎发病机制中的作用，为防治狼疮性肾炎提供一个新的思路。