1.本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种一种面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法。
背景技术：
2.面肩肱型肌营养不良症(facioscapulohumeral muscular dystrophy，fshd)是一种遗传性肌肉疾病，表现为进行性面肌、肩脚带肌及上肢肌群的萎缩和肌无力，受其影响最严重的是脸、肩、上臂等部位的肌肉。fshd几乎都是由遗传缺陷所造成的，这些遗传缺陷会导致4号染色体(4q35)亚端粒区上的dna片段比正常人的短。缺失部分并非某一特殊的基因，它可能是通过影响一个或多个其它的基因而导致该病的发生。不同fshd患者病情的进展速度和严重程度的差别很大，病人很多在十几岁开始出现症状，大部分病人在20岁之前已有症状产生，也有些人早在幼儿期或者晚到50多岁才出现肌无力症状。有些人的病情非常轻微，以至于看不出什么症状，这样的病人往往自己没有觉察到有病，只是在有患病更重的亲属被诊断出来之后才发现自己患病。临床上判定fshd诊断的标准包括以下3点：(1)常染色体显性遗传方式；(2)面肌(额肌、眼轮匝肌或口轮匝肌)萎缩无力；(3)肩带肌、上臂肌或足背屈肌萎缩无力。在大部分fshd病人中，病情进展非常慢，其预后虽较其它肌营养不良症(如dmd、lgmd等)好，一般不影响寿命，但致残率高，约20％fshd病人最终需坐轮椅，对患者的生存质量构成较大影响。面肩肱型肌营养不良症具有终身性和可遗传性，患者每生一个后代都有50％的患病机会，因此早期诊断以及进行症状前诊断不仅有利于患者对其职业和婚姻早作打算，更有利于遗传咨询，从而防止本病一代代遗传下去。目前对本病尚无特效的治疗方法，遗传咨询和基因诊断是预防本病的关键措施。
3.面肩肱型肌营养不良症基因被定位于4q35(fshd1a)，95％以上的fshd病例与4q35区的3.3kb串联重复单位d4z4缺失导致ecoir片段缩短有关。有研究表明，此片段可用pl3e-11探针((d4f104si))通过southern杂交来检测，正常人其大小为35-300kb，患者由于缺失而小于35kb。然而，p13e-11在10q26区也可检测到一个片段，其序列与4q35有高度同源性，具有相类似的长度多态性，且也可小于35kb，但这种却是没有致病性的。因此，若只是直接进行eori/pl 3e-11片段的检测，可能导致基因诊断的误诊。因此，需寻求一种特异性强、灵敏度高、简单快速并适用于临床推广的面肩肱型肌营养不良症基因检测方法，为今后对fshd分子发病机制的研究、fshd疾病的预防及治疗奠定基础。
技术实现要素：
4.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法特异性强、灵敏度高，能使不同来源的ecori片段的判断更加准确、直观，并适用于临床推广。
5.本发明采取的技术方案如下：
6.一种面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，包括如下步骤：
7.s1、人基因组dna样品的制备：低熔点胶包埋法抽提完整的外周静脉血基因组dna；
8.s2、人基因组dna限制性内切酶消化与分离：进行人基因组dna的限制性内切酶消化和酶切样品脉冲电泳分离；
9.s3、探针制备：制备ecori+sacl双酶切分离插入的pi3e-11探针片段，电泳检测确定探针的纯度、长度和浓度；
10.s4、southern转移、dna分子杂交：进行southern转移，探针标记，预杂交、杂交，洗膜、放射自显影；
11.s5、杂交条带分析及分子量测定：根据x光胶片，结合凝胶照片，测量出各片段的分离距离，利用曲线拟合法算出各杂交片段的大小，进行基因分析。
12.优选地，步骤s1、人基因组dna样品的制备过程中先进行了外周静脉血acd抗凝处理、白细胞分离处理。
13.优选地，步骤s1低熔点胶包埋法抽提完整的外周静脉血基因组dna过程为：
14.(1)配制1％的低熔点琼脂糖凝胶，将低熔点琼脂糖凝胶加入细胞悬液管中，搅拌均匀，然后注入模具中，4℃保存使凝胶固化得到凝胶块；
15.(2)将凝胶块放入0.5m edta溶液中，再加入蛋白酶k，50℃消化40～50℃小时；
16.(3)取出凝胶块，吸出消化液，用tris-hcl重复清洗2～3次；
17.(4)再用tris-hcl、苯甲基磺酰氟裂解液、edta灭火残留蛋白酶k，纯化dna样品。
18.优选地，步骤s2中人基因组dna的限制性内切酶消化的具体过程为：用tris-hcl对含基因组dna的凝胶进行冰浴透析，然后用灭菌水清洗；配制50u ecori酶、50u xapi酶、50u blni酶、10
×
h buffer，进行ecori及ecori/blni双酶切，xapi酶切，冰浴buffer透析胶块20～30min，使凝胶块的内环境与内切酶反应条件平衡；吸出buffer，用灭菌水清洗，超量酶切法进行消化。
19.优选地，步骤s2中酶切样品脉冲电泳分离过程为：配制1％的应用脉冲场电泳琼脂糖凝胶，1
×
tbe缓冲液，进行脉冲电泳分离，脉冲条件：4.5v/cm的恒定电压，1s/2h—1.5s/6h—5.0s/10h—25.0s/15h，电泳时间共30h。
20.优选地，步骤s3探针制备具体过程为：用质粒抽提试剂盒提取质粒dna，以ecori+saci双酶切分离插入的pi3e-11探针片段，电泳检测确定探针的纯度、长度和浓度，-20℃保存。
21.优选地，步骤s4中southern转移是使dna片段固定于尼龙膜上。
22.优选地，步骤s4中探针标记是指进行同位素标记。
23.优选地，步骤s4中预杂交、杂交是：将含有不同限制性长度dna片段的尼龙膜，在核酸杂交炉中与65～70℃预杂交45～75min，加入同位素标记的探针后再进行杂交。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供。本发明利用应用脉冲场电泳(rflp)技术，与ecori、ecori/blnl及xapi三酶切方法结合进行基因分析，避免了来自10q26同源性片段的干扰，可以直接检出易位、杂合及体细胞嵌合现象，敏感性和特异性均较高，使不同来源的ecori片段的判断更加准确、直观，具有较高的临床应用价值。
具体实施方式
25.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本发明
的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
26.下述实施例中所用的实验原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例
27.实验对象：收集2019年6月至2019年12月间广东省妇幼保健院确诊的fshd患者21例和家系成员30人，21例患者中有男患者13例，女患者8例，年龄6～50岁，另设置了10例健康人员作为对照组。
28.面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，包括如下步骤：
29.s1、人基因组dna样品的制备：采集实验对象的外周静脉血，先进行acd抗凝处理、然后进行白细胞分离处理，再通过低熔点胶包埋法抽提完整的外周静脉血基因组dna，抽提过程具体为：
30.(1)配制1％的低熔点琼脂糖凝胶，将低熔点琼脂糖凝胶加入细胞悬液管中，搅拌均匀，然后注入模具中，4℃保存使凝胶固化得到凝胶块；
31.(2)将凝胶块放入0.5m edta溶液中，再加入蛋白酶k，50℃消化40～50℃小时；
32.(3)取出凝胶块，吸出消化液，用tris-hcl重复清洗2～3次；
33.(4)再用tris-hcl、苯甲基磺酰氟裂解液、edta灭火残留蛋白酶k，纯化dna样品。
34.s2、人基因组dna限制性内切酶消化与分离：
35.人基因组dna限制性内切酶消化：(1)用tris-hcl对含基因组dna的凝胶进行冰浴透析，然后用灭菌水清洗；配制50u ecori酶、50u xapi酶、50u blni酶、10
×
h buffer，进行ecori及ecori/blni双酶切，xapi酶切，冰浴buffer透析胶块20～30min，使凝胶块的内环境与内切酶反应条件平衡；吸出buffer，用灭菌水清洗，超量酶切法进行消化；
36.酶切样品脉冲电泳分离：配制1％的应用脉冲场电泳琼脂糖凝胶，1
×
tbe缓冲液，进行脉冲电泳分离，脉冲条件：4.5v/cm的恒定电压，1s/2h—1.5s/6h—5.0s/10h—25.0s/15h，电泳时间共30h。
37.s3、探针制备：用质粒抽提试剂盒提取质粒dna，以ecori+saci双酶切分离插入的pi3e-11探针片段，电泳检测确定探针的纯度、长度和浓度，-20℃保存。
38.s4、southern转移、dna分子杂交：使dna片段固定于尼龙膜上，探针进行同位素标记，将含有不同限制性长度dna片段的尼龙膜，在核酸杂交炉中与65～70℃预杂交45～75min，加入同位素标记的探针后再进行杂交，再进行洗膜和放射自显影。
39.s5、杂交条带分析及分子量测定：根据x光胶片，结合凝胶照片，测量出各片段的分离距离，利用曲线拟合法算出各杂交片段的大小，进行基因分析。
40.实验分析结果如下：对照组10人的4q35片段条带均大于3bkb，其中8人未发生易位、嵌合及探针片段缺失等情况，2名出现4q—10q易位。在20例fshd中4q35 ecorⅰ/blni片段分子量小于35kb者17例，大于35kb者4例，fshd基因诊断阳性率81％。在检出的17例fshd患者中，有8例散发型患者和9例家族型遗传型患者，8例散发型患者中有5例患者4q35来源的ecori片段易位到10q26上，即发生了4q—10q型易位，另有3例体细胞嵌合患者。9例家族型遗传型患者中有5例有4q—10q非完全易位型杂合片段。本发明所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法可以直接检出易位、杂合及体细胞嵌合现象，具有信息量完整及准确
可靠的优点，使不同来源的ecori片段的判断更加准确、直观，具有较高的临床应用价值。
41.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。