一种用于检测新型冠状病毒的三重实时荧光RT-PCR引物、探针及检测方法与流程

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测咽拭子样品中新型冠状病毒(2019novelcoronavirus，2019-ncov)的三重荧光rt-pcr引物、探针和检测方法。

背景技术：

新型冠状病毒急性呼吸疾病(2019-ncovacuterespiratorydisease)是由新型冠状病毒(2019novelcoronavirus，2019-ncov)引起的一种较严重的呼吸系统疾病，是继sars-cov及mers-cov后一种新发现的传播力强、可感染人的冠状病毒。新型冠状病毒(2019-ncov)主要症状表现为发热、乏力、干咳。少数伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状，与其它呼吸道病毒感染症状类似，很难区分。而且部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现,临床上没有症状，但具有传染性，无疑进一步加大了2019-ncov病毒的防控难度。目前尚无针对新型冠状病毒(2019-ncov)感染的有效抗病毒治疗药物以及疫苗。因此，建立快速诊断新型冠状病毒(2019-ncov)感染的实验室方法显得尤为重要。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在病毒血症时期检测到病毒的感染，并且快速灵敏，能够应用于新型冠状病毒(2019-ncov)病毒的检测。目前，用于病毒检测的分子生物学方法主要是实时荧光rt-pcr法，能够实现在2小时内检测确证病毒核酸。同时，样本的质量好坏对于检测结果有很大的影响，尤其是对于咽拭子的采集，需要刮取到足够数量的人体上皮细胞，才能保证检测结果的可靠性，避免检测结果的假阴性出现。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种用于多重实时荧光rt-pcr核酸扩增技术检测新型冠状病毒(2019-ncov)的三重实时荧光rt-pcr引物和荧光探针以及该荧光rt-pcr引物和荧光探针在检测新型冠状病毒(2019-ncov)中的应用，该荧光rt-pcr引物和荧光探针可以快速、定性检测咽拭子、鼻拭子、痰液等样本中的新型冠状病毒(2019-ncov)，并能监控采样的有效性。

本发明提供的三重荧光rt-pcr引物和荧光探针，应用该荧光rt-pcr引物和荧光探针检测新型冠状病毒(2019-ncov)时，利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应管里能够同时检测病毒的orf1ab基因和n基因，并能够检测人核糖核酶p基因，从而监控采样的有效性，这是目前商品化试剂盒没有的。

本发明可以实现单管多靶标、快速检测新型冠状病毒(2019-ncov)，与其它检测技术相比具有以下优点：

1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；2、同时检测新型冠状病毒(2019-ncov)的2个目标基因，避免出现假阳性或假阴性结果；3、加入人核糖核酶p基因内对照，有效监控样本质量，避免出现假阴性结果；4、本发明提供的三重荧光rt-pcr引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

附图说明

图1为灵敏度实验结果图。

图2为临床阳性样品1检测结果图。

图3为临床阳性样品2检测结果图

图4本方法测试结果图

图5其他商品化试剂盒比较结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测新型冠状病毒(2019-ncov)的三重实时荧光rt-pcr引物、探针的设计

针对于新型冠状病毒(2019-ncov)的orf1ab基因、n基因以及人核糖核酶p基因特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光pcr探针，其序列分别是：

seqid№：1

5′-tggaaaggttatggctgtagttgtg-3′

seqid№：2

5′-cacttacaccgcaaacccgtt-3′

seqid№：3

5′fam-caactccgcgaacccatgcttcagtc-bhq1-3′

seqid№：4

5′-attggccgcaaattgcaca-3′

seqid№：5

5′-tcttctgtctctgcggtaaggc-3′

seqid№：6

5′hex-cccccagcgcttcagcgttcttc-bhq1-3′

seqid№：7

5′-ctgtttgggctctctgaaagtg-3′

seqid№：8

5′-agaagcgctgctcggca-3′

seqid№：9

5′cy5-cgccaaggctgcggtgtccacc-bhq1-3′

实施例2、一种用于检测新型冠状病毒(2019-ncov)的三重荧光rt-pcr方法的建立

(一)三重荧光rt-pcr反应

1)样本rna的提取：所述样本rna可以采用德国凯杰生物工程有限公司的viralrna核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

2)以步骤1)制备的待检测样本rna为模板，加入深圳联合医学科技有限公司试剂盒quantiprobeone-steprt-qpcrkit中的rt-qpcrbuffer反应液、酶混合液等配成三重rt-pcr反应体系，进行扩增反应,。

其中反应体系为25μl，具体如下：

(二)荧光检测

将上述反应管放置于具有三个荧光通道的荧光pcr检测仪进行荧光检测，具体反应程序如下：

阴性对照：fam、hex及cy5通道无扩增曲线，无ct值或ct值为40；

阳性对照：fam、hex及cy5通道有扩增曲线，且ct值均≤26；

上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

4)样品检测结果判读：

当所检测的样品fam通道、hex通道均有扩增曲线，且ct值≤35，cy5通道有扩增曲线，可判定新型冠状病毒(2019-ncov)阳性；

当所检测的样品fam通道、hex通道均有扩增曲线，且ct值在35-40之间，cy5通道有扩增曲线，需重新检测，如果ct值仍在35-40之间，可判定新型冠状病毒(2019-ncov)阳性；

当所检测的样品fam通道、hex通道中只有一个通道有扩增曲线，cy5通道有扩增曲线，则可判定新型冠状病毒(2019-ncov)疑似；

当所检测的样品fam、hex通道均无扩增曲线，且ct值显示为undet或0，cy5通道有扩增曲线，可判定新型冠状病毒(2019-ncov)阴性；

当所检测的样品cy5通道无扩增曲线，且ct值显示为undet或0，则该样品不合格，建议重新采样。

(三)灵敏度实验

该实验验证本检测方法的最低检测限，采用浓度为2.0×10⁹copies/ml、2.0×10⁸copies/ml、2.0×10⁷copies/ml、2.0×10⁶copies/ml、2.0×10⁵copies/ml、2.0×10⁴copies/ml、2.0×10³copies/ml、2.0×10²copies/ml等的质粒阳性对照作为检测限参比品，通过该实验表明该检测方法的fam通道及hex通道的检测限均达到200copies/ml，具体实验结果如图1所示。图1中10⁹拷贝、10⁸拷贝、10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝分别表示浓度为2.0×10⁹copies/ml、2.0×10⁸copies/ml、2.0×10⁷copies/ml、2.0×10⁶copies/ml、2.0×10⁵copies/ml、2.0×10⁴copies/ml、2.0×10³copies/ml、2.0×10²copies/ml的质粒阳性对照扩增曲线，阴性为阴性质控品，横坐标表示ct值，纵坐标表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到200copies/ml。

(四)特异性实验

选择与新型冠状病毒(2019-ncov)具有相同感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特异性参考品分别为甲型h1n1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒。利用qigen公司的viral病毒rna提取试剂盒提取以上样本中的rna作为模板进行实验。结果表明，这4种特异性参考品均未有扩增曲线，说明该检测方法的特异。

(五)临床阳性样本检测实验

选择两例经过国家药监局批准的商品化试剂盒检测为新型冠状病毒(2019-ncov)核酸阳性的样本核酸对该方法进行检测、验证。具体实验结果如图2，3所示。图2，3中横坐标表示ct值，纵坐标表示荧光值。图2，3所示结果表明，该检测方法能够检出新型冠状病毒(2019-ncov)。

序列表

<110>宁波国际旅行卫生保健中心（宁波海关口岸门诊部）

<120>一种用于检测新型冠状病毒的三重实时荧光rt-pcr引物、探针及检测方法

<141>2020-02-10

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