基于人血管紧张素转化酶2的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2亲和多肽的制作方法

[0001]
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种基于人血管紧张素转化酶2 的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2亲和多肽。


背景技术：

[0002]
现有研究已发现，sras-cov-2病毒属于冠状病毒，其表面的刺 突(s)蛋白在病毒感染细胞的过程中发挥重要作用。s蛋白是一种寡 聚跨膜蛋白，包含s1和s2两个亚基。s1亚基中的受体结合结构域 (s_rbd)与人功能受体ace2(hace2-人血管紧张素转化酶2)结 合，进而触发s2亚基与宿主细胞膜的结合以进行融合。研究表明， sars-cov-2s_rbd与hace2的结合亲和力可达纳摩尔级，这种高 结合力可能是sras-cov-2极易在人群中传播的原因之一。
[0003][0004]
目前，已报道的sars-cov-2高亲和力特异性生物识别材料主要包括三 类：1、蛋白类，如sars-cov-2表面s蛋白抗体、hace2受体等，sars-cov-2 的特异性识别抗体制备技术较为成熟，应用较广；但是存在蛋白质类生物分 子分子量较大，无法化学合成，成本较高的弊端；2、适配体，如sars-cov-2 表面s蛋白适配体、sars-cov-2核衣壳蛋白的单链dna核酸适配体等，dna 或rna适配体虽然合成方便，性质相对稳定，但存在对sars-cov-2目标蛋 白的识别能力容易受到溶液基质的影响，在检测和治疗方面实际应用能力较 为有限的弊端；3、肽类，如由hace2部分氨基酸组成的多肽等。
[0005]
肽是指有2-50个氨基酸缩合形成的氨基酸链。与蛋白质相比，具有较短 氨基酸长度的肽链在保持相似化学结构的同时，具有更好的化学和构象稳定 性，特别是分子量在20kda以下的短肽，体积小、合成成本低、易于合成和 修饰，在病毒治疗以及sars-cov-2生物传感分析技术构建中展现出良好的 应用前景。
[0006]
如2004年，香港大学研究者设计了靶向sars-cov s蛋白变异位点的合 成肽，在细胞培养实验中具有较好的病毒抑制效果。2012年武汉大学发明了 一种病毒加帽系统多肽抑制剂，基于sars冠状病毒非结构蛋白之间的相互 作用设计了一种29肽和其截短的12肽，实现了对sars冠状病毒加帽修饰 功能的抑制。在针对sars-cov-2的特异性亲和多肽研究方面，hace2与 sars-cov-2 s蛋白rbd的分子相互作用，被认为是设计sars-cov-2亲和 多肽的关键。美国麻省理工大学截取hace2蛋白21-43号氨基酸合成的23 肽，在体外生物膜层干涉分析中与s_rbd具有较好的亲和力。但是，现有的 亲和多肽存在的弊端：
[0007]
1、无法覆盖hace2与sars-cov-2 s蛋白rbd的关键位点；
[0008]
2、现有的肽链长度限制了其使用范围。
[0009]
所以，亟需一种可以覆盖hace2与sars-cov-2 s蛋白rbd的关键位点 且肽链长度较短的亲和多肽。


技术实现要素：

[0010]
鉴于上述问题，本发明提供一种基于人血管紧张素转化酶2的严重急性 呼吸系统综合症冠状病毒2亲和多肽，所述亲和多肽具有覆盖hace2与 sars-cov-2 s蛋白rbd的关键位点，通过与sars-cov-2 s蛋白rbd的关 键位点结合，达到竞争阻止sars-cov-2病毒的细胞侵入的目的。
[0011]
为实现上述目的，本发明提供了一种基于人血管紧张素转化酶2的严重 急性呼吸系统综合症冠状病毒2亲和多肽，其基因序列为：
[0012]
1)seq id no.1所示的氨基酸序列；
[0013]
2)seq id no.1所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨 基得到的具有同等功能的由seq id no.1所示序列的衍生序列。
[0014]
进一步，优选的，其中所述2)中所示的衍生序列为：
[0015]
1)seq id no.2所示的氨基酸序列；
[0016]
2)seq id no.3所示的氨基酸序列；
[0017]
3)seq id no.4所示的氨基酸序列。
[0018]
本发明还提供一种上述亲和多肽在严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 利用生物检测法进行检测中的应用。
[0019]
其中，利用上述亲和多肽制备生物检测试剂的方法，包括如下步骤：
[0020]
(1)用-conh-(ch2)
7-cys修饰所述亲和多肽；其中，将多肽固相合 成法合成的亲和多肽的末端插入连接臂8-氨基辛酸和半胱氨酸-conh-(ch2) 7-cys；
[0021]
(2)将修饰后的亲和多肽与纳米金连接；其中，将30μl的350μm的修 饰后的亲和多肽与3.5ml的10nm aunp混合，旋转孵育24h；
[0022]
(3)4℃下16000g离心20min，用超纯水洗涤两次，重悬于4ml pbs 缓冲液中。
[0023]
进一步，优选的，亲和多肽的氨基酸序列为：seq id no.3所示的氨基酸 序列和seq id no.4所示的氨基酸序列。
[0024]
本发明还提供制备上述的亲和多肽的方法，上述亲和多肽通过人工直接 合成。
[0025]
本发明的有益效果如下：
[0026]
本发明提供的基于人血管紧张素转化酶2的严重急性呼吸系统综合症冠 状病毒2特异性识别亲和多肽，通过识别sars-cov-2病毒表面的s蛋白实 现对完整冠状病毒颗粒的有效识别，对于定量检测有感染活性的完整新冠病 毒颗粒具有实际应用价值。通过与hace2相同的结合位点与sars-cov-2s 蛋白结合，且与s_rbd特异性结合能力较强，因此可以通过竞争阻止人体细 胞hace2和sars-cov-2的相互作用，从而阻止新冠病毒的细胞侵入过程， 而对宿主本身不产生影响和副作用，因此在病毒抑制方面具有较好的应用前 景。
附图说明
[0027]
图1显示hace2和sars-cov-2s_rbd复合物共结晶的晶体结构。(a) s_rbd以绿色表示，hace2以蓝色表示。(b)hace2和sars-cov-2s_rbd 结合的关键氨基酸位点及对应序列。
[0028]
图2显示肽设计原理和技术流程。
[0029]
图3显示肽与sars-cov-2s_rbd分子对接结果。(a)对接得分。(b) 对接构象。
[0030]
图4显示肽与sars-cov-2s_rbd复合物分子动力学模拟结果。(a)均 方根偏差
(rmsd)；(b)使用mm/pbsa方法计算的结合能；(c)～(f) 肽par1，lib15-1，lib15-2，lib12-1与s_rbd形成的稳定构象。
[0031]
图5显示生物膜层干涉法测定的肽-s_rbd亲和力。其中，(a)为 par1-s_rbd；(b)为lib15-1-s_rbd；(c)为lib15-2-s_rbd；(d)为 lib12-1-s_rbd。
[0032]
图6显示基于亲和多肽lib15-1和lib15-2设计的sars-cov-2s_rbd快 速生物检测方法原理和检测结果。(a)检测原理、定量检测；(b)实时信号、 (c)线性拟合结果；(d)缓冲液和体液中的检测结果。
具体实施方式
[0033]
本发明将根据下列实施例进行更具体的说明。然而，本发明的保护范围 并不受限于下列的实施例。
[0034]
主要试剂来源如下：sars-cov-2 s_rbd-his重组蛋白(s_rbd)购自 义翘神州科技股份有限公司；修饰的肽[3'-(ch2)
7-conh-cys]购自吉尔生化 (上海)有限公司；aunp(直径：10
–
20nm)购自江苏先丰纳米科技有限 公司；磷酸盐缓冲液(pbs，含10mm磷酸钠和25mm nacl，ph 7.2)由购 自赛默飞世尔科技(上海)有限公司的buph packs和nacl制备；其他化学 品购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。所有溶液均使用美国康宁分 子级超纯无菌水制备。使用前，在超纯水中制备重组蛋白(0.25mg/ml)和 亲和肽(1mg/ml)的储备溶液，并储存在-80℃下。其他试剂均为进口和 国产分析纯试剂。
[0035]
实施例中，柔性对接、分子动力学模拟等常规计算机模拟手段参见：
[0036]
g.c.p van zundert，j.p.g.l.m.rodrigues，m.trellet，c.schmitz，p.l.kastritis， e.karaca，a.s.j.melquiond，m.van dijk，s.j.devriesanda.m.j.j.bonvin (2016).
[0037]
"the haddock2.2 webserver：user-friendlyintegrativemodeling of biomolecular complexes."j.mol.biol.，428，720-725(2015).p
á
ll s.，abraham m.j.，kutzner c.，hess b.，lindahl e.(2015)tackling exascale software challenges inmoleculardynamicssimulations with gromacs.in：markidis s.， laure e.(eds)solving software challenges for exascale.easc 2014.
[0038]
lecture notes in computer science，vol 8759.springer，cham.https： //doi.org/10.1007/978-3-319-15976-8_1。
[0039]
基于生物膜层干涉技术(bli)进行亲和多肽的性能评价等常规实验操作 步骤详见：
[0040]
bhagwat s，kumar a(2018)biolayer interferometry and its applications. j mole biol tech 2(1)：106。
[0041]
除此之外，作者还通过bli和elisa实验定量的分析ace2与s蛋白之 间的亲和力，bli结果表明，sars-cov-2-rbd与hace2结合的解离常数为 5.09nm，而对于sars-cov-rbd为1.46nm。
[0042]
实施例1基于hace2的sars-cov-2亲和多肽设计
[0043]
1、hace2和sars-cov-2s_rbd复合物关键作用位点的识别与重构
[0044]
以hace2和sars-cov-2s_rbd复合物共结晶的晶体结构为参考进行分 析以及多肽
抑制的原理。
[0045]
图1所示为显示hace2和sars-cov-2s_rbd复合物共结晶的晶体结构。 通过x射线晶体衍射分析测定hace2和sars-cov-2s_rbd复合物共结晶 的晶体结构。hace2和sars-cov-2两者通过蛋白表面相互作用，形成一个 复合体。如果清楚hace2和sars-cov-2两者结合面的具体信息，即可设计 特异的多肽竞争结合到sars-cov-2的表面，从而阻止hace2的结合，达到 抑制sars-cov-2的目的。
[0046]
图1(a)中s_rbd以绿色表示，hace2以蓝色表示。可以看出，hace2 的24-42，82-83，353-358号氨基酸残基距离s_rbd距离在衍射分辨率以 内，是形成hace2和sars-cov-2相互作用平面的主要氨基酸残基。
[0047]
图1(b)中，通过抽取结合位点的关键hace2氨基酸残基，分析其相 互距离关系；然后，将hace2蛋α3螺旋的关键氨基酸met82，α2螺旋的关 键氨基酸24-41，β发夹的关键氨基酸353-358等片段用-ggg-连接重构肽链， 即可设计特异的基于hace2的可结合到sars-cov-2表面的亲和多肽，从而 达到特异性识别sars-cov-2s_rbd的目的。基于此，通过序列设计构建三 十二肽母本链par1。
[0048]
2、截短肽库的设计和潜在亲和多肽的筛选
[0049]
根据设计得到的三十二肽母本链par1，考虑到短肽在合成便利性、结构 稳定性和生物检测适用性等方面的优势，进行短肽库的设计和潜在亲和多肽 的筛选。
[0050]
图2示出了显示肽设计原理和技术流程图。如图2所示，通过基于hace2 的肽库重建、基于蛋白质组的筛选、蛋白-肽柔性对接、分子动力学模拟的计 算模拟过程，进行潜在亲和多肽的筛选，并基于生物膜层干涉技术(bli)等 进行亲和多肽的性能评价。
[0051]
根据par1序列，从首位氨基酸开始，截取12肽或者15肽；然后以3或 4的步移长度后移，继续截取，共得到16条12肽和10条15肽。在基于全蛋 白质组的快速对接后，运用适用于柔性配体和柔性蛋白之间对接的对接软件 haddockserver完成柔性分子对接。对接打分是预测分子结合能力的重要指 标。
[0052]
对于初步筛选出的3条阶段肽作为潜在亲和多肽(lib15-1，lib15-2， lib12-1)。分子动力学模拟等常规计算机模拟手段参见：
[0053]
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ll s.，abraham m.j.，kutzner c.，hess b.，lindahl e.(2015) tackling exascale software challenges in molecular dynamics simulations withgromacs.in：markidis s.，laure e.(eds)solving software challenges forexascale.easc 2014.lecturenotes in computer science，vol8759.springer， cham.https：//doi.org/10.1007/978-3-319-15976-8_1。
[0054]
母本链par1和3条潜在亲和多肽的设计信息如表1所示：
[0055]
表1母本链par1和3条潜在亲和多肽的设计信息
[0056]
多肽名称氨基酸序列par1mygggqaktfldkfnheaedlfygggkgdfrilib15-1kfnheaedlfygggklib15-2heaedlfygggkgdflib12-1mygggqaktfld
[0057]
四条多肽均通过人工合成方式获得。
[0058]
图3示出了肽与sars-cov-2s_rbd分子对接结果。
[0059]
其中，图3(a)中，通过重构得到的三十二肽母本par1对接得分最低， 且3条潜在亲和多肽的对接打分均低于随机生成的十二肽和十五肽，说明肽 的重构和截短对于筛选sars-cov-2亲和多肽具有积极意义。
[0060]
图3(b)中示出了具体的分子对接构象，各多肽补充模拟hace2的位 置；可以看出，母本肽par1和3条潜在亲和多肽在分子对接中均保持了类似 s_rbd与hace2结合的构象，这使其结合能力得到了保证，说明了基于 hace2进行sars-cov-2亲和多肽设计的合理性。
[0061]
将筛选出的3条潜在亲和多肽(lib15-1，lib15-2，lib12-1)与s_rbd 的结合能力进行模拟和预测。
[0062]
为进一步解析潜在亲和多肽与s_rbd结合的分子作用机制，提高其结合 能预测的准确度，通过gromacs软件进行了进一步的10ns的分子动力学模拟。 均方根偏差(rmsd)被用来表征分子结构的波动程度。其中，分子动力学模 拟等常规计算机模拟手段参见：
[0063]
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[0064]
lecture notes in computer science，vol 8759.springer，cham. https://doi.org/10.1007/978-3-319-15976-8_1。
[0065]
图4示出了多肽与sars-cov-2s_rbd复合物分子动力学模拟结果，
[0066]
如图4(a)所示，在模拟结束之前，几种肽-蛋白复合物的结构波动均已 达到较小水平，结构基本稳定。
[0067]
如图4(b)所示，用mm/pbsa方法对最后1ns的复合物构象的结合能 (bindingenergy)进行计算，可以看出，潜在亲和多肽lib15-2，lib12-1的结 合能力远高于随机肽，说明其具有较强的s_rbd亲和能力。
[0068]
如图4(c)所示，对于分子动力学模拟最终构象的分析也可以看出，肽 与s_rbd直接的氢键数量和位置，是影响其结合能力的重要因素。
[0069]
3、生物膜层干涉法测定的肽-s_rbd亲和力
[0070]
对采用多肽固相合成法得到的合成肽，运用生物膜层干涉(bli)技术， 对合成的4条肽链(par1，lib15-1，lib15-2，lib12-1)与新冠病毒s_rbd 之间的亲和力进行测试，将4条肽链分别通过生物素化的方式固定到链霉亲 和素传感器界面上，测试的溶液条件为含有0.1％牛血清蛋白(bsa)，0.05％ 土温-20(tween-20)的10mmpbs缓冲液，使用包括结合-解离两过程的1:1 结合动力学模型进行参数拟合，亲和力测试结果如表2所示。
[0071]
表2生物膜层干涉法测定的肽-s_rbd亲和力常数
[0072]
[0073]
图5示出了生物膜层干涉法测定的肽-s_rbd亲和力。其中，图5(a) 为生物膜层干涉法测定的par1-s_rbd亲和力；图5(b)为生物膜层干涉法 测定的lib15-1-s_rbd亲和力；图5(c)为生物膜层干涉法测定的 lib15-2-s_rbd亲和力；图5(d)为生物膜层干涉法测定的lib12-1-s_rbd 亲和力。
[0074]
如表2和图5所示，母本肽par1和三条潜在亲和多肽(lib15-1，lib15-2， lib12-1)与s_rbd的平衡解离常数均达到10-8m级，说明其具有特异性识 别s_rbd的能力。
[0075]
实施例2基于亲和多肽设计的sars-cov-2s_rbd快速生物检测方法
[0076]
根据实施例1得到的sars-cov-2s_rbd亲和多肽，选择结合位点不重 合的亲和多肽lib15-2和lib12-1作为生物识别材料，设计用于 sars-cov-2s_rbd快速生物检测的方法。
[0077]
将亲和多肽lib15-2和lib12-1分别用-conh-(ch2)
7-cys修饰，将亲 和多肽lib15-2和lib12-1通过共键法修饰到纳米金(aunps)上，分别获得 两种功能化生物传感材料，aunps探针(肽-aunps)，将上述两种肽功能化的 修饰纳米金以1：1比例混合，形成生物检测试剂。具体的步骤包括：1)使 用多肽固相合成法合成多肽，并在末端插入连接臂8-氨基辛酸和半胱氨酸 (-conh-(ch2)
7-cys)，经液相色谱法检验，合成的多肽纯度为95％。2) 将30μl的350μm带有连接臂的亲和多肽与3.5ml的10nm纳米金混合， 并轻轻旋转孵育24h。3)然后以16，000g离心20分钟，用超纯水洗涤两次 以除去未结合的肽，重悬于4ml pbs缓冲液中。即获得了两种肽功能化的修 饰纳米金。
[0078]
然后，将lib15-2和lib12-1两种肽功能化的修饰纳米金以1：1比例混 合，即获得用于sars-cov-2s_rbd快速生物检测方法的生物检测试剂。
[0079]
对所建立的生物传感方法，测试其定量检测灵敏度、选择性和实际体液 样品的检测能力。
[0080]
图6示出了基于亲和多肽lib15-1和lib15-2设计的sars-cov-2s_rbd 快速生物检测方法原理和检测结果。其中，图6(a)示出了检测原理；图6 (b)示出了定量检测的实时信号；图6(c)示出了线性拟合结果；图6(d) 示出了缓冲液和体液中的检测结果。
[0081]
利用上述检测试剂进行检测的过程为：
[0082]
1)用pbs缓冲液(ph 7.2)稀释s_rbd的储备溶液来制备一系列s_rbd 标准溶液(0.1、1、10、20、50、80、100和200nm)。
[0083]
2)将各种浓度的12.5μls_rbd溶液依次添加到25μl肽-aunps(两种肽 功能化的修饰aunps的1：1混合物作为纳米粒子探针)中孵育(10分钟， 37℃)。
[0084]
3)将1.2μl125 mm mg2
+
溶液添加到溶液中，在37℃下再次孵育10 分钟。
[0085]
4)将35ul样品转移至384孔板中，室温(约25℃)下在400nm至 700nm的波长范围内进行吸光度测量，并选择532nm的吸光度(a532)作 为量化指标进行拉曼光谱分析。
[0086]
如图6b-d所示，基于亲和多肽lib15-1和lib15-2设计的 sars-cov-2s_rbd快速生物检测方法检测结果为：
[0087]
在pbs缓冲液体系中，随着s_rbd浓度的增加，溶液光谱发生明显变化， 532nm处的峰值下降并发生红移。相对应的，溶液颜色由红变蓝。s_rbd检 出限为0.1nm，线性检测区间为0.1-80nm，表明修饰后的亲和多肽的纳米金 比色传感器对s_rbd能够做到有效检测。
[0088]
进一步的，对亲和多肽在多种加标正常人体液(尿液、血清、唾液)中 的检测能力
进行了评价。如图6(d)所示，虽然由于蛋白浓度、盐浓度等的 差异，不同体液环境中s_rbd检测信号存在一定差异，但其对于两种不同浓 度的s_rbd(10nm，80nm)均有一定的响应能力，为实际样品中sars-cov-2 检测提供了新的方法。
[0089]
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、 细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注 明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验 用品，在本申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方 便地获得。
[0090]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式以及试验，对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域 技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这 些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0091]
[0092]
[0093]