[0001]
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及提高6-去甲基四环素发酵效价的补料培养基及其应用。
背景技术：
[0002]
米诺环素是目前使用的四环素中作用较强者，抗菌谱与四环素相近，对革兰氏阳性菌包括耐四环素的金黄色葡萄球菌、链球菌和革兰氏阴性菌中的淋病奈瑟球菌均有很强的作用，具有高效广谱，有效剂量低，口服吸收迅速，体内分布广及长效等优点。米诺环素的生产工艺流程的第一步就是以6-去甲基金霉素为原料经高压催化反应生成6-去甲四环素。本发明中6-去甲四环素是通过微生物发酵方法直接大量获得，减少了6-去甲基金霉素的发酵过程和第一步高压催化反应，简化米诺环素合成的步骤，减少设备投资，降低了生产成本。
[0003]
目前行业内发酵法生产6-去甲四环素的研究较少，研究方向主要有两个：一是中国科学院微生物研究所通过基因工程的手段对金色链霉菌进行改造，产生6-去甲四环素，但是其缺点是改造后菌株的生产能力较低，且副产物含量较多，暂时不具备工业化的条件；二是河北圣雪大成制药有限责任公司直接使用金色链霉菌通过生产工艺的调整进行发酵生产6-去甲四环素，但是其发酵效价较低，也达不到工业化的条件。
技术实现要素：
[0004]
本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，提供了提高6-去甲基四环素发酵效价的补料培养基及其应用，能够通过调整发酵培养基和补料培养基的成分和比例，缩短了6-去甲基四环素的发酵周期，提高了生产效率；同时提高了6-去甲基四环素的发酵放罐效价，降低了生产成本。
[0005]
本发明采用的具体技术方案是：一种提高6-去甲基四环素发酵效价的补料培养基，关键是：补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉40-50％，玉米浆0.1-0.5％，溴化钠0.1-0.2％，l-天冬酰胺0.1-0.5％，丙二酸二甲酯0.1-0.2％，氯化钴0.01-0.05％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.01-0.03％，剩余为水。
[0006]
一种提高6-去甲基四环素发酵效价的补料培养基的应用，关键是，包括以下步骤：
[0007]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0008]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培养；
[0009]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml，同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内；
[0010]
d、培养8天得到发酵液，检测6-去甲基金霉素的发酵效价。
[0011]
优选地所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉2.5-4.5％，黄豆饼粉1.5-2.5％，酵母浸粉0-1.0％，硫酸铵1-1.5％，轻质碳酸钙0.2-0.5％，溴化钠0.1-0.2％，硫酸镁0.01-0.03％，剩余为水。
[0012]
优选地，所述步骤b中，发酵培养基配方：以质量体积比计，玉米淀粉4.0-6.0％，黄豆饼粉2.0-2.5％，酵母浸粉0.5-1.0％，硫酸铵0.2-0.5％，轻质碳酸钙0.5-1.0％，溴化钠0.1-0.2％，硫酸镁0.01-0.03％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.01-0.03％，剩余为水。
[0013]
本发明的有益效果是：通过研究金色链霉菌的生长特点和分析6-去甲基四环素的合成机理，首先调整了发酵培养基原材料的成分和比例，提高了菌体浓度并加快了初级代谢的速度，另一方面在补料培养基中添加促进6-去甲基金霉素合成的前体物质及促进合成酶的金属离子，使6-去甲基金霉素的发酵单位提高了40.52％，提高了生产效率，降低了生产成本。
具体实施方式
[0014]
本发明提供了一种提高6-去甲基四环素发酵效价的方法，其目的在于克服现有技术的不足，提高发酵单位，提高生产效率和降低生产成本，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：
[0015]
对照组
[0016]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0017]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培养。
[0018]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml。同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内。
[0019]
所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉4％，黄豆饼粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.8％，轻质碳酸钙0.3％，溴化钠0.15％，硫酸镁0.02％，剩余为水。
[0020]
所述的步骤b中发酵培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉5％，黄豆饼粉2.0％，硫酸铵0.4％，轻质碳酸钙0.8％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0021]
所述的步骤c中补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉45％，玉米浆0.3％，溴化钠0.1％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0022]
d、培养8天得到发酵液，用hplc检测6-去甲基金霉素的发酵效价为4855μg/ml。
[0023]
实施例1
[0024]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0025]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培养。
[0026]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml。同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内。
[0027]
所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉4％，黄豆饼粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.8％，轻质碳酸钙0.3％，溴化钠0.15％，硫酸镁0.02％，剩余为水。
[0028]
所述的步骤b中发酵培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉5％，黄豆饼粉2.0％，酵母浸粉0.8％，硫酸铵0.4％，轻质碳酸钙0.8％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0029]
所述的步骤c中补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉45％，玉米浆0.3％，溴化钠0.1％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0030]
d、培养8天得到发酵液，用hplc检测6-去甲基金霉素的发酵效价为5103μg/ml。
[0031]
实施例2
[0032]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0033]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培养。
[0034]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml。同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内。
[0035]
所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉4％，黄豆饼粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.8％，轻质碳酸钙0.3％，溴化钠0.15％，硫酸镁0.02％，剩余为水。
[0036]
所述的步骤b中发酵培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉5％，黄豆饼粉2.0％，酵母浸粉0.8％，硫酸铵0.4％，轻质碳酸钙0.8％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0037]
所述的步骤c中补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉45％，玉米浆0.3％，溴化钠0.1％，l-天冬酰胺0.2％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0038]
d、培养8天得到发酵液，用hplc检测6-去甲基金霉素的发酵效价为5681μg/ml。
[0039]
实施例3
[0040]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0041]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培
养。
[0042]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml。同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内。
[0043]
所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉4％，黄豆饼粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.8％，轻质碳酸钙0.3％，溴化钠0.15％，硫酸镁0.02％，剩余为水。
[0044]
所述的步骤b中发酵培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉5％，黄豆饼粉2.0％，酵母浸粉0.8％，硫酸铵0.4％，轻质碳酸钙0.8％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0045]
所述的步骤c中补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉45％，玉米浆0.3％，溴化钠0.1％，丙二酸二甲酯0.2％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0046]
d、培养8天得到发酵液，用hplc检测6-去甲基金霉素的发酵效价为5867μg/ml。
[0047]
实施例4
[0048]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0049]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培养。
[0050]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml。同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内。
[0051]
所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉4％，黄豆饼粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.8％，轻质碳酸钙0.3％，溴化钠0.15％，硫酸镁0.02％，剩余为水。
[0052]
所述的步骤b中发酵培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉5％，黄豆饼粉2.0％，酵母浸粉0.8％，硫酸铵0.4％，轻质碳酸钙0.8％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0053]
所述的步骤c中补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉45％，玉米浆0.3％，溴化钠0.1％，氯化钴0.05％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0054]
d、培养8天得到发酵液，用hplc检测6-去甲基金霉素的发酵效价为5404μg/ml。
[0055]
实施例5
[0056]
a、种子培养：将金色链霉素孢子液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量1.0-1.5vvm的条件下培养20-28h，得到种子液；
[0057]
b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比20％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度27-29℃、转速300-800rpm、通气量0.8-1.2vvm的条件下进行培养。
[0058]
c、补料：按照补料培养基配比配制补料罐，待总糖降至3g/100ml时开始流加补料，控制总糖的含量维持在3
±
0.5g/100ml。同时使用氨水将发酵液的ph控制在6.6-6.8的范围内。
[0059]
所述的步骤a中种子培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉4％，黄豆饼粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.8％，轻质碳酸钙0.3％，溴化钠0.15％，硫酸镁0.02％，剩余为水。
[0060]
所述的步骤b中发酵培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉5％，黄豆饼粉2.0％，酵母浸粉0.8％，硫酸铵0.4％，轻质碳酸钙0.8％，溴化钠0.1％，硫酸镁0.02％，α淀粉酶(玉米粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0061]
所述的步骤c中补料培养基的成分与比例为：以质量体积比计，玉米淀粉45％，玉米浆0.3％，溴化钠0.1％，l-天冬酰胺0.2％，丙二酸二甲酯0.2％，氯化钴0.05％，α淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.4％，消泡剂0.02％，剩余为水。
[0062]
d、培养8天得到发酵液，用hplc检测6-去甲基金霉素的发酵效价为6822μg/ml。
[0063]
通过实施例1表明，在发酵培养基中添加0.8％的酵母浸粉可以使放罐效价提高5.1％；以实施例1为基础，在实施例2-4中依次添加0.2％的l-天冬酰胺、0.2％丙二酸二甲酯、0.05％氯化钴可使放罐效价分别提高11.3％、15.0％、5.9％，说明三种物质对促进产物合成都有积极的作用，其中添加0.2％丙二酸二甲酯作用最明显。在实施例5中将3种物质同时添加至补料培养基中，对比实施例1放罐效价提高了33.7％，比对照组提高了40.5％。
[0064]
本发明所提供的一种提高6-去甲基四环素发酵效价的补料培养基不仅可以提供充足的碳源和氮源维持菌体次级代谢产生效价，还以6-去甲基四环素的合成途径为依据，提供了促进产物合成的前体物质和金属离子，加大了产物合成的代谢流，使6-去甲基金霉素的发酵单位达到6822μg/ml，提高规模化生产的经济可行性，降低了生产成本。