一种本生烟NbAPX3基因多克隆抗体及其制备方法和应用与流程

no.4所示进行扩增。
[0015]
在一些实施例中，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌bl21感受态细胞。
[0016]
上述的多克隆抗体的制备方法，以所述的本生烟nbapx3重组蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清，将抗血清分离纯化得到多克隆抗体。
[0017]
在一些实施例中，所述多克隆抗体的制备方法，包括：将所述的本生烟nbapx3重组蛋白作为抗原注入兔子体内，四次免疫后，采集兔血，分离血清，纯化后得到本生烟nbapx3蛋白抗兔多克隆抗体。
[0018]
进一步的，将本生烟nbapx3重组蛋白浓度调整为1mg/ml作为抗原注射；佐剂和抗原为1:1体积比抽取；首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂。
[0019]
本申请中，一种本生烟nbapx3基因多克隆抗体的制备方法，包括：
[0020]
(1)构建含有seq id no.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；
[0021]
(2)将所述nbapx3蛋白抗原免疫新西兰大白兔动物，经血清分离纯化获得nbapx3蛋白多克隆抗体。nbapx3蛋白标准品的制备，以本生烟叶片的总rna为模版，使用引物nbapx3f和nbapx3r扩增获得nbapx3基因，经酶切连接，克隆入pet-28a载体得到重组质粒pet28a-nbapx3，将该重组质粒转化至大肠杆菌bl21菌株，37℃培养过夜，iptg诱导表达，而后经镍柱亲和层析纯化得到大小为27kda的蛋白。
[0022]
其中，所述nbapx3的引物设计为：
[0023]
nbapx3f:5
’-
cgggatccatgataacgtatgcagatttgtaccagc-3’；酶切位点bamh l
[0024]
nbapx3r:5
’-
ccgctcgagcttcatccttttccgcacttcgtac-3’；酶切位点xho l
[0025]
(3)所述重组表达载体是将含有seq id no.1所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得的。
[0026]
本发明对于所使用的大肠杆菌感受态细胞的种类没有特别的限制，只要能够适合重组表达载体在细胞中有效表达即可，优选的情况下，为了获得更好的表达效果，大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌bl21感受态细胞。
[0027]
在本发明中，可以利用本领域常规适合于重组蛋白抗原的原核表达载体，优选的情况下，当所述原核表达载体为pet-28a时，重组蛋白抗原的表达效果更好。
[0028]
在本发明所提供的方法中，免疫新西兰大白兔的步骤包括4次免疫，首先将纯化的重组蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合后首免后第14d进行二免，而后将纯化的重组蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合后进行二免到四免间隔时间为7d，免疫剂量同第一次。
[0029]
在本发明中，免疫动物时所使用的免疫剂量及与佐剂的混合比例都可以按照本领域常规的方法进行。免疫的动物包括但不限于新西兰大白兔。
[0030]
兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。
[0031]
本发明还提供了利用本发明所述的方法制备的本生烟nbapx3蛋白多克隆抗体。所述多克隆抗体能够特异性的识别nbapx3蛋白中的特异性氨基酸片段seq id no.2，为nbapx3蛋白的特异性抗体。seq id no.2所示的氨基酸序列具体如下：
[0032]
mgsshhhhhhssglvprgshmasmtggqqmgrgsmityadlyqlagvvavevtggptidfvpgrkdssvspkegrlpdakqgvphlkdvfyrmglsdkdivalsgghtlgrahpdrsgfdgpwtkeplkfdnsyfvellkgete
gllklatdiallddpefreyvelyakdedaffrdyaishkklselgftpssgskatlrdgtilaqsavgvvvaaavvalsywyevrkrmklehhhhhhdpaankarkea。
[0033]
本发明还提供了所述的本生烟nbapx3蛋白多克隆抗体的应用。所述应用包括制备含有所述本生烟nbapx3蛋白多克隆抗体的试剂或试剂盒，用于检测本生烟nbapx3在病毒侵染过程中的表达情况或进行功能鉴定。
[0034]
本发明所提供的方法通过pcr方法克隆得到编码nbapx3蛋白的dna序列，从而获得特异性的多克隆抗体。利用本发明所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别本生烟nbapx3蛋白，在nbapx3蛋白的检测、功能鉴定以及研究中具有广泛用途。nbapx3蛋白抗体的制备为检测本生烟nbapx3基因在病毒侵染过程中的表达情况及研究nbapx3蛋白的功能具有重要意义。
附图说明
[0035]
图1为烟草叶片总rna琼脂糖凝胶电泳图。
[0036]
图2为携带有表达载体pet-28a-nbapx3的质粒pcr凝胶电泳图。m：marker；1：目的片段。
[0037]
图3为nbapx3蛋白表达与纯化电泳图。
[0038]
图4为nbapx3蛋白多克隆抗体的效价图。
[0039]
图5为western blot检测血清特异性电泳图：1
#
:过表达nbapx3的烟草；2-5
#
:烟草花叶病毒侵染的烟草的总蛋白。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0041]
(1)本生烟叶片总rna的提取
[0042]
本生烟种子保存于本实验室，采用trizol法提取本生烟叶片总rna，然后进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测提取的本生烟叶片总rna的质量，由图1所示，可以看出，提取的本生烟叶片总rna的完整性特别好，没有降解，也未受到dna的污染，能够作为下一步理想的反转录模板。
[0043]
(2)反转录
[0044]
以上一步骤得到的本生烟叶片总rna作为模板进行反转录得到cdna。
[0045]
(3)nbapx3基因引物的设计与合成
[0046]
①
引物设计
[0047]
根据nbapx3基因的序列，设计并合成在扩增nbapx3核苷酸序列的特异性引物：nbapx3f(seq id no.3)和nbapx3r(seq id no.4)；分别引入酶切位点bamh l和xho l，以连接原核表达重组载体pet-28a。引物采用page的纯化方式，送上海生工生物工程股份公司进行合成。
[0048]
所述nbapx3的引物设计为：
[0049]
nbapx3f:5
’-
cgggatccatgataacgtatgcagatttgtaccagc-3’(seq id no.3)；酶切位点bamh l
[0050]
nbapx3r:5
’-
ccgctcgagcttcatccttttccgcacttcgtac-3’(seq id no.4)；酶切位
点xho l
[0051]
②
rt-pcr
[0052]
以反转录得到的cdna为模板，利用上述引物获取目的nbapx3，nbapx3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
[0053]
atgataacgtatgcagatttgtaccagcttgcaggagttgttgcagttgaagtcactggtggtccgaccattgattttgtccctggtaggaaggattccagtgtttctccaaaggaaggacggctgccagatgctaaacaaggtgtgccacatctgaaagatgtattttataggatgggtttgtctgacaaagatatagtggcactatctggtggtcacacactgggaagggcacatccagatagatcaggctttgatggtccatggacaaaggagccactgaaatttgacaattcatattttgtggagctgcttaagggggaaactgagggcctgctgaaacttgctacagacatagctttattggatgatcctgagttcagagaatatgttgagctgtatgctaaggatgaagatgccttctttagggattatgccatatcacacaagaaactatctgagctagggtttaccccaagttctggttccaaggctacactgagggatggcactatattagcacaaagtgctgtaggagttgttgtggctgctgcagtggtggcactgagttactggtacgaagtgcggaaaaggatgaagtga
[0054]
以本生烟叶片总rna为模板，以nbapx3r引物，通过反转录酶m-mlv，合成cdna，反转录体系见表1。
[0055]
表1反转录体系
[0056]
模板rna600ngnbapx3r0.5μlrtase m-mlv0.5μl5
×
m-mlv buffer2μldntp mixture2μlrnase inhibitor(40u
·
μl-1
)0.25μlddh2o至10μl
[0057]
轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；
[0058]
pcr反应体系见表2。
[0059]
表2 pcr反应体系
[0060]
cdna2μl2
×
taq mix25μlnbapx3f2μlnbapx3r2μlddh2o至50μl
[0061]
pcr程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
[0062]
吸取rt-pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收。
[0063]
③
dna片段与载体的连接
[0064]
目的基因片段10μlpmd19-t0.5μlt4 dna ligase1μl10
×
t4 ligase buffer2μl
ddh2o至20μl
[0065]
反应体系在16℃条件下孵育12-16h。取10μl转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。过夜培养，选择单菌落进行pcr检测，最后选5个以上阳性单克隆提取质粒并进行测序。
[0066]
④
构建重组质粒
[0067]
回收产物利用bamh l和xho l进行双酶切，酶切回收产物连接到相应酶切的pet-28a载体上，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，通过菌液pcr、酶切和测序鉴定阳性重组菌。
[0068]
酶切体系见表3。
[0069]
表3酶切体系
[0070]
回收产物40.5μlbamh l1μlxho l1μl10
×
k buffer2.5μlbsa5μl
[0071]
37℃酶切2h。
[0072]
通过axyprep
tm dna gel extraction kit提取阳性重组质粒，转化到大肠杆菌bl21菌株感受态细胞，经菌液pcr、酶切鉴定获得阳性克隆。
[0073]
⑤
蛋白的原核表达
[0074]
挑取阳性菌株接种于2ml lb液体培养基，37℃活化过夜。活化菌液按1:100加入新鲜lb中，37℃培养至od
600
为0.6。分别在28℃和37℃下进行诱导，每个温度取2管，一管加iptg至终浓度为1mm,另一管不加iptg作为对照，培养4-6h。取2ml诱导培养物，12 000rpm离心30s收集菌体。加入200μl sds-page loading buffer，沸水煮10min，12 000rpm离心10min。取8ml上清进行sds-page电泳检测。
[0075]
通过预实验确定蛋白表达后，在1l液体lb中按1:100加入10ml活化菌液，37℃培养至od
600
为0.6，用1mm iptg于18℃诱导18h。然后离心收集菌体，用40ml含20mm tris-hcl(ph 7.0)、500mm nacl、10％甘油的蛋白buffer重悬，加蛋白酶抑制剂至终浓度为1mm，超声波破碎，离心收集上清和沉淀。上清用genscript公司的high affinity ni-nta resin纯化。5ml high affinity ni-nta resin过5倍柱体积蛋白buffer，上清过柱子5遍，分别用10ml含10mm、50mm、100mm、200mm咪唑的蛋白buffer洗脱，洗脱液进行sds-page电泳检测(图3)。将含目的蛋白的洗脱液用蛋白浓缩柱浓缩，分装后液氮速冻，-80℃保存。(2)nbapx3蛋白多克隆抗体的制备
[0076]
①
选择体重2.5kg左右青壮年新西兰大白兔，做好标记。用浓度为1mg/ml nbapx3外壳蛋白作为免疫原新西兰大白兔。首次免疫中，先将抗原完全混匀，而后与弗氏完全佐剂(石蜡油：羊膜脂＝7:1，另外加1mg/ml灭活的结核分枝杆菌成分)按照1:1体积比充分混匀，乳化完全后，进行多点皮下注射，每点0.2ml，每只新西兰大白兔免疫剂量1mg。
[0077]
②
第二-四次免采用弗氏不完全佐剂(石蜡油：羊膜脂＝7:1)，仍按照1:1体积比与抗原充分混匀。首免后第14d进行二免，二免到三免间隔时间为7d，免疫剂量同第一次。
[0078]
③
兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测：自免疫新西兰大白兔耳缘静脉采血200μl至无菌离心管中，37℃温育2h，而后4℃过夜。次日，12 000rpm离心2min，分离血清。使用间接elisa法检测抗体效价至1:20 000以上，即可采血。
[0079]
④
7天后加免，加免完7天后，将免疫新西兰大白兔禁食一天，可采集全血。
[0080]
⑤
采血后，放置到血清分离瓶中，37℃温育2h，而后4℃过夜。次日，用灭菌毛细管收集析出的血清，剩余样品3 000rpm离心3min，继续收集分离出的血清，将收集到的血清加入质量百分比浓度为0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。
[0081]
⑥
多克隆抗体igg的粗纯
[0082]
称取deae-纤维素(de32或de52)50g，置于1,000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/l，ph 8.0左右的磷酸盐缓冲液平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低离子强度。按1ml血清加湿重5g deae纤维素，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的igg。
[0083]
(3)间接elisa法测定抗体效价
[0084]
①
包板：用包被缓冲液(na2co3和nahco3缓冲液)将已知抗原稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1x tbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。
[0085]
②
封闭：每孔加60μl的1％bsa(tbst配制)进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。
[0086]
③
加样：加一定稀释的待检样品(把待检样品按照一定的比例进行稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(bsa)。置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1x tbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。
[0087]
④
加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-hrp(1:5k，用1％bsa进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1x tbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。
[0088]
⑤
加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液100μl，置37℃反应5min。
[0089]
⑥
终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸90μl。
[0090]
⑦
读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。
[0091]
图4为nbapx3蛋白多克隆抗体的效价图。
[0092]
(4)多克隆抗体的western blot检测
[0093]
①
先60v电泳，待样品进入分离胶后，150v电泳至溴酚兰刚刚跑出，停止电泳。
[0094]
②
转模：a、电泳结束，关开关，取下胶板。将胶板放于白瓷盘另一边，用绿色刮板的尖端轻轻推入，起开小玻璃板，去浓缩胶，根据marker的27kda条带，用绿色刮板切目的凝胶条带，将pvdf膜左上角剪去；b、将三明治放于电转槽，黑色板对黑面放。转膜条件：200ma转膜2h。
[0095]
③
封闭：转移完毕的硝酸纤维素膜在tbst缓冲液中漂洗一下，转入10ml封闭液(5％脱脂奶粉)中37℃封闭2h。
[0096]
④
孵育一抗：封闭完成后，将硝酸纤维素膜在tbst缓冲液中漂洗3次，每次10min，在tbst缓冲液中加入一定体积的特异性抗血清，37℃反应1h。
[0097]
⑤
孵育二抗：将硝酸纤维素膜在tbst缓冲液中漂洗3次，每次10min，再加用tbst稀释(1:5000)的ap-a二抗，37℃反应30-60min。
[0098]
⑥
显色：用tbst洗膜3次，每次10min。避光条件下，将硝酸纤维素膜置于含330μg/ml nbt和165μg/ml bcip的碱性磷酸酯酶缓冲液中显色至条带清晰。用清水清洗完毕，将pvdf膜转至凝胶成像仪，拍照，保存。
[0099]
为了验证该试剂盒精度、准确度，我们首先通过western-blot对田间样品进行检测，按照上述步骤分别提取编号为1的过表达nbapx3的烟草、编号为2-5的烟草花叶病毒侵染的烟草的总蛋白。结果如图5所示，nbapx3蛋白在病毒侵染时的表达量增强。由此可知nbapx3蛋白的积累与病毒的侵染关系密切。
[0100]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员对之可作一些修改或改进。但是，在不偏离本发明内涵的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。