一种犬细小病毒疫苗株、疫苗及其制备方法与流程

本发明属于预防兽医领域，涉及兽用活疫苗，尤其涉及一种犬细小病毒疫苗株、疫苗及其制备方法。

背景技术：

随着环境和人类生活饮食方式的改变，野生动物和伴侣动物与人类之间接触日益密切，因此増加了人类感染动物源性疾病的潜在风险。犬是人类重要的伴侣动物之一，与人类朝夕相伴，因此，加强对犬主要疾病的防控是当务之急。

犬细小病毒(cpv)是引起犬的一种烈性传染病的病原体，它所引起的急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎，是对当今世界犬业威胁和危害最严重的急性、接触性传染病。该病已传遍世界各类犬群，野生和家养犬群中均有cpv广泛蔓延。随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大疫病之一。故彻底消除该病已成为一大难题，因此，防治犬细小病毒性肠炎已成为长期而艰巨的任务，研制安全有效的疫苗就显得十分重要。

技术实现要素：

本发明制备的犬细小病毒活疫苗，采用国内流行毒株的f81细胞传代致弱株，毒力和免疫原性良好，病毒含量高，免疫持续时间长，疫苗安全有效。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬细小病毒性肠炎的疫苗株，所述疫苗株是犬细小病毒疫苗株，所述犬细小病毒疫苗株是微生物保藏号为cgmccno.19398的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。

本发明第二方面提供了一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬细小病毒性肠炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物以本发明第一方面所述的疫苗株为免疫原。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物为活疫苗组合物。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物中，所述免疫原的用量和所述辅料的干重量用量比为1.0×10^5.0tcid50：50-150mg(比如，1.0×10^5.0tcid50：60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg)。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物中，所述免疫原的用量和所述辅料的干重量用量比为1.0×10^5.0tcid50：105mg。

在一些实施方式中，所述免疫原的tcid50是基于f81细胞培养根据reed-muench法计算得到的。

在一些实施方式中，所述疫苗株的培养方法包括如下步骤：

(i)将所述疫苗株接种到f81细胞中培养，收获所述疫苗株的粗毒液；

(ii)将所述疫苗株的粗毒液纯化，得到纯化的疫苗株毒液。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当cpe达到80％(比如，85％、88％、92％、95％、98％)以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当cpe达到90％以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，按照所述病毒株与培养液10^5.0tcid50：50-150ml(比如，10^5.0tcid50：60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、110ml、120ml、130ml、140ml)的用量比接种。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，按照moi＝0.005～0.01(比如，0.006、0.007、0.008、0.009)的用量接种。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养液为含2-8v/v％(比如，3v/v％、4v/v％、5v/v％、6v/v％、7v/v％)新生牛血清的rpmimedium1640。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的温度为36.5-37.5℃(比如，36.7℃、36.9℃、37.1℃、37.3℃)。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的ph值为7.0-7.5(比如，7.1、7.2、7.3、7.4)。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的do值为40-50％(比如，42％、44％、46％、48％)。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当所述培养为转瓶培养时，所述培养是在9-12转/小时(比如，10转/小时、11转/小时)条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当所述培养为悬浮培养时，所述培养是在25-35转/分钟(比如，26转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、32转/分钟、34转/分钟)条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述f81细胞来自单层f81细胞。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，用胰酶消化所述单层f81细胞后接种所述疫苗株。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，对所述疫苗株的粗毒液进行无菌检验。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述f81细胞的制备步骤为：将培养的f81种子细胞扩大培养，得到扩大培养的f81细胞。

在一些实施方式中，所述扩大培养是在36.5-37.5℃(比如，36.7℃、36.9℃、37.1℃、37.3℃)下进行的。

在一些实施方式中，所述扩大培养是在9-12转/小时(比如，10转/小时、11转/小时)条件下在转瓶中进行的。

在一些实施方式中，所述扩大培的养培养液为含6-10v/v％(比如，7v/v％、8v/v％、9v/v％)新生牛血清的rpmimedium1640。

在一些实施方式中，所述扩大培的时间为18-30h(比如，20h、22h、24h、26h、28h)。

在一些实施方式中，当所述培养为悬浮培养时，将所述扩大培养的f81细胞用胰酶消化之后转移到生物反应器中继续培养。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的温度为36-38℃(比如，36.5℃、37℃、37.5℃)。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的ph值为7.0-7.5(比如，7.1、7.2、7.3、7.4)。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的do值为40-50％(比如，42％、44％、46％、48％)。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养是在25-35转/分钟(比如，26转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、32转/分钟、34转/分钟)条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(ii)中，将所述疫苗株的粗毒液冻融1-3次后纯化。

在一些实施方式中，在步骤(ii)中，所述纯化的方法为：用直径为0.22-0.45μm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片，得到所述纯化的疫苗株毒液。

在一些实施方式中，在步骤(ii)中，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥10^6.0tcid50/ml。

在一些实施方式中，所述辅料为冻干保护剂。

在一些实施方式中，所述冻干保护剂为包括2-3mg/m(比如，2.2mg/ml、2.4mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml)l聚乙烯吡咯烷酮、8-12mg/ml(比如，8.5mg/ml、9.0mg/ml、9.5mg/ml、10.0mg/ml、10.5mg/ml、11.0mg/ml、11.5mg/ml)山梨醇、3-7mg/ml(比如，4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml)甘氨酸、30-50mg/ml(比如，35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml)蔗糖、30-60mg/ml(比如，35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml)海藻糖的水溶液。

在一些实施方式中，所述冻干保护剂的制备方法包括如下步骤：

制备包括4-6mg/ml(比如，4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml)聚乙烯吡咯烷酮、16-24mg/ml(比如，18.0mg/ml、20.0mg/ml、22.0mg/ml)山梨醇的第一水溶液；

制备包括6-14mg/ml(比如，8.0mg/ml、10.0mg/ml、12.0mg/ml)甘氨酸、60-100mg/ml(比如，65.0mg/ml、70.0mg/ml、75.0mg/ml、80.0mg/ml、85.0mg/ml、90.0mg/ml、95.0mg/ml)蔗糖、60-120mg/ml(比如，65.0mg/ml、70.0mg/ml、75.0mg/ml、80.0mg/ml、85.0mg/ml、90.0mg/ml、95.0mg/ml、100.0mg/ml、105.0mg/ml、110.0mg/ml、115.0mg/ml)海藻糖的第二水溶液；

将所述第一水溶液与所述第二水溶液以1:0.8-1.2(比如，1:0.9、1.0、1.1)的体积比混合，得到所述冻干保护剂。

在一些实施方式中，将所述第一水溶液灭菌后使用。

在一些实施方式中，将所述第一水溶液经110-120℃(比如，112℃、114℃、116℃、118℃)灭菌后使用。

在一些实施方式中，将所述第二水溶液灭菌后使用。

在一些实施方式中，将所述第二水溶液过滤除菌后使用。

本发明第三方面提供了本发明第二方面所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将所述疫苗株制备成所述疫苗组合物。

在一些实施方式中，将所述疫苗株与所述辅料混合，得到所述疫苗组合物。

在一些实施方式中，将所述疫苗组合物干燥，得到干燥的疫苗组合物。

在一些实施方式中，所述干燥为真空冷冻干燥。

在一些实施方式中，所述冷冻真空干燥包括如下步骤：

(a)将所述疫苗组合物进行冷冻，得到冷冻的疫苗组合物；

(b)在真空条件下对所述冷冻的疫苗组合物进行温度分阶段升高的升华干燥，得到初步干燥的疫苗组合物；

(c)在真空条件下将初步干燥的疫苗组合物在常温条件下升华干燥，得到干燥的疫苗组合物。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，将所述疫苗组合物在-50℃到-40℃(比如，-48℃、-46℃、-44℃、-42℃)下进行冷冻。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述冷冻的持续时间为1.5-2.5h(比如，1.6h、1.8h、2.0h、2.2h、2.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述真空条件为8pa～10pa(比如，8.5pa、9.0pa、9.5pa)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，对所述冷冻的疫苗组合物进行-30℃到-26℃(比如，-29℃、-28℃、-27℃)下的第一升华，-17℃到-13℃(比如，-16℃、-15℃、-14℃)下的第二升华和6-10℃(比如，7℃、8℃、9℃)下的第三升华。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第一升华的时间为4-8h(比如，5h、6h、7h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-50℃到-40℃升高到-30℃到-26℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第二升华的时间为4-8h(比如，5h、6h、7h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-30℃到-26℃升高到-17℃到-13℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第三升华的时间为2-6h(比如，3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-17℃到-13℃升高到6-10℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述真空条件为8pa～10pa(比如，8.5pa、9.0pa、9.5pa)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述升华的温度为25-30℃(比如，26℃、27℃、28℃、29℃)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述升华的时间为1-3h(比如，1.5h、2.0h、2.5h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由6-10℃升高到25-30℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的疫苗株、本发明第二方面所述的疫苗组合物，或本发明第三方面所述的制备方法在制备用于单独使用或与其他免疫制剂和/或药物联合使用以治疗、预防、减缓和/或控制犬细小病毒性肠炎的制剂中的用途。

在一些实施方式中，所述犬细小病毒性肠炎是犬科动物犬细小病毒性肠炎、鼬科动物犬细小病毒性肠炎或猫科动物犬细小病毒性肠炎。

在一些实施方式中，所述犬细小病毒性肠炎是水貂犬细小病毒性肠炎、犬犬细小病毒性肠炎或狐狸犬细小病毒性肠炎。

附图说明

图1为待鉴定犬细小病毒分离培养的照片。

图2为待鉴定犬细小病毒分离株电镜照片。

图3为本发明犬细小病毒活疫苗(p6株)的生产工艺路线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

定义：

临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株：

针对本发明所请求保护的病毒株，很明显，没有突变的传代病毒株属于实质上相同的病毒株，其临床致病性与免疫原性没有变化是指没有实质性变化。由于检测操作条件，动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期的系统误差属于没有实质性变化，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。另外，病毒株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响病毒株致病性和免疫原性的突变(比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响致病性或免疫原性的微小突变的残基)，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为临床致病性与免疫原性没有变化的突变病毒株。比如，本发明生物保藏号为cgmccno.19398的病毒株的f81细胞系传代病毒株，其临床致病性与免疫原性没有实质性变化，则属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。

本发明的tcid50是根据reed-muench法计算得到的。

犬细小病毒强毒cpv-v株：由辽宁益康生物股份有限公司内部分离的毒株，tcid50数据是通过f81细胞测定得到的。

本发明测试用犬均为比格犬。

f81细胞，购自中国兽医药品监察所，由辽宁益康生物股份有限公司传代、保存。

rpmimedium1640，购自gibco，批号：1900496；新生牛血清，购自bovogenbiologicalsptyltd，批号：1507d；胰蛋白酶，购自gibco，批号：1902509。

本发明所指现行《中国兽药典》为《中华人民共和国兽药典》2015版三部，中国农业出版社出版。

本发明犬细小病毒活疫苗(p6株)的生产工艺路线图参见图3。

实施例1.犬细小病毒原始毒株的获取

(1)病例

辽宁省某犬场采集了出现临床犬细小病毒病疑似症状的幼犬1例，发病，症状为：发热、精神沉郁、轻度腹泻症状。根据症状判断，疑似患有犬细小病毒性肠炎。

(2)病毒分离

取患病动物肠管组织，将肠管组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按lg组织：10ml的比例将肠管组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～12000r/min，充分捣碎肠管组织，反复在-15℃以下冻融3次后，用3层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12000r/min4℃下离心30分钟，收集上清，加入终浓度为1000iu/ml青霉素、1000μg/ml链霉素，分装，得到组织液b。

采用f81细胞分离。按常规方法取f81细胞消化培养，培养液为含8％新生牛血清rpmimedium1640，待传代分散细胞时，同步接入上述组织液b，接种量为1v/v％，同时设不接毒的健康细胞对照。置37℃含5％co2培养箱培养观察3～5日，收获培养物，进行鉴定。第1代即出现了可见的细胞病变，细胞出现了拉网和脱落的细胞病变(见图1)，在此基础上，进一步扩大1代，共培养收集200ml细胞培养液b，大部分加入蔗糖脱脂奶保护剂后冻干保存。将细胞培养液b中所含的病毒称作毒株b。

将前述细胞培养液b用含8％新生牛血清的rpmimedium1640细胞培养液作10倍系列稀释，取10^-1～10^-8稀释度，分别同步接种96孔f81细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔接种0.1ml，同时设正常细胞对照8孔，置37℃、含5％co2培养箱培养观察5日，每日观察cpe情况。根据reed-muench法计算tcid50。结果病毒含量为10^5.2tcid50/0.1ml。

(3)形态观察

用磷钨酸对步骤(2)的细胞培养液b上清中毒株b染色再作负染，透射电镜观察，照片参见图2，从形态上观察判断，毒株b为犬细小病毒。

(4)分子生物学鉴定

针对犬细小病毒vp2基因，设计如下序列的引物p1b和p2b，对细胞培养液b上清中毒株b进行rt-pcr检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带大小为390bp，符合犬细小病毒vp2基因的长度，进一步判断，毒株b为犬细小病毒。将扩增产物进行测序，得到的序列ncbi已发表的犬细小病毒病毒株核酸序列同源性最高达99.3％，由此确信，毒株b为犬细小病毒。

p1b：5’-ctcagccaccaactaaag-3’

p2b：5’-gtaagcccaatgctctat-3’

(5)特异性试验

分别采用0.1ml犬细小病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、犬瘟热病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、犬病毒性肝炎病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、狂犬病病毒阳性血清(中和效价不低于40iu/ml)和健康犬阴性血清(阴性血清为未免疫任何疫苗的4月龄健康犬的血清)(前述血清由军事兽医研究所病毒室惠赠)与0.1ml细胞培养液b在37℃孵育1小时，同步接种到f81细胞，培养液为含8％新生牛血清的rpmimedium1640，同时设正常细胞对照(没有接种任何病毒的f81细胞)和病毒对照(细胞培养液b不加血清接种到f81细胞)各6孔，置37℃、含5％co2培养箱中培养观察5日。结果，除了犬细小病毒阳性血清孵育的细胞培养液b和正常细胞对照没有使f81细胞产生细胞病变以外，其他测试中细胞均出现了拉网、破碎、脱落，说明所分离的病毒为犬细小病毒。

由此可知，毒株b为犬细小病毒。

(6)回归试验

将步骤(2)的细胞培养液b(含毒株b)用灭菌生理盐水稀释到病毒含量为10^5.0tcid50/ml，接种2～4月龄犬细小病毒抗体阴性健康幼犬(sn＜1:2)4只，接种量为2.0ml，接种方式为：口服，接种后观察时间为14天，动物症状为：饲养观察至第5、6日时，3只接种犬先后出现轻微肠炎，并伴有发热症状，病程持续5天后康复，饲养方式一致的未注射病毒的4只对照犬均未发病。这些症状为典型的犬细小病毒性肠炎，由此可以判断毒株b为犬细小病毒。

(7)确诊

经前面的检测鉴定综合判定，毒株b为犬细小病毒。

实施例2.犬细小病毒毒株的驯化与毒株生化、遗传的改变的测试

(1)病毒传代培养

将实施例1步骤(2)的细胞培养液b(含毒株b)在f81细胞上连续传代培养至220代，具体步骤如下：

培养液为含8％新生牛血清rpmimedium1640，按照1v/v％剂量将细胞培养液b接种到f81细胞单层上，培养条件为：置37℃、5％co2培养箱培养。培养箱培养观察2～3日，当cpe达到90％以上条件时，收获子代病毒，连续传代220代，将第220代命名为p6株。

将传代致弱的第220代毒种作为犬细小病毒活疫苗制备的候选毒株。

(2)病毒存活性测试

采用实施例1步骤(2)相同的方法，测定180、200、220代毒种细胞培养液的tcid50。结果：180、200、220代病毒培养液测定的病毒含量分别为10^6.71tcid50/ml、10^6.33tcid50/ml、10^6.41tcid50/ml。

依照感染能力测量的病毒含量逐渐减少的趋势，也说明病毒的毒力在逐渐减弱。

(3)病毒安全性试验

取150、180、200、220代病毒细胞培养液，分别采用实施例1步骤(2)相同的方法，计算tcid50，用灭菌生理盐水分别稀释为10^6.0tcid50/ml，口服接种2～4月龄且禁食不禁水24小时的cpv中和抗体效价不高于1:2的健康易感犬5只，每只4.0ml，同时设置4只不接种对照犬，隔离观察14日，分别记录每组犬的临床表现。

结果：150代病毒细胞培养液接种的犬3/5发病，症状表现为：轻微腹泻。180代～220代病毒细胞培养液接种的犬均5/5健活，与对照犬之间未见明显差别，对幼犬没有毒力，表明本病毒没有致病性和副作用。

病毒传180代已经失去了毒力，因此，传220代毒力会更弱，可能能够安全地用作活疫苗。

(4)免疫原性与免疫保护测试

将180、220代毒种细胞培养液分别用灭菌的生理盐水稀释为10^5.0cid50/ml，分别皮下接种5只6周龄cpv抗体阴性健康犬易感犬，每只1.0ml，同时设未注射病毒的对照犬5只，免疫后21日采集血液分离血清，采用中和试验进行中和抗体效价测定，步骤为：以为实施例1步骤(2)的细胞培养液b(含毒株b)作为抗原(含200tcid50)，对血清进行2倍稀释使用，通过接种f81细胞观察cpe来判断免疫效果，根据reed-muench法计算抗体效价。

采集血液之后，用cpv-v株分别通过口服途径对免疫组和对照组各接种2.0ml(含量10^3.0tcid50/ml)，隔离饲养观察14天，记录临床表现。结果，cpv第180代和220代均可诱导机体产生较好的中和抗体，21日中和抗体达1:90.5，具有中和细胞中cpv的作用。免疫犬在攻击强毒后全部健活，对照犬在攻击强毒后全部发病死亡。详情参见表1。

表1.免疫原性测定结果

由此可见，本发明所分离的犬细小病毒传代180代后，毒力消失，免疫原性良好。

(5)无菌检验：

随机抽取致弱的第220代冻存的犬细小病毒毒种细胞培养液(p6株)5支，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：tg培养基、ga培养基和gp培养基培养的5支毒种均无菌生长。

(6)支原体检验：

采用支原体培养基。随机抽取致弱的第220代冻存的犬细小病毒毒种细胞培养液(p6株)，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：琼脂固体平板培养无“煎蛋”状支原体菌落。

阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落。液体培养基颜色变黄ph6.35，呈酸性。

阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落。液体培养基ph7.48。

(7)外源病毒检验

以220代毒种(p6株)为模板，针对犬细小病毒vp2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做pcr扩增，针对犬副流感病毒n基因、狂犬病病毒n基因、犬瘟热病毒h基因做rt-pcr扩增，结果仅针对犬细小病毒vp2基因扩增结果为阳性。

(8)致弱毒的特异性鉴定

取220代致弱毒(p6株)用含8％新生牛血清的rpmimedium1640稀释为200tcid50/0.1ml，采用实施例1步骤(5)相同的方法测定病毒特异性，结果：除了犬细小病毒阳性血清孵育的220代致弱毒细胞培养液和正常细胞对照没有使f81细胞产生细胞病变以外，其他测试中细胞均出现了细胞病变，说明p6株病毒为犬细小病毒。

(9)致弱毒的基因序列分析

利用犬细小病毒vp2基因全长序列的上、下游引物p1b和p2b，对致弱的第180代和220代病毒进行核酸扩增，测序，对序列进行比较。结果二者同源性为99.7％。

将传代致弱的第220代毒种作为犬瘟热活疫苗制备的候选毒株。

(10)微生物保藏

本发明将所分离并驯化的犬细小病毒p6株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是cgmccno.19398。分类命名为：犬细小病毒。保藏时间是：2020年3月30日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该病毒株称作犬细小病毒p6株、cpvp6株、p6株。

实施例3.犬细小病毒疫苗的制备

(1)犬细小病毒性肠炎病毒株(p6株)的转瓶培养

(a)细胞扩大培养：将培养的f81种子细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为：含8v/v％新生牛血清的rpmimedium1640，37℃温度下，控制转速10～11转/小时，培养24小时。

(b)接种：当细胞转瓶长满单层f81，弃去培养液，用240uspu/mg胰酶消化后，按1:2比例传代，加入含8v/v％新生牛血清的rpmimedium1640，将实施例2的细小病毒p6株生产毒种(含量10^5.0tcid50/ml)按1v/v％的接种量同步接种f81细胞，置37℃温度下旋转培养，转速10～11转/小时。

(c)收获：逐日观察细胞病变，当cpe达到90％以上时，收获细胞培养液，-20℃冻融2次。同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。保证无菌后进行后续步骤。

(d)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

(e)病毒含量：采取实施例1步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥10^6.0tcid50/ml。

(f)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(c)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的p6株犬细小病毒液。

(2)犬细小病毒性肠炎病毒株(p6株)的悬浮培养

(a)细胞的制备

取复苏培养的f81细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为：8v/v％新生牛血清的rpmimedium1640，37℃温度下，控制转速10～11转/小时。待细胞生长至致密单层后用240uspu/mg的胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，按2.0～10.0×10⁵细胞/ml接种密度将f81细胞转移至生物反应器中，载体用量为2～5g/l，设定反应器细胞培养的参数(温度37±0.5℃，ph值7.2±0.1，do值45±5％，转速为30r/min)。每间隔24h取样进行细胞观察、计数。

(b)接毒与收获

待生物反应器中f81细胞长成致密单层，细胞密度达到4.0×10⁶细胞/ml，沉淀排出培养液，按照moi＝0.005～0.01接种实施例2的细小病毒p6株生产毒种，补加含2v/v％新生牛血清的rpmimedium1640进行病毒培养，设定反应器病毒培养的参数(温度37±0.5℃，ph值7.2±0.1，do值45±5％，转速为30r/min)，培养36～48h或细胞病变达到90％以上时收获，-20℃冻融2次，同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。配苗前将检验合格的病毒抗原溶液通过无菌离心或过滤去除载体及细胞碎片。

(c)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

(d)病毒含量：采取实施例1步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥10^6.0tcid50/ml。

(e)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(b)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的p6株犬细小病毒液。

(3)冻干保护剂的配制

冻干保护剂的配制包括：(a)稳定剂大分子部分：用100ml注射用水溶解分装后，116℃高压灭菌30分钟。其成分包括：0.5g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、2g山梨醇。(b)稳定剂小分子部分：用100ml注射用水溶解后滤过除菌。其成分包括：1g甘氨酸、8.3g蔗糖、9.2g海藻糖。(c)配苗时，将上述两部分溶液按1:1体积比混合后，得到冻干保护剂。

(4)疫苗的配制

将转瓶培养或悬浮培养得到的检验合格并纯化后的犬细小病毒病毒液(使用灭菌生理盐水稀释到含量10^5.0tcid50/ml)及灭菌的稳定剂按1:1体积比例混合均匀，定量分装。每头份包括1ml犬细小病毒原液和1ml冻干保护剂，每头份病毒含量不低于10^5.0tcid50,分装后，迅速进行冷冻真空干燥，加盖密封，贴签。

冷冻干燥的步骤如下：

(i)在制品未装箱之前，干燥箱的搁板温度降到0℃左右，制品装箱后，干燥箱的搁板继续进行降温，搁板温度的设定为-45℃，此过程需运行时间1小时，在此温度下保持2小时，使制品完全冻牢，共计3小时。

(ii)在产品预冻结束前1小时，冷阱开始降温，当冷阱温度达到-40～-50℃时，启动真空泵组进行抽真空，使冻干箱压力降至8pa～10pa，准备进行制品第一阶段升华干燥。

(iii)在开始第一阶段升华时，搁板温度为-28℃，升华界面不超过其崩解温度，冻干箱压力不超过18pa。第一阶段升华干燥的时间分三个阶段：搁板温度-40℃升高到-28℃，此过程需运行1小时，在此温度保持6小时；由搁板温度-28℃升高到-15℃，此过程需运行1小时；升华干燥时间6小时，由搁板温度-15℃升高到8℃，此过程需运行1小时；升华干燥时间4小时，第一阶段干燥结束，共计19小时。

(iv)解析干燥阶段：第二阶段升华干燥时，使制品温度达到28℃左右，此过程需运行1小时，在此温度保持时间为2小时，使制品水分含量达到1～4％，冻干过程结束。

(5)成品检验

将转瓶培养和悬浮培养得到的各1批疫苗分别进行下面的测试。

(i)疫苗物理状态观察

2批三联苗均海绵状疏松团块，易与甁壁脱离，加灭菌生理盐水后迅速溶解。

(ii)无菌检验：

按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：tg培养基、ga培养基和gp培养基培养的2批三联苗均无菌生长。

(iii)支原体检验：

采用支原体培养基。按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：琼脂固体平板培养2批三联苗均无“煎蛋”状支原体菌落。

阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄ph6.35，呈酸性。

阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基ph7.48。

(iv)外源病毒检验

分别以2批三联苗的核酸为模板，针对犬细小病毒vp2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做pcr扩增，针对犬副流感病毒n基因、狂犬病病毒n基因、犬瘟热病毒h基因做rt-pcr扩增，结果仅针对犬细小病毒vp2基因扩增结果为阳性。

实施例4.疫苗安全性的测定

将前述根据实施例3的方法通过转瓶培养所得病毒所制备的犬细小病毒活疫苗分别用灭菌生理盐水稀释成5头份/ml的注射液，通过一次单剂量、单剂量重复、一次超剂量接种注射液进行安全性试验，每组5只2月龄临床健康犬。

一次单剂量测试中，接种方式为皮下注射，接种剂量为1头份/只。

单剂量重复测试中，接种方式为皮下注射，接种剂量为1头份/只，间隔14日重复接种一次，共接种2次。

一次超剂量测试中，接种方式为皮下注射，接种剂量为10头份/只。

5只未接种的健康犬做对照，相同条件下饲养。

观察每次接种后14日内犬的状态，结果表明，犬细小病毒活疫苗如上各方式接种的犬全部健活，与健康对照组犬健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。

因此，本发明所制备的犬细小病毒活疫苗接种犬安全，可供临床预防犬细小病毒性肠炎使用。

实施例5.疫苗免疫效力与保护测试

取2月龄临床健康犬7只，其中5只应用根据前述实施例3所述方法通过转瓶培养所得病毒所制备的犬细小病毒活疫苗皮下注射疫苗1头份/只，每头份疫苗用1ml灭菌生理盐水稀释后使用，免疫后21日以相同剂量和途径加强免疫一次，另2只不做免疫的犬作空白对照，同条件下进行饲养，二次免疫后21日，连同不注射疫苗的对照犬2只，分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》附录中和抗体效价测定法分别测定血清中和抗体效价，步骤为：以实施例2所制备的犬细小病毒p6株作为抗原(含200tcid50)，对各份血清分别进行2倍稀释使用，通过接种f81细胞观察cpe来判断免疫效果，根据reed-muench法计算抗体效价。

采集血液之后，立即进行强毒攻击。免疫组和对照组每只口服cpv-v株强毒2.0ml(含量10^3.0tcid50/ml)，连续观察14日，记录各免疫组和对照组犬发病、死亡数量。结果参见表2。

表2血清中和抗体和攻毒保护结果

5只接种犬血清的中和抗体效价平均为1:128.0，保护率为100％，对照组未检测到中和抗体，保护率为0。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。