本发明涉及一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
在农业中农药是最经济与有效的提高农产品产量和质量的方法。细菌、真菌、植物体内的支链氨基酸——缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)与异亮氨酸(ile)的生物合成非常重要。植物体内支链氨基酸的合成受阻，会影响植物的光合作用以及生长。支链氨基酸合成过程中需要的第一个酶是乙酰乳酸合成酶(als或ahas,ec2.2.1.6)、酮醇酸还原异构酶(kari,ec1.1.1.86)以及二羟基酸脱水酶(dhad,ec4.2.1.9)，并且这三种酶在哺乳动物中不存在，这个特征提供了找到潜在除草剂靶标的机会。通过抑制这三种酶的活性，阻碍支链氨基酸的产生而使植物生长停滞，光合作用受阻将导致植物逐渐死亡。酮醇酸还原异构酶(kari)作为支链氨基酸合成过程中的一个关键酶，将其作为除草剂靶标以寻找新型绿色高效的除草剂是十分必要的。kari酶抑制剂的设计合成仍在不断开发中，尽管还未曾发现具有高效体内体外抑制活性的化合物，但以kari为靶标的除草剂研究具有非常广阔的空间和前景，有重要的意义。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物及其制备方法和应用。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物，其特征在于其结构式如式(i)所示：
式(i)中两个取代苯环的结构相同，每个取代苯环上的取代基r数量为1-2个，取代基r选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c3烷氧基，优选为h、4-br、2-cl、2-f、4-cl、2,4-(cl)2、2-ch3、4-f、3-cl、4-och3、4-cn、4-c(ch3)3、3-ch3或2-br。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将钠溶解在醇溶剂中，冰浴冷却后加入到盐酸羟胺的醇溶剂中搅拌，然后加入到邻苯二甲酸酐的醇溶剂中室温搅拌，升温反应后加入三乙胺进行回流反应，反应结束后过滤并将滤液旋干，依次加入冷水、盐酸后冰箱放置过夜得到式(ii)化合物；
2)在有机溶剂中，式(ii)化合物和碱性物质反应，反应结束后，加入取代苄溴或取代苄氯后搅拌过夜，反应结束后加入冷水搅拌后过滤，得到式(iii)化合物；
3)将式(iii)化合物在醇溶剂中和水合肼加热回流反应，反应结束后将反应混合物过滤，滤液旋干后用乙醚溶解，搅拌过滤后将滤液旋干得到式(iv)化合物；
4)将式(iv)所示的化合物加入到二氯甲烷后加入三乙胺，在冰浴下加入草酰氯反应，反应结束后依次用盐酸、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后旋干，获得式(i)所示的n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物；
式(iii)、式(iv)中的r和式(i)中的r相同；
步骤2)中，取代苄溴或取代苄氯的苯环上的取代基数量为1-2个，取代苄溴或取代苄氯的苯环上的取代基为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c3烷氧基，优选为4-br、2-cl、2-f、4-cl、2,4-(cl)2、2-ch3、4-f、3-cl、4-och3、4-cn、4-c(ch3)3、3-ch3或2-br。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于醇溶剂为甲醇或乙醇，优选为甲醇；步骤2)中所述有机溶剂为n,n二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环或丙酮中的一种或多种混合溶剂。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤1)中，升温反应的温度为35～45℃，升温反应的时间为20-50min；步骤1)中，钠、盐酸羟胺、邻苯二甲酸酐和三乙胺的摩尔比为1:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5:3。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤2)中，所述碱性物质为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钾、氢氧化钾或氢化钠中的至少一种，式(ii)化合物和碱性物质的物质的量之比为1:1.0～1.5；式(ii)化合物和取代苄溴或苄氯的物质的量之比为1:0.5～1.5。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤2)中，有机溶剂体积用量以式(ii)化合物的物质的量计为3-9ml/mmol。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤3)中式(iii)化合物和水合肼的物质的量之比为1:1.5～2.0。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤4)中二氯甲烷体积用量以式(iv)化合物的物质的量计为1-7ml/mmol。
所述的一种n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤4)中，式(iv)化合物和三乙胺的物质的量之比为1:1.5～2.0，式(iv)化合物和草酰氯的物质的量之比为1:0.5～1.0。
本发明的合成过程如下：
所述的n-苄氧基取代的对称草酰胺类化合物在制备以酮醇酸还原异构酶(kari)为靶标的新型除草剂的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种n1,n2双((取代苄基)氧基)草酰胺衍生物及中间体的其制备方法及应用，该化合物为具有高效除草作用的新化合物，为新型除草剂的研发提供了基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
空白例1：
本发明的含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的合成过程如下：
1)将钠(0.25g,11.0mmol)溶解在甲醇(5ml)中，冰浴冷却后加入到盐酸羟胺(0.76g,11.0mmol)的甲醇(5ml)中搅拌，然后加入到邻苯二甲酸酐(1.48g,10.0mmol)的甲醇(10ml)中室温搅拌30分钟，升温至40℃反应30min后加入三乙胺(3ml)进行回流反应3小时，反应结束后过滤并将黄色滤液旋干，残余物中依次加入冰水、盐酸以便中和其中残留的碱性物质，置于冰箱中冷冻过夜(以便将产物析出)，即得到式(ii)化合物。
2)将n,n-二甲基甲酰胺(15ml)、式(ii)化合物(0.50g,3mmol)和氢氧化钠(0.14g,3.5mmol)反应，反应结束后，加入取代苄溴或取代苄氯(3mmol)后室温搅拌过夜，反应结束后加入冷水搅拌后过滤，得到式(iii)化合物。
3)将甲醇(20ml)、式(iii)化合物(2mmol)和80％水合肼(0.25ml,4mmol)加热回流反应6小时，反应结束后将反应混合物过滤，滤液旋干后用乙醚溶解，搅拌0.5小时过滤后将滤液旋干得到如式(iv)化合物。
4)将式(iv)化合物(0.17g,1.38mmol)、二氯甲烷(5ml)和三乙胺(0.29ml,2.07mmol)，在冰浴下加入草酰氯(58μl,0.69mmol)后室温反应4小时，反应结束后依次用14％浓度的盐酸(10ml*3)、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后旋干，用n,n-二甲基甲酰胺溶解后加入水进行保存，制得式(i)化合物。
实施例1
本实施例1含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(苄氧基)草酰胺，白色固体(0.20g,收率96.6％)。m.p.:157-159℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ7.39(q,j＝7.8hz,10h,ph-h),5.33(d,j＝4.9hz,2h,nh),4.85(s,4h,ph-ch2-).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ156.77,135.81,129.28,128.87,128.76,77.40.hrms(esi)m/z:323.1006[m+na]+；calculated,c16h16n2o4for:323.1008.
实施例2
本实施例2含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是4-溴苄溴(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(4-溴苄氧基)草酰胺。
n1,n2-双(4-溴苄氧基)草酰胺，白色固体(0.03g,收率22.2％)。m.p.:190-192℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ7.60-7.53(m,4h,ph-h),7.39-7.34(m,2h,ph-h),7.32-7.28(m,2h,ph-h),4.83(s,2h,nh),4.59(s,4h,ph-ch2-).hrms(esi)m/z:481.1350[m+na]+；calculated,c16h14br2n2o4for:481.0958.
实施例3
本实施例3含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是2-氟苄氯(3mmol)，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(2-氟苄氧基)草酰胺。
n1,n2-双(2-氟苄氧基)草酰胺，黄色固体(0.45g,收率75.0％)。m.p.:148-150℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ7.49(td,j＝7.7,1.9hz,2h,ph-h),7.44-7.39(m,2h,ph-h),7.21(tt,j＝8.4,2.5hz,4h,ph-h),4.89(s,4h,ph-ch2-),4.79(s,2h,nh).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ162.42,159.96,132.30,131.32,124.79,115.86,115.64,71.07.hrms(esi)m/z:359.0820[m+h]+；calculated,c16h14f2n2o4for:359.0819.
实施例4
本实施例4含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是2-氯苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(2-氯苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(2-氯苄氧基)草酰胺，白色固体(0.04g,收率22.9％)。m.p.:155-156℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.29(s,2h,nh),7.57-7.54(m,2h,ph-h),7.49-7.47(m,2h,ph-h),7.39(tt,j＝7.4,5.4hz,4h,ph-h),4.98(s,4h,ph-ch2-).hrms(esi)m/z:391.0256[m+na]+；calculated,c16h14cl2n2o4for:391.0228.
实施例5
本实施例5含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是4-氯苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(4-氯苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(4-氯苄氧基)草酰胺，黄色固体(0.01g,收率3.6％)。m.p.:154-156℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ7.43(s,8h,ph-h),5.33(s,2h,nh),4.82(s,4h,ph-ch2-).calculated,c16h14cl2n2o4for:369.0409.
实施例6
本实施例6含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是2,4-二氯苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(2,4-二氯苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(2,4-二氯苄氧基)草酰胺，白色固体(0.04g,收率15.2％)。m.p.:186-188℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.27(s,2h,nh),7.66(s,1h,ph-h),7.65(s,1h,ph-h),7.55(d,j＝8.2hz,2h,ph-h),7.47(dd,j＝8.3,2.1hz,2h,ph-h),4.94(s,4h,ph-ch2-).hrms(esi)m/z:437.2386[m+h]+；calculated,c16h12cl4n2o4for:436.9626.
实施例7
本实施例7含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是2-甲基苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(2-甲基苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(2-甲基苄氧基)草酰胺，白色固体(0.06g,收率30.5％)。m.p.:175-177℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.23(s,2h,nh),7.28(ddd,j＝16.1,7.3,1.5hz,4h,ph-h),7.23-7.17(m,4h,ph-h),4.87(s,4h,ph-ch2-),2.41(s,6h,2-ch3).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ156.79,138.39,133.57,130.80,130.56,129.28,126.10,75.82,18.99.hrms(esi)m/z:351.1306[m+na]+；calculated,c18h20n2o4for:351.1321.
实施例8
本实施例8含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是4-氟苄氯(3mmol)，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(4-氟苄氧基)草酰胺。
n1,n2-双(4-氟苄氧基)草酰胺，白色固体(0.02g,收率12.1％)。m.p.:147-149℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ7.45(dd,j＝8.5,5.7hz,4h,ph-h),7.20(t,j＝8.9hz,4h,ph-h),6.67(s,2h,nh),4.81(s,4h,ph-ch2-).hrms(esi)m/z:359.0847[m+na]+；calculated,c16h14f2n2o4for:359.0819.
实施例9
本实施例9含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是3-氯苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(3-氯苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(3-氯苄氧基)草酰胺，白色固体(0.06g,收率43.4％)。m.p.:172-174℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.30(s,2h,nh),7.45-7.40(m,2h,ph-h),7.28-7.16(m,6h,ph-h),4.88(s,4h,ph-ch2-).calculated,c16h14cl2n2o4for:369.0409.
实施例10
本实施例10含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是4-甲氧基苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(4-甲氧基苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(4-甲氧基苄氧基)草酰胺，白色固体(0.02g,收率18.5％)。m.p.:200-201℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.14(s,2h,nh),7.34-7.31(m,4h,ph-h),6.98-6.92(m,4h,ph-h),4.76(s,4h,ph-ch2-),3.76(s,6h,4-och3).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ160.35,159.87,131.64,126.09,114.44,75.81,55.65.hrms(esi)m/z:361.1420[m+h]+；calculated,c18h20n2o6for:361.1400.
实施例11
本实施例11含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是4-氰基苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(4-氰基苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(4-氰基苄氧基)草酰胺，白色固体(0.10g,收率23.8％)。m.p.:227-229℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.37(s,2h,nh),7.86(dd,j＝8.3,3.1hz,4h,ph-h),7.61(d,j＝8.2hz,4h,ph-h),4.95(s,4h,ph-ch2-).hrms(esi)m/z:373.0912[m+na]+；calculated,c18h14n4o4for:373.0913.
实施例12
本实施例12含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是4-叔丁基苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(4-叔丁基苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(4-叔丁基苄氧基)草酰胺，淡黄色固体(0.04g,收率35.4％)。m.p.:168-170℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.19(s,2h,nh),7.42-7.39(m,4h,ph-h),7.34-7.31(m,4h,ph-h),4.81(s,4h,ph-ch2-),1.28(s,18h,4-c(ch3)3).hrms(esi)m/z:413.2459[m+h]+；calculated,c24h32n2o4for:413.2440.
实施例13
本实施例13含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是3-甲基苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(3-甲基苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(3-甲基苄氧基)草酰胺，淡黄色固体(0.06g,收率41.3％)。m.p.:120-122℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.26(s,2h,nh),7.29-7.13(m,8h,ph-h),4.81(s,4h,ph-ch2-),2.31(s,3-ch3).hrms(esi)m/z:351.1331[m+na]+；calculated,c18h20n2o4for:351.1321.
实施例14
本实施例14含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是2-溴苄氯(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双(2-溴苄氧基)草酰胺目标产物。
n1,n2-双(2-溴苄氧基)草酰胺，淡黄色固体(0.16g,收率33.3％)。m.p.:186-188℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.35(s,2h,nh),7.64(dd,j＝8.0,1.2hz,2h,ph-h),7.56(dd,j＝7.6,1.8hz,2h,ph-h),7.42(td,j＝7.5,1.2hz,2h,ph-h),7.31(td,j＝7.7,1.8hz,2h,ph-h),4.96(s,4h,ph-ch2-).hrms(esi)m/z:478.9237[m+na]+；calculated,c16h14br2n2o4for:478.9218.
实施例15
本实施例15含苄氧基的草酰胺类化合物(i)的制备过程重复空白例1，不同之处在于“步骤2)中加入的是溴乙烷(3mmol)”，其余步骤同空白例1，最终制得n1,n2-双乙氧基草酰胺目标产物。
n1,n2-双乙氧基草酰胺，淡黄色固体(0.07g,收率39.8％)。m.p.:132-134℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.05(s,2h,nh),3.85(q,j＝7.1hz,4h,-ch2-),1.15(t,j＝7.0hz,6h,-ch3).hrms(esi)m/z:177.0860[m+h]+；calculated,c6h12n2o4for:177.0875.
实施例16
生物活性测试：待测药物为实施例1-15制得的目标化合物。
除草活性试验对象：生菜，剪股颖。
除草活性试验方法：所有种子在生物测定之前与5-10％高乐氏漂白水混合约10min，进行表面灭菌。然后用去离子水(millipore系统)彻底冲洗种子并在无菌环境中风干。在无菌非热解聚苯乙烯24-孔细胞培养板上进行生物测定，对照组用200μl无菌水，样品组含有180μl水和20μl适当稀释的样品(即待测药物用水适当稀释)。每个孔中放入5颗生菜或者剪股颖种子，盖子用封口膜密封。26℃下，在培养箱中连续光照培养7天后，观察对照组与样品组小苗的生长情况。通过光照条件下化合物对生菜，剪股颖幼苗株高的生长抑制来测试待测药物的除草作用强弱。待测药物的测试浓度：1mm，重复两次。除草活性指标：株高生长抑制率(％)。活性分级指标：4级：抑制率≥80％；3级：抑制率为60～79％；2级：抑制率为40～59％；1级：抑制率为≤20～39％，0级:抑制率≤20。
离体除草活性试验对象：重组质粒(含有水稻kari酶基因)转化的大肠杆菌细胞。
离体除草活性试验反应体系：0.1mol/l磷酸缓冲液(ph8.0)，0.2mmol/lnadph，1mmol/lmgcl2，0.1mmol/l乙酰乳酸，合理量的抑制剂(抑制剂即为待测药物，浓度为1mm)和适量的kari酶蛋白。待测药物的测试浓度：1mm，重复两次。kari酶蛋白的测试浓度为1mm。
离体除草活性试验方法：反应采用动态法进行，连续监测nadph的特征吸收(波长340nm)的降低。反应前将各种成分(反应底物乙酰乳酸除外)加入到一次性的比色皿中，放入分光光度计的样品室(30℃)中开始测试，10min后，加入合理量的乙酰乳酸溶液，迅速混匀后立即继续测试，此时波长340nm处的吸光度开始逐渐下降。以反应初期线性变化部分的斜率(δod340/min)来表示初始酶活性，连续记录340nm的吸光度(监控nadph的消减)，得到吸收曲线，与空白试验(不加化合物)对照计算抑制率。
抑制率(％)＝[(空白试验中nadph吸收曲线斜率-化合物试验中nadph吸收曲线斜率)÷空白试验中nadph吸收曲线斜率]×100％。
除草活性测试试验结果如表1所示。
表1各化合物的除草活性(生长抑制％)
本发明公开了一种式(ⅰ)所示的n1,n2双((取代苄基)氧基)草酰胺衍生物及其制备方法与在抑制幼苗株高和抑制kari酶的应用，本发明化合物为具有对剪股颖有较好的防治效果，如实施例2，实施例4，实施例12和实施例15，为新型除草剂的研发提供了基础。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。