柯式动弯杆菌特异性PCR快速检测试剂盒

柯式动弯杆菌特异性pcr快速检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测细菌性阴道病中的柯氏动弯杆菌感染的特异性pcr检测试剂盒。


背景技术：

2.细菌性阴道病(bacterial vaginosis,bv)是一种由厌氧菌异常增殖并替代阴道乳酸杆菌而引发的常见妇科疾病并伴随多种临床症状，它能引起盆腔炎、阴道出血及孕期早产、剖宫产后伤口感染、产后子宫内膜炎和术后感染等。目前细菌性阴道病主要的治疗策略是口服或阴道内使用甲硝唑等抗菌药来杀死阴道内非正常增殖菌，但是复发率很高。因此研究细菌性阴道病的发病机制，可以为临床开发更好的药物提供依据，具有较高的应用价值。
3.柯氏动弯杆菌(mobiluncus curtisii,m.curtisii)是一种革兰氏染色可变厌氧菌，国外的研究发现，细菌性阴道病患者中柯氏动弯杆菌的感染率高达65％-85％，并且证实了其存在与细菌性阴道病治疗后复发存在高度相关性。然而国内细菌性阴道病患者中柯氏动弯杆菌的相关数据很少。
4.调研发现，目前对于动弯杆菌感染的检测，临床上通常使用阴道拭子涂片的形态观察法来鉴定是否存在动弯杆菌感染。该方法依赖于检测人员的经验进行判断，存在一定的主观性，容易导致大量的漏检。而这样的情况很可能也导致了动弯杆菌长久以来在细菌性阴道病的诊断与治疗中得不到重视。因此需要一种客观的，更准确的检测动弯杆菌感染的方法及试剂。


技术实现要素：

5.鉴于以上现有检测手段的存在的问题，使用特异性引物pcr检测细菌性阴道病拭子中柯氏动弯杆菌的方法将比现有的涂片观察方法更为精准，提高人群中该致病菌感染的检出率，可以更好地研究细菌性阴道病的发病机制并且指导临床治疗预后。本发明人基于这样的构想而做出了本发明。
6.本发明提供了在细菌性阴道病中柯式动弯杆菌快速检测的pcr试剂盒，可提高细菌性阴道病中柯氏动弯杆菌的检出率，操作简便快捷，检测灵敏度高、检测范围广，为诊断柯氏动弯杆菌感染提供了可靠的检测手段。
7.本发明提供了根据柯式动弯杆菌atcc 35241特异性的基因序列(genbank:x82603.1碱基位置:14-149)设计的鉴定细菌性阴道病中柯式动弯杆菌是否存在的特异性引物，引物序列为：上游引物(如seq id no.1所示)，下游引物(如seq id no.2所示)
8.具体地，本发明包括以下内容。
9.1.人柯式动弯杆菌特异性pcr引物，其中所述pcr引物的序列为，
10.上游引物为seq id no.1所示的序列，和
11.下游引物为seq id no.2所示的序列。
12.2.检测人柯氏动弯杆菌的试剂盒，其包含项1所述的pcr引物。
13.3.项2所述的检测人柯氏动弯杆菌的试剂盒，其进一步包含pcr预混液，优选所述pcr预混液包含高纯度taq dna聚合酶,dntps,mg
2+
,反应缓冲液和稳定剂等成分。
14.4.项2或3所述的检测人柯氏动弯杆菌的试剂盒，其进一步包含作为阴性对照的ddh2o，作为阳性对照的柯式动弯杆菌的基因组或其核酸片段，其中，所述基因组或其核酸片段包含seq id no.5所示的序列。
15.5.上游引物为seq id no.1所示的序列，和下游引物为seq id no.2所示的序列在制备检测人临床样本中柯式动弯杆菌的试剂或试剂盒中的应用，当临床样本通过pcr扩增出136bp大小的特异性条带时，则判断所述临床样本中含有柯式动弯杆菌的感染。
16.6.项5所述的应用，其中所述pcr扩增的退火过程的条件为63℃退火20秒。
17.7.项1所述的特异性pcr引物，及项2～4中任一项所述的检测人柯氏动弯杆菌的试剂盒在检测人柯氏动弯杆菌感染中的应用。
18.优点：本发明的柯氏动弯杆菌pcr检测试剂盒通过利用针对柯氏动弯杆菌基因序列保守区间的特异性引物，能够实现对柯氏动弯杆菌pcr诊断。
19.在本发明的试剂盒中，可以包括作为阳性对照的柯式动弯杆菌的核酸片段，这样的核酸片段可以是柯式动弯杆菌的完整基因组，也可以是其基因组的一部分，只要能够被本发明的试剂盒中的引物扩增即可。
20.在本发明的试剂盒中，可以包括本领域通常应用的pcr缓冲液，常用的酶例如taq dna聚合酶等dna聚合酶，及构成反应体系的试剂例如但不限于dntps,mg
2+
，在使用其进行荧光定量pcr时，本发明的试剂盒可以适当包括或与荧光定量pcr所需要的试剂组合。
21.本发明的试剂盒也可以同时包括用于检测其他阴道致病原的引物，以用作针对同一样本的多致病原的检测，在这种情况下，所述检测其他阴道致病原的引物不应影响对柯式动弯杆菌的检测结果，包括不影响条带的位置和产生。
附图说明
22.图1为本发明的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，m为分子量标记marker；1-3为柯式动弯杆菌感染阳性样本组；4-6为柯式动弯杆菌感染阴性样本组；7为通用的细菌16s rrna的pcr体系阳性对照组；8为大肠杆菌pcr的引物特异性阴性对照组；9为ddh2o的pcr体系阴性对照组。
23.图2为本发明的阳性检出率的琼脂糖凝胶电泳图。其中，m为分子量标记marker；1-20为临床待检测样本。
具体实施方式
24.对本发明的具体的实施步骤进行详细的描述，以便对本发明的目的和优缺点更加的清楚明了。但本发明描述的实施步骤和适用内容不仅仅代表本发明全部的实施方式，所描述的实施方案并不在于限定本发明的应用。
25.实施例
26.实施例1：使用本发明的pcr引物能够检出患有细菌性阴道病的患者中的柯式动弯杆菌，
27.试验分组：
28.柯式动弯杆菌感染阳性样本组，样本编号1-3，使用引物(dw-f：seq id no.1所示的序列，dw-r：seq id no.2所示的序列，下文使用同样的简称)。
29.柯式动弯杆菌感染阴性样本组，样本编号4-6，使用引物(dw-f，dw-r)。
30.同时设立以下对照组：
31.引物特异性阴性对照组：以大肠杆菌rosetta
tm bl21(de3)菌株菌体作为模板，使用(dw-f，dw-r)。
32.pcr体系阳性对照组：扩增大肠杆菌rosetta
tm bl21(de3)的16s rrna作为模板，以阳性对照上游引物、阳性对照下游引物作为引物，为pcr体系正常工作的阳性对照；
33.pcr体系阴性对照组：以等体积的无菌水作为模板，为pcr反应体系的阴性对照。
34.具体的步骤如下：
35.本实施例中使用的临床样本拭子来自中国科学技术大学附属第一医院妇产科就诊的6名志愿者，其中，编号1，25岁为常规涂片法确认为动弯杆菌感染的阴道取样样本(以下也称为动弯杆菌感染阳性)；编号2，45岁，编号3，38岁为经常规涂片法无法确认为柯式动弯杆菌感染的阴道取样样本；编号4，27岁，编号5，42岁，编号6，33岁，为经医生诊断的健康女性的阴道取样样本(以下也称为柯式动弯杆菌感染阴性)。所有志愿者均签署了书面同意书，由妇产科医生使用棉签进行阴道采样，采样后的棉签用于提取步骤。
36.s1：临床样本拭子中细菌的基因组提取
37.将800μl的生理盐水加入干净的1.5ml的离心管中，将上述来自医院妇产科的待测临床样本拭子浸泡在生理盐水中，用手捏住棉签在其中洗刷至少20秒，贴离心管壁挤干拭子中的液体，使得细胞完全脱落至液体中，弃去棉签。
38.将以上液体12000rpm离心5分钟，弃去700μl的上清，将剩余的100μl液体充分震荡混匀。
39.之后在离心管中加入200μl的裂解液(百代生物51029)和20μl消化液(百代生物51029)，混匀后56℃加热10分钟。
40.加入500μl的析出液(百代生物51029)，充分颠倒混匀之后将液体转移至吸附柱之内，静置2分钟后，12000rpm离心1分钟并弃去废液。
41.将500μl的洗涤液(百代生物51029)加入到吸附柱之内，12000rpm离心1分钟后，弃去废液。
42.将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟后，弃去残余液体。
43.取出吸附柱放入新的1.5ml的离心管中，加入30μl的洗脱液(百代生物51029)后静置2分钟，12000rpm离心2分钟后收集dna溶液，得到30μl液体，并用于下一步的实验。
44.s2：柯式动弯杆菌特异性片段的pcr扩增
45.对于阳性样本组和阴性样本组，使用上述抽取出来的细菌基因组dna溶液作为pcr扩增的模板，利用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的特异性引物在taq pcr starmix with loading dye(genstar a012-100)帮助下进行了pcr的特异性产物的扩增。
46.对于pcr体系阳性对照组和引物特异性阴性对照组，直接使用了大肠杆菌的菌液(od：0.6)作为pcr模板。
47.本发明的实施例中使用的引物序列为：
48.dw-f：(如seq id no.1所示的序列)
49.dw-r：(如seq id no.2所示的序列)
50.阳性对照上游引物：(如seq id no.3所示的序列)
51.阳性对照下游引物：(如seq id no.4所示的序列)
52.具体的反应体系和反应条件为：
53.10μl 2x taq pcr starmix with loading dye(genstar a012-100)，
54.1μl的dw-f或阳性对照上游引物，
55.1μl的dw-r或阳性对照下游引物，
56.7.5μl的ddh2o
57.模板0.5μl，
58.总体积为20μl。
59.将配置好的pcr反应混合液混匀后，使用pcr扩增仪对其进行pcr扩增循环。
60.具体的循环条件如下：95℃4分钟，之后是95℃30秒，63℃30秒，72℃30秒，前面三步执行30个循环之后，72℃10分钟，最后为4℃10分钟。将pcr结束后的产物放在4℃储存。
61.s3：pcr产物的检测：
62.pcr反应结束后，使用移液器取出6μl的pcr产物，添加到1.5％的琼脂糖凝胶上样孔中，使用电压110v电泳30分钟。电泳结束后，对其进行紫外拍照。
63.扩增结果的电泳图如图1所示，其中，泳道1-3为柯式动弯杆菌感染阳性样本组；4-6为柯式动弯杆菌感染阴性样本组；7为pcr体系阳性对照组；8为引物特异性阴性对照组；9为pcr体系阴性对照组；m为dna的marker。
64.结果显示，在柯式动弯杆菌感染阳性的样品1-3中出现了大小约为136bp的清晰的、显著的条带；而在柯式动弯杆菌感染阴性的样品4-6中，使用了大肠杆菌pcr的阴性对照8，ddh2o的pcr阴性对照9中，在该位置均没有观察到清晰的条带。
65.因此，通过使用本发明的柯式动弯杆菌特异性pcr引物，当判断其在约136bp位置出现特异性条带时，可以判断为待测样品中具有柯式动弯杆菌的感染，反之则不具有柯式动弯杆菌的感染。
66.以上的实施结果表明，采用本发明的特异性的引物能够鉴定出柯式动弯杆菌的感染，特别是在细菌性阴道病中。
67.实施例2本发明的pcr法与常规涂片法的阳性检测率的比较
68.对怀疑具有柯式动弯杆菌感染的阴道取20例样本，分别采用本发明的pcr法与常规涂片法进行了检测，比较了两种方法的阳性检出率。
69.表1
[0070][0071]
本实施例中使用的临床样本拭子来自中国科学技术大学附属第一医院妇产科就诊的20名志愿者，对每个志愿者分别进行了本发明的pcr法和常规涂片法的柯式动弯杆菌感染检测，如图2所示。
[0072]
本发明的pcr法的检测步骤同实施例1，常规涂片法的步骤包括：
[0073]
1.取分泌物均匀涂于洁净载玻片上。
[0074]
2.玻片于火焰高处或自然干燥。将标本片迅速通过火焰三次，予以固定，得到标本片。
[0075]
3.将制好的标本片按下列步骤进行染色。各染液均为本领域通常使用的浓度。
[0076]
3.1滴加龙胆紫染液初染10秒，清水冲去染液。
[0077]
3.2滴加碘溶液媒染10秒，清水冲去染液。
[0078]
3.3加脱色液不时摇动约10秒，清水冲去。
[0079]
3.4加沙黄溶液复染10秒，之后清水冲去，待干，油镜镜检。
[0080]
油镜下观察细菌形态及判断标准：大的革兰阳性如乳酸杆菌；小的革兰染色不定
杆菌如加德纳菌和革兰阴性类杆菌；染色不定的弯曲杆菌如动弯杆菌等。
[0081]
结果显示，从表1可知，在这20名怀疑具有柯式动弯杆菌感染的志愿者中，本发明的pcr法检测到8个阳性(8/20)，常规涂片法检测到2个阳性(2/20)，即，pcr法检测到的阳性数高于常规涂片法3倍。由此可以知道，常规涂片法具有一定的漏检，本发明的pcr法的检出率(准确度)远高于常规涂片法，更加可靠。
[0082]
因此，可知利用本发明的pcr检测试剂盒的检测方法由于使用了pcr检测，因此比传统的基于柯氏动弯杆菌形态学观察的检出率更高，不依赖于临床医生、技师的主观判断，精准度更高。因此，在细菌性阴道病的诊断、治疗、预后评估中具有重要的实用性。并且可以期待其与其他pcr引物及荧光探针的联用，而实现与其他致病因素的同时检出，或者定量检测。
[0083]
最后，应当指出，上述的实例是本发明一个具有代表性的应用实例，其表述非常的具体且详细，但不代表对本发明应用领域的限制，在本发明的前提下，所作的任何修改、等同替换、改进等，都应属于本发明专利的保护范围。本发明的保护范围应该以权利保护书的内容为准。