[0001]
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法。
背景技术：
[0002]
γ-聚谷氨酸(γ-pga)主要由芽孢杆菌属(bacillus)分泌出的胞外多肽，是这些微生物的荚膜的主要成分，其由谷氨酸单体通过γ-谷氨酰胺键聚合而成。γ-pga是无毒无害且对环境无污染的绿色生物产品，其具有高水溶性、吸水能力强、可降解、很好的生物相容性、成膜性强、粘度高和成纤维性等独特的物理化学性能和生物学特性，使其可在医药、食品、环境、日化、农业等行业都具有广阔的应用前景。
[0003]
目前，依然不少研究者筛选高产的γ-pga的菌株，来降低γ-pga的生产成本。但是，目前依然采用的是将样品稀释涂布在分离培养基中，然后将在分离培养基上单菌落接入液体发酵培养基中，进行摇瓶发酵；发酵完，测发酵液中γ-pga的产量；该方法工作量大，摇瓶发酵需要大量的空间进行，不能同时对大量的分离培养基上的单菌进行筛选。因此需要开发能批量筛选高产γ-pga的菌株的方法。
技术实现要素：
[0004]
本发明针对现有技术方法不能同时对大量的高产γ-pga的菌株进行筛选的不足，提供一种快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法，通过半固体发酵培养基在孔板中进行批量筛选，该方法简单易行，成本低廉。
[0005]
本发明的快速筛选高产聚谷氨酸菌株的方法，包括以下步骤：
[0006]
a.将待筛选样品梯度稀释后涂布于分离培养基上培养；
[0007]
b.根据待筛选样品中菌种/菌群类型，配制相应的半固体发酵培养基，灭菌后将融化的培养基分装入无菌的培养孔板中，将分离培养基上单菌落转接到孔中的凝结后的半固体发酵培养基上，盖好孔板盖，将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中培养；观察孔板盖是否有液体状产物，如有，则接入该孔的菌株为高产聚谷氨酸菌株。
[0008]
优选，所述的半固体发酵培养基中含有琼脂的量为质量分数0.2％-0.8％；所述的培养基分装，其分装量控制为培养基液面离盖好后的孔板盖的距离为2-15mm。
[0009]
优选，所述的培养孔板为96孔、48孔、24孔或12孔培养板。
[0010]
优选，所述的分离培养基为营养琼脂培养基。
[0011]
优选，待筛选样品中菌种/菌群为地衣芽孢杆菌，其半固体发酵培养基为：含有柠檬酸12g/l、甘油80g/l、l-谷氨酸20g/l、氯化铵7g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、七水硫酸镁0.5g/l、二水氯化钙0.15g/l、一水硫酸锰0.104g/l、六水氯化铁0.01g/l和琼脂2g/l，余量为水，ph6.5。
[0012]
优选，待筛选样品为纳豆，其半固体发酵培养基为：含有大豆粉40g/l和琼脂8g/l，余量为水，ph6.5。
[0013]
优选，待筛选样品中菌种/菌群为枯草芽孢菌，其半固体发酵培养基为：含有葡萄
糖60g/l、蛋白胨20g/l、磷酸氢二钾1.5g/l、七水硫酸镁0.05g/l、二水氯化钙0.1g/l、一水硫酸锰0.104g/l、六水氯化铁0.01g/l和琼脂5g/l，余量为水，ph6.5。
[0014]
优选，待筛选样品为盐碱地土样，其半固体发酵培养基为：含有葡萄糖100g/l、蛋白胨50g/l、谷氨酸钠100g/l、磷酸氢二钾2g/l、七水硫酸镁0.05g/l和琼脂3g/l，余量为水，ph6.5。
[0015]
优选，所述的步骤a的涂布于分离培养基上培养，是在37℃培养24h。
[0016]
优选，所述的步骤b的将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中培养，是在37℃培养24-96h。
[0017]
有益效果：
[0018]
本发明方法提供了快速筛选出高产γ-pga的菌株的方法，该方法简单快速，可以同时筛选过千株单菌。而传统的方法，需要将每个单菌接入液体发酵培养，然后振荡培养数天，最后，测每个摇瓶的γ-pga的产量。与传统方法比较，本发明的方法简单，简化传统筛选的过程，直接由肉眼观察出高产的菌株，减轻筛选的工作量。
具体实施方式
[0019]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0020]
实施例1：
[0021]
经过太空诱变的地衣芽孢杆菌atcc9945a的冻干粉末，溶于无菌的生理盐水中，梯度稀释取100μl涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。
[0022]
将半固体发酵培养基融化，取100μl融化的培养基加入96孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为5mm。
[0023]
所述的半固体发酵培养基的成分：含有柠檬酸12g/l、甘油80g/l、l-谷氨酸20g/l、氯化铵7g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、七水硫酸镁0.5g/l、二水氯化钙0.15g/l、一水硫酸锰0.104g/l、六水氯化铁0.01g/l和琼脂2g/l，余量为水，调ph为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用。
[0024]
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的96孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养96h。γ-pga是分泌到细胞外的产物，并且γ-pga具有较大的粘性。当孔板倒置培养时，如果γ-pga产量大积累较多时，自身重力大于其粘力时，重力作用产物就会滴落到孔板盖上；如果γ-pga产量少，自身重力小于其粘力时，产物只能粘在孔板中。因此，肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
[0025]
共挑取了768个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出24株高产量γ-pga的生产菌。诱变前，出发菌的γ-pga产量为30.73g/l。对筛选出的24株菌进行摇瓶发酵，γ-pga的平均产量为55.52g/l。
[0026]
实施例2：
[0027]
将市场上纳豆样品加入无菌的生理盐水，梯度稀释取100微升涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。
[0028]
将半固体发酵培养基融化，取1ml融化的培养基加入12孔培养板中，融化的培养基
液面离孔板盖的距离为10mm。
[0029]
所述的半固体发酵培养基的成分：粉碎的大豆粉40g/l，琼脂8g/l，余量为水，调ph为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用。
[0030]
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的12孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养24h。然后肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
[0031]
共挑取了768个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出的26株高产量γ-pga的生产菌。对筛选出的26株菌进行固体发酵，γ-pga的平均产量为36.31g/l。
[0032]
实施例3：
[0033]
将微重力诱变的枯草芽孢菌(bacillus subtilis)pga-7冻干粉，加入无菌的生理盐水，,梯度稀释取100μl涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。枯草芽孢菌(bacillus subtilis)pga-7保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其保藏编号为：cctcc no：m206102，该菌公开于专利号：zl 200610122640.5，发明名称为：γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法的专利中。
[0034]
将半固体发酵培养基融化，取0.5ml融化的培养基加入24孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为15mm。
[0035]
所述的发酵培养基的成分：含有葡萄糖60g/l、蛋白胨20g/l、磷酸氢二钾1.5g/l、七水硫酸镁0.05g/l、二水氯化钙0.1g/l、一水硫酸锰0.104g/l、六水氯化铁0.01g/l和琼脂5g/l，余量为水，调ph为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用。
[0036]
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的24孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养48h。然后肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
[0037]
共挑取了768个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出15株高产量γ-pga的生产菌。诱变前，出发菌的γ-pga产量为2.8g/l。对筛选出的24株菌进行摇瓶发酵，γ-pga的平均产量为4.08g/l。
[0038]
实施例4：
[0039]
盐碱地土样溶于无菌的生理盐水中，梯度稀释取100μl涂布于营养琼脂的平板上，37℃培养24h。
[0040]
将半固体发酵培养基融化，取300μl融化的培养基加入48孔培养板中，融化的培养基液面离孔板盖的距离为2mm。
[0041]
所述的半固体发酵培养基的成分：含有葡萄糖100g/l、蛋白胨50g/l、谷氨酸钠100g/l、磷酸氢二钾2g/l、七水硫酸镁0.05g/l和琼脂3g/l，余量为水，调ph为6.5；配制方法是将上述成分混合均匀后，调ph值，灭菌备用。
[0042]
待孔板中培养基凝结后，将营养琼脂的平板上单菌落用牙签挑进装有半固体发酵培养基的48孔培养板的孔中，盖好孔板盖。再将孔板倒置放入相对湿度维持80％以上的培养箱中37℃培养72h。然后肉眼观察孔板盖是否有液体状产物，有液体状产物的孔板盖位置对应的孔接入的菌株为高产聚谷氨酸菌。
[0043]
共挑取了480个单菌落，根据上述的肉眼观察判断方法，筛选出2株高产量γ-pga的生产菌。进行摇瓶发酵，γ-pga的产量分别为38.15g/l，35.55g/l。