水稻组蛋白甲基转移酶在增强作物干旱抗性及改善单株产量中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种与水稻表观遗传学调控相关的组蛋白h3k36甲基转移酶（sdg708）在渗透压胁迫抗性和干旱胁迫抗性方面的应用，还涉及该过量表达植株在正常及干旱胁迫条件下改善产量性状方面的应用。


背景技术：

[0002]
表观遗传学主要研究在基因型不变的情况下，基因表达产生差异的机制。染色质的结构和功能被多种表观遗传机制所调节，包括组蛋白修饰、dna甲基化、atp依赖性的染色质重塑、组蛋白变体的替换以及非编码rna的调节等。组蛋白赖氨酸甲基化修饰是近年来被广泛研究的一种组蛋白修饰，它在调控染色质结构和基因表达方面起重要作用，主要涉及的位点包括组蛋白h3 (histone 3) k4 (lysine 4)，k9，k27，k36，k79和组蛋白h4的k20位点。赖氨酸的甲基化还可以分为单、双和三甲基化，这些不同残基位置以及不同状态的甲基化修饰构成了组蛋白赖氨酸甲基化功能的多样性。一般来说，h3k4、h3k36 和h3k79的甲基化修饰对应于转录激活，而h3k9、h3k27 和h4k20的甲基化修饰则与异染色质和基因沉默相关。
[0003]
组蛋白h3赖氨酸k36（h3k36）甲基化修饰是一种重要的表观修饰，而催化h3k36甲基化修饰的酶在植物中已有一些报道，由于他们含有保守的set结构域，所以被称为set domain group （sdg）蛋白。在水稻中已经鉴定到的h3k36甲基转移酶包括sdg725、sdg724和sdg708，他们通过自己独特的方式调控水稻生长发育（mol plant, 2013, 6:975-977；plant j, 2012, 70: 340-347；plant cell, 2012, 24:3235-3247；new phytol, 2016, 210: 577
–
588）。水稻sdg708是一种全局性的h3k36甲基转移酶，负责建立1/2/3甲基化修饰，sdg708突变体表现出明显晚花表型（new phytol, 2016, 210: 577
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588）。综上所述，植物中h3k36甲基转移酶介导的h3k36的甲基化修饰在植物的生长发育尤其是开花时间调控过程中执行重要功能。
[0004]
由于固着生长特性，植物在生长过程中必然面对大量的不利环境影响，为了生存，植物进化出多种迥异于动物的环境应答调控机制。植物在感知不利环境胁迫后会改变一系列代谢途径和逆境响应基因的表达，例如调控植物激素，尤其是脱落酸aba等内源激素，参与各类转录因子和激酶级联放大反应激活或者抑制下游多种胁迫基因的表达（cell，2016,167(2):313-324），近些年研究发现，表观遗传机制在植物抗逆过程中承担重要功能，例如植物响应高盐、干旱或温度过程中，特定基因或整个基因组水平dna甲基化修饰都发生改变，从而提高植物的非生物胁迫抗性。
[0005]
水稻作为非常重要的粮食作物，全球60%的人口以稻米为主食，同时它也是研究单子叶植物的重要模式生物。干旱等极端环境胁迫是造成粮食作物大规模减产甚至绝收的主要因素，因此培育具有优良环境胁迫耐受力的高产农作物一直是农业科学技术研究及应用的重要目标之一。之前对水稻sdg708的研究证实其涉及植物开花调控进程，同时转录组数
据分析也表明该基因可能涉及水稻非生物胁迫应答反应（new phytol, 2016, 210: 577
–
588），然而sdg708及由其建立的h3k36甲基化修饰如何调控水稻干旱抗性以及农艺性状目前仍没有报道，同时改变sdg708表达量能否影响植株干旱抗性和产量性状也值得关注。因此，深入研究水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶sdg708干旱抗性和产量调控的作用机制及应用价值，对于阐明组蛋白h3k36甲基化修饰与环境响应及农艺性状改善的关系，以及依此培育优质抗旱高产水稻具有非常重要的理论及实际应用价值。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种水稻组蛋白h3k36甲基转移酶在水稻干旱胁迫应答和农艺性状改善方面的应用。
[0007]
本发明涉及的组蛋白甲基转移酶基因，赋予了水稻在人工模拟干旱条件下和土壤干旱条件下提高抗旱性的能力，该基因还赋予水稻在正常生长条件和干旱条件下改善产量性状的能力。其中本发明涉及的组蛋白h3k36甲基转移酶，来源于水稻（oryza sativa ssp. japonica），名称为sdg708，是下述氨基酸残基序列之一：（1）序列表中的seq id no:1；（2）将序列表中的seq id no:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
[0008]
序列表中的seq id no:1由518个氨基酸残基组成。
[0009]
编码本发明组蛋白h3k36甲基转移酶的基因sdg708的核苷酸序列如序列表中seq id no:2所示，由1557个碱基组成，其编码框为自5’端第1-1557位碱基，编码具有序列表中的seq id no:1的氨基酸残基序列的蛋白质。
[0010]
本发明还包括sdg708基因增强水稻干旱抗性的作用机制及具体应用。
[0011]
本发明还包括sdg708基因改善水稻产量等农艺性状的机制及具体应用。
[0012]
在实际应用中，将玉米泛素基因启动子与上述sdg708基因的全长cds序列连接，构建重组过量表达转化载体并转化水稻，得到过量表达sdg708的水稻，使水稻具有更好的干旱胁迫抗性。同时使水稻在正常生长条件下和干旱胁迫条件下维持了更高的单株产量。反之，将所述基因的反义表达载体转化水稻，得到具有干旱敏感和单株产量降低表型的水稻。
[0013]
本发明中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
[0014]
本发明为水稻育种行业提供了一个优质抗旱增产基因，并经过深入实验研究，解释了sdg708以及由其建立的h3k36甲基化修饰的干旱应答调控机制及增产机制。本发明可利用现代生物技术，将该甲基转移酶基因应用于生物育种过程中，能够有效提高水稻植株的抗逆性能和产量性状，因此，具有较高的农业应用价值，应用前景广阔。
附图说明
[0015]
图1为野生型水稻（wt）、水稻组蛋白h3k36甲基转移酶sdg708的rna干扰突变体植株（708ri-1和708ri-2）以及sdg708过量表达植株（708oe-1和708oe-2）在peg模拟干旱胁迫下的抗性表型图。
[0016]
图2为野生型水稻（wt）、水稻组蛋白h3k36甲基转移酶sdg708的rna干扰突变体植株（708ri-1和708ri-2）以及sdg708过量表达植株（708oe-1和708oe-2）在土壤干旱胁迫下
的抗性表型图。
[0017]
图3为野生型水稻（wt）、水稻组蛋白h3k36甲基转移酶sdg708的rna干扰突变体植株（708ri-1和708ri-2）以及sdg708过量表达植株（708oe-1和708oe-2）在正常条件和土壤干旱胁迫条件下的产量表型图。
[0018]
图4为野生型水稻（wt）、水稻组蛋白h3k36甲基转移酶sdg708的rna干扰突变体植株（708ri-1和708ri-2）以及sdg708过量表达植株（708oe-1和708oe-2）在peg处理前后sdg708基因表达的实时荧光定量pcr检测结果。
具体实施方式
[0019]
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。
[0020]
实施例1.水稻的组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因sdg708的获得从水稻基因组数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu）获得os04g0429100基因序列，根据5’和3’末端序列设计一对引物，引物序列分别为：5’－ atggaggaagagcgcatgga－3’（ seq id no:3），和5’－ tcatggaccgttttccaagt－3
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（seq id no:4）。
[0021]
提取水稻幼苗总rna（promega，sv total rna isolation system），以水稻的总rna为模板，用amv反转录酶（takara）合成cdna（依据plant rt－pcr kit 2.01（takara）的用户手册进行）。以cdna为模板，pcr扩增水稻的组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因sdg708的全长cdna序列。50ul pcr反应体系包含：模板2ul，高保真酶kod plus（toyobo） 1ul，10
×
缓冲液5ul，2.5um dntp 8ul，20um的 5'和3’引物各1ul，水32ul。反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸1.5分钟，共30个循环。反应结束后，将pcr产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1557bp的扩增片段，将其克隆到载体puc19（takara）中，得到含有回收片段的重组质粒，经测序表明水稻组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因sdg708全长cdna具有序列表中的seq id no:2的核苷酸序列，序列表中的seq id no:2由1557个碱基组成，其编码框为自5’端第1-1557位碱基，编码具有序列表中的seq id no:1的氨基酸残基序列的蛋白质，编码蛋白命名为sdg708。
[0022]
实施例2.sdg708过量表达及rna干扰突变植株的获取一、sdg708过量表达载体的构建为了分析sdg708基因的功能，以sdg708基因为靶基因，构建sdg708基因过量表达载体。以实施例1得到的puc19
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sdg708为模板，分别以两对不同的引物pcr扩增sdg708自5’端第1到1557位的核苷酸序列。所用的引物对为：5
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gtcgacatggaggaagagcgcatgga－3
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（seq id no:5），5’－ggatcctcatggaccgttttccaagt－3
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（ seq id no:6），所得pcr产物为sdg708-cds。使用sal i和bamh i酶切产物并回收。使用sal i和bamh i酶切携带ubiquitin基因启动子和eyfp标签的遗传转化载体pu1301(pu1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pcambia1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体)。回收片段化载体并连接酶切回收的pcr片段，即获得puc1301-sdg708重组载体。
[0023]
二、sdg708反义表达载体的构建利用rna干扰(rna interference, rnai)技术，以sdg708基因为靶基因，构建rna干扰载体。以实施例1得到的puc19
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sdg708为模板，分别以两对不同的引物pcr扩增sdg708自5’端第363到612位的核苷酸序列，作为发夹结构的互补dna双链。所用的引物对1为：5
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ccatggctgcagatggaaggaagccaagagga-3
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（ seq id no:7），5’－ gaattcaaagttgtagtcataggata－3
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（ seq id no:8）；所得pcr产物为fsdg708i（forward）。引物对2为：5
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tctagaatggaaggaagccaagagga-3
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（seq id no:9），5’－aagcttaaagttgtagtcataggata－3
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（ seq id no:10）；所得pcr产物为rsdg708i（reversed）。
[0024]
为便于后续的载体构建，在fsdg708i的5’和3’端分别添加了ncoⅰ和ecorⅰ的限制性酶切位点，在rsdg708i的5’和3’端分别引入xbaⅰ和hindiii的限制性酶切位点。
[0025]
为便于rnai载体构建，在连接正反两条dna分子的pdk内含子（来自法国植物分子生物学研究所）两端通过pcr方法分别引入hindiii和ecorⅰ的限制性酶切位点，所用引物为：5’－aaaagcttccaatttggtaaggaaataatt－3
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（ seq id no:11），5’－aagaattctttcgaacccagcttccc－3
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（ seq id no:12）。
[0026]
将fsdg708i经ncoⅰ和ecorⅰ双酶切，pdk内含子经hindiii和ecorⅰ双酶切，rsdg708i经xbaⅰ和hindiii，连接入经ncoⅰ和xbai双酶切的phb载体（来自中科院上海植物生理研究所林鸿宣课题组赠）中，即得rna干扰载体phb－fsdg708i－pdk intron－rsdg708i（以下简写为phb-708ri）。
[0027]
三、sdg708过量表达载体和反义表达载体转化水稻植株参照hiei等（plant mol biol，1997，35：205－218）的方法转化水稻。将质粒puc1301-sdg708及phb-708ri通过电激法分别转入根瘤农杆菌eha105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒的农杆菌eh105接种到5ml含100mg/l卡那霉素的yeb液体培养基中28℃摇菌培养至对数生长期晚期，再1：100扩大培养到od600为0.5左右。将菌体重悬于转染培养基中。按常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至10cm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得t1代种子。为了进一步确定该转基因性状的稳定遗传，连续多次进行大田培育繁种，获得足够数量性状稳定的种子。
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实施例3. sdg708转基因植株渗透压胁迫表型的鉴定为了进一步验证sdg708在干旱胁迫应答反应中的功能，使用20% peg8000溶液造成短期渗透压胁迫，模拟真实干旱胁迫环境。首先将短日照下正常生长21天的水稻幼苗转移至含20% peg8000的营养液中模拟干旱环境，持续胁迫处理7天，直到出现明显枯萎表型为止，然后将所有水稻幼苗转移至正常培养液中恢复生长7天，比较peg胁迫下幼苗损伤情况。如图1所示，相对于野生型，突变体708ri-1和708ri-2在peg胁迫后均表现出更明显损伤，相反708oe-1和708oe-2两个过表达材料展现出更强的peg胁迫抗性。综合以上结果，我们认为在水稻中sdg708正向调控植株对peg胁迫的抗性。
[0029]
实施例4.sdg708转基因植株干旱胁迫表型的鉴定
为了更准确的还原植物真实干旱状态，本发明设计了水稻幼苗土壤干旱实验。将野生型wt、两个708ri突变体和两个708oe过表达水稻幼苗移栽到培养土中，短日照正常培养21天。之后断水开始土壤干旱处理，由于708ri和708oe过表达植株对水分缺失敏感性不同，为保证更好的效果，采取wt/708ri处理组断水10天，wt/708oe处理组断水12天的方法，待到所有受试材料均出现失水表型后，分别恢复供水7天，观察恢复后表型并统计不同材料的存活率。如图2所示，708ri两种突变体对于干旱胁迫更加敏感，而708oe两种过表达植株对干旱耐受力更高。这进一步说明，sdg708参与水稻干旱胁迫应答，并且能够显著增强水稻的土壤干旱胁迫抗性。
[0030]
实施例5.sdg708转基因植株的产量性状的鉴定为了鉴定各组水稻材料在不同条件下的产量性状，本发明将大田生长至分蘖前期的野生型、两个708ri突变体和两个708oe过表达水稻植株转移至温室塑料盆中继续培养。待所有植株均恢复正常状态后，开始对实验组进行断水处理，待到所有受试植株均出现明显缺水萎焉表型后，停止干旱处理并恢复供水，直到水稻成熟收获。对照组植株则一直保持充足供水直到水稻成熟收获。最后观察统计各组水稻材料的产量性状。结果如图3所示，正常生长条件下，相对于野生型，突变体708ri-1和708ri-2植株明显弱小，产量明显降低，相反708oe-1和708oe-2两个过表达材料植株更粗壮，并且拥有更高产量。
[0031]
实施例6.荧光定量pcr检测sdg708转基因植株中sdg708的表达选取同一批次种子，将野生型wt、两个708ri突变体和两个708oe过表达水稻幼苗培养在植物培养箱中，短日照下正常生长21天，之后将所有实验组幼苗转移至20% peg8000培养液中模拟干旱胁迫处理3小时，分别采集对照组与胁迫处理组样品。按实施例1中相同方法提取水稻总rna并且反转录合成cdna。然后用荧光定量pcr检测各组样品中sdg708的表达情况。检测sdg708所用引物为：5’－ aagccaatatgctgcgacaa－3
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（seq id no:13），5’－ ccaaaaggccccatcca－3
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（seq id no:14）。
[0032]
结果如图4所示，相对于野生型水稻，sdg708的表达在sdg708突变体708ri-1和708ri-2中呈现明显下降，相反sdg708表达量在过表达植株708oe-1和708oe-2均出现明显升高。这进一步证明过表达植株的增强干旱抗性以及改善产量性状是由sdg708的表达改变引起的。