高灵敏抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体及其应用

高灵敏抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体的制备方法及其在酶联免疫分析方法中的应用，适用于酸枣仁等果实种子类中药材的现场快速筛查，属于真菌毒素快速检测领域。


背景技术：

2.黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是一类二呋喃香豆素及其衍生化合物。黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1、m2等，其中afb1毒性最强，1993年已被世界卫生组织癌症研究机构划定为1a级致癌物。黄曲霉毒素不仅在食品、饲料等物质中广泛存在，在中药材种植、储藏、加工等过程中也存在污染风险。鉴于afb1的严重危害性，国内外相关组织对其制定了严格的限量标准。目前，欧盟(european union， eu)以及中国药典(chinese pharmacopoeia，ch.p)规定中药材中afb1不得过5μg
·
kg
‑1。
3.目前中药材中黄曲霉毒素的检测主要依赖于实验室仪器分析技术如hplc、uplc以及 lc
‑
ms/ms等，但由于前处理过程复杂、仪器设备昂贵等很难应用于现场检测。酶联免疫吸附法是以抗原抗体特异性结合和酶的高效催化显色反应为基础的一种免疫学检测技术，具有操作简单快捷、高灵敏度以及高通量等特点，在中药afb1快速检测中有良好的应用前景，但目前仍存在灵敏度、稳定性和重复性有待提高的问题。
4.本发明通过改进制备afb1完全抗原的方法，并结合优化免疫剂量以及考察多种免疫方式等制备afb1单克隆抗体，致力于提高抗体的灵敏度、专属性，尝试从源头突破elisa检测方法在中药afb1检测中的应用难题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是制备了一种高灵敏度的黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1，afb1)单克隆抗体并基于该抗体建立间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competition enzyme
‑
linkedimmunosorbent assay，ic
‑
elisa)，用于中药材中afb1污染的高通量、快速筛查，以保障中药用药安全性。该方法优点在于不需要昂贵的大型分析仪器，使用简便，通过阅读说明书，非专业人员即可进行操作，并且检测快速，大大增加了黄曲霉毒素b1检测的筛查效率和普及程度，具有广阔的开发前景。
6.本发明获得了能够产生特异性识别黄曲霉毒素b1单克隆抗体(mab)的小鼠杂交瘤细胞mabafb3f7，此细胞株已于2019年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.18523。此外，本发明通过合成包被抗原，建立了间接竞争elisa方法，可用于中药材中afb1高灵敏度及高通量的筛检。
7.技术解决方案
8.为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
9.1.抗黄曲霉毒素b1的杂交瘤细胞株，保藏编号为cgmcc no.18523。
10.2.抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体，有保藏号为cgmcc no.18523的杂交瘤细胞株所分
泌，所述单克隆抗体命名为afb3f7。
11.3.本发明所述的抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
12.(1)合成人工半抗原：
13.在黄曲霉毒素b1的结构上引入合适的连接臂，合成半抗原afb1
‑
oxime，见图1；
14.(2)人工抗原制备：
15.采用edc
‑
nhs活化酯法将半抗原分别偶联到载体蛋白牛血清蛋白bsa和卵清蛋白ova 上，分别得到免疫原afb1
‑
o
‑
bsa和包被原afb1
‑
o
‑
ova；
16.(3)小鼠免疫：
17.将制备好的afb1
‑
o
‑
bsa作为免疫原免疫六周龄balb/c雌鼠，每次每只小鼠腹腔及背部皮下给予100μg免疫原，每两周免疫一次，共免疫四次，小鼠眼眶取血，用间接elisa法检测血清效价及特异性；
18.(4)细胞融合：
19.通过效价及特异性测定，筛选出血清效价最高、特异性最好的免疫小鼠，细胞融合前三天腹腔注射100μg免疫原进行冲击免疫，取小鼠脾细胞，与对数生长期的sp2/0
‑
ag14细胞通过peg法进行融合制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养一周，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；
20.(5)杂交瘤细胞筛选：
21.用8000倍稀释的包被原afb1
‑
o
‑
ova包被酶标板，取杂交瘤细胞上清，采用非竞争 elisa法初步进行筛选，其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照，选取呈阳性的细胞孔，采用间接竞争elisa法进行进一步的确认，对黄曲霉毒素b1出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗黄曲霉毒素b1抗体的阳性杂交瘤细胞，阳性孔的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔的杂交瘤细胞送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.18523。将杂交瘤细胞株cgmcc no.18523给小鼠腹腔注射制备腹水，纯化后即为所制备的单克隆抗体。
附图说明：
22.①
图1为半抗原afb1‑
oxime的合成路线图
23.②
图2为半抗原afb1
‑
oxime的tlc鉴定图
24.③
图3为载体蛋白与人工抗原的紫外扫描图
25.④
图4为afb1单克隆抗体灵敏度测定结果图
26.⑤
图5为afb1单克隆抗体的亲和力测定结果图
27.⑥
图6为基质效应影响情况图
28.⑦
图7为基质匹配曲线图
具体实施方式：
29.通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。
30.实施例1：半抗原的制备
31.(1)半抗原afb1‑
oxime的合成
32.本发明通过改进的肟化法进行合成afb1‑
oxime：精密称取2mgafb1和4mg羧甲基羟氨半盐酸盐(cmo)溶解于2ml吡啶甲醇(v/v，1/3)混合溶液中，25℃避光于恒温振荡器反应24h。
33.取微量反应物进行tlc分析：展开剂为三氯甲烷
‑
丙酮(v/v，9/1)5ml，对照孔为afb1对照品，毛细管点样后放入层析缸中，展开20min后取出硅胶板于365nm波长紫外灯下观察，比较r
f
值。r
f
小于0.3为afb1肟化物，大于0.8为afb1，见图2。
34.将反应物用氮吹仪吹干后加入2ml超纯水，用0.2mol/l的硫酸调节ph值至4.0，最后采用4ml乙酸乙酯分3次萃取afb1肟化物，收集上层乙酸乙酯部分，氮吹浓缩液体制得 afb1‑
oxime。
35.实施例2：人工抗原的制备
36.(1)免疫抗原和包被抗原的制备
37.将上述制备得到的肟化物afb1‑
oxime均等分为两份，取其中一份溶解于0.6ml dmf
‑ꢀ
水(体积比6:9)中，加入13.8mg edc和0.448mg nhs，于恒温磁力搅拌器上25℃避光反应4h，再补加12.8mg的edc。加入一定量的磷酸盐缓冲液(0.01m pbs，ph 7.4)配置0.5％的bsa溶液，相同条件下继续反应24h。
38.取另一份afb1‑
oxime溶解于0.6mldmf
‑
水(体积比6:9)中，加入2mg edc和0.448 mgnhs，于恒温磁力搅拌器上25℃避光反应4h，再补加2mg的edc。加入一定量的磷酸盐缓冲液(0.01m pbs，ph 7.4)配置0.5％的ova溶液，相同条件下继续反应24h。
39.将两种反应产物分别离心后用0.01m pbs，ph 7.4于4℃透析72h，每12h更换透析液一次，制得免疫原afb1‑
o
‑
bsa和包被原afb1‑
o
‑
ova，
‑
20℃冰箱保存备用。
40.(2)人工抗原鉴定
41.对载体蛋白bsa、ova，免疫抗原和包被抗原进行紫外扫描测定(200～400nm)，免疫抗原和包被抗原与载体蛋白相比，吸收曲线有明显改变，说明人工抗原合成成功。
42.实施例3：动物免疫
43.分别取1mg/ml免疫原afb1‑
o
‑
bsa，afb
2a
‑
bsa和afb
2a
‑
ga
‑
bsa溶液(pbs)900μl 与等体积的完全弗氏佐剂乳化。然后腹腔和背部多点注射到六周龄雌性balb/c雌鼠。第一次免疫为弗氏完全佐剂，以后为不完全佐剂，融合前加强免疫不加佐剂注射100μl免疫原。第三次免疫后的7d到10d进行小鼠眼眶取血，进行效价检测。
44.实施例4：杂交瘤细胞的构建
45.取加强免疫过的小鼠脾细胞，与对数生长期的sp2/0
‑
ag14细胞通过peg法进行融合制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养一周，通过间接elisa法检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞。
46.实施例5：单克隆抗体的制备
47.(1)单克隆抗体的筛选
48.采用间接非竞争elisa法对融合孔上清进行筛选，取杂交瘤细胞的培养上清作为一抗，免疫小鼠的血清为阳性对照，骨髓瘤细胞上清为阴性对照，选取呈阳性的细胞孔，采用间接竞争elisa进行确认，具体方法如下：
49.1)包被：将包被抗原afb1‑
o
‑
ova用包被稀释液稀释至125ng/ml后，每孔100μl加入到 96孔酶标板中，4℃过夜；
50.2)加样品：洗涤液洗3次后，抑制孔加入浓度为50μlafb1(20ng/ml)标准品(一抗稀释液稀释)，空白孔每孔加入50μl样品稀释液；
51.3)加抗体：将50μl杂交瘤细胞培养液加至酶标板中，37℃孵育30min，洗板3次；
52.4)加酶标二抗：二抗稀释液将羊抗鼠酶标二抗igg
‑
hrp稀释成400ng/ml，每孔加100μl， 37℃孵育30min，洗板3次；
53.5)显色：每孔加入100μl新鲜配制的tmb显色液，避光反应15～20min；
54.6)终止：加入50μl 1m hcl终止反应；
55.7)测定：采用酶标仪在450nm处测定吸光值，抑制率(％)＝[(空白孔od值－抑制孔od 值)/空白孔od值]
×
100％。
[0056]
对黄曲霉毒素b1出现明显的竞争性抑制的孔即为产生抗afb1抗体的阳性孔，阳性孔的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆。阳性孔的杂交瘤细胞株afb3f7于2019年9月29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号cgmccno.18523。
[0057]
(2)单克隆抗体的大量制备及纯化
[0058]
balb/c雌鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.3ml/只)，10天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞株 cgmcc no.18523(约106个/只)，10天后采集腹水，用饱和硫酸铵法进行纯化，透析后冻干，于
‑
20℃保存。
[0059]
(3)单克隆抗体灵敏度的测定
[0060]
1)包被：将包被抗原afb1‑
o
‑
ova用包被稀释液稀释至31.25ng/ml后，每孔100μl加入到96孔酶标板中，4℃过夜；
[0061]
2)封闭：洗涤液洗板3次后甩干，每孔加入300μl封闭液，37℃孵育1h；
[0062]
3)加样品：洗涤液洗板3次后甩干，对照孔加入50μl一抗稀释液，实验孔每孔加入50μl 待测化合物溶液，其中，待测化合物溶液为afb1标准品溶液，分别用一抗稀释液稀释成浓度为16ng/ml、4ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.125ng/ml、0.063ng/ml、 0.031ng/ml、0.016ng/ml，每个浓度设置三个复孔；
[0063]
4)加抗体：用一抗稀释液将制备得到的单克隆抗体稀释成31.25ng/ml，每孔50μl加至酶标板中，37℃孵育1h，洗板3次；
[0064]
5)加酶标二抗：二抗稀释液将羊抗鼠酶标二抗igg
‑
hrp稀释成400ng/ml，每孔加100μl， 37℃孵育1h，洗板3次；
[0065]
6)显色：每孔加入100μl新鲜配制的tmb显色液，避光反应15～20min；
[0066]
7)终止：加入50μl 1m hcl终止反应；
[0067]
以待测化合物溶液浓度为横坐标，od/od0(od值表示实验孔的吸光值，od0表示对照孔的吸光值)为纵坐标，运用originpro9软件计算ic
50
值，结果见图4。结果显示灵敏度可达0.097μg/l，表明制备的单克隆抗体能较好地识别黄曲霉毒素b1。
[0068]
(4)单克隆抗体亚型鉴定
[0069]
小鼠杂交瘤细胞株cgmcc no.18523分泌的单克隆抗体采用单克隆抗体类型检测试剂盒 (购自sigma，产品编号为is02
‑
1kt)检测单克隆抗体的亚型，具体操作参见试剂盒说明书。结果显示，小鼠杂交瘤细胞株cgmcc no.18523分泌的单克隆抗体的免疫球蛋白亚
类为igg
2b
型。
[0070]
(5)单克隆抗体亲和力常数的测定
[0071]
以1mg/ml的afb1‑
o
‑
ova分别稀释64000倍和128000倍为包被抗原，采用间接elisa 法测定不同浓度抗体的吸光值。以吸光值为纵坐标，抗体浓度的负对数值为横坐标做回归曲线，确定50％吸光值的抗体浓度，计算抗体亲和力常数(ka＝n
‑
1/(2(nab1‑
ab2)),n＝ag2‑
ag1)，ag1和ag2为抗原浓度(mg
·
l
‑1)，ab1和ab2为对应抗体浓度(mg
·
l
‑1)。代入公式计算得亲和力常数k
a
为2.81
×
108l
·
mol
‑1，表明该单克隆抗体具有较高的亲和力。
[0072]
(6)单克隆抗体特异性的测定
[0073]
抗体特异性以交叉反应率来表征。以afb2、afg1、afg2、afm1、zen、don和niv 为竞争抗原，afb1为对照，采用间接竞争elisa法测定不同竞争抗原的ic
50
，并计算交叉反应率(cr％＝ic
50
(afb1)/ic
50
(竞争物)
×
100％)。结果显示，抗体与afb2和afm1的交叉反应率分别为35.07％和36.75％，与afg1和afg2的交叉反应率分别为8.75％和1.15％，与其他毒素类之间几乎不存在交叉反应，表明该抗体的特异性较好，可用于后续检测。
[0074]
实施例6：抗体的应用
[0075]
将杂交瘤细胞株分泌的黄曲霉毒素b1单克隆抗体用于检测中药材(以酸枣仁为模式对象)中afb1。
[0076]
(1)样品处理
[0077]
称取0.5g药材粉末，加入0.1g的nacl，并加入5ml的70％甲醇水溶液，涡旋1min 后，超声提取15min，10000r
·
min
‑1离心5min后取上清，加入样品稀释液后过0.22μm滤膜，备用。
[0078]
(2)基质效应的考察
[0079]
由于中药材基质具有复杂多样性，可能会干扰抗原抗体的结合，因此需考察中药材对 elisa检测的影响。将制备的空白基质提取液和样品稀释液分别配成一系列不同浓度(0， 0.016，0.063，0.125，0.25，0.5，4μg
·
l
‑1)的afb1加标溶液，以afb1对照品浓度的对数值为横坐标，b/b0为纵坐标绘制曲线进行比较，见图6，并计算基质因子(mf＝a
空白基质标准曲线
/a
空白溶剂标准曲线
)，一般认为0.8～1.2在可接受的范围内。通过计算，mf分别为0.87，0.81，0.98， 0.88，0.74，1.04，表明基质对afb1有一定的基质抑制作用。
[0080]
(3)elisa检测中药材黄曲霉毒素b1方法的建立
[0081]
为消除基质效应的影响，本发明选择基质匹配标准曲线进行样品测定。
[0082]
1)包被：将包被抗原afb1‑
o
‑
ova用包被稀释液稀释至31.25ng/ml后，每孔100μl加入到96孔酶标板中，4℃过夜；
[0083]
2)封闭：洗涤液洗板3次后甩干，每孔加入300μl封闭液，37℃孵育1h；
[0084]
3)加样品：洗涤液洗板3次后甩干，对照孔加入50μl空白基质提取液，实验孔每孔加入50 μl待测化合物溶液，其中，待测化合物溶液为afb1标准品溶液，分别用空白基质提取液稀释成浓度为16ng/ml、4ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.125ng/ml、0.063 ng/ml、0.031ng/ml、0.016ng/ml，每个浓度设置三个复孔；
[0085]
4)加抗体：用一抗稀释液将制备得到的单克隆抗体稀释成31.25ng/ml，每孔50μl加至酶标板中，37℃孵育1h，洗板3次；
[0086]
5)加酶标二抗：二抗稀释液将羊抗鼠酶标二抗igg
‑
hrp稀释成400ng/ml，每孔加
100μl， 37℃孵育1h，洗板3次；
[0087]
6)显色：每孔加入100μl新鲜配制的tmb显色液，避光反应15～20min；
[0088]
7)终止：加入50μl 1m hcl终止反应；
[0089]
以afb1对照品浓度的对数值为横坐标，od/od0(od值表示实验孔的吸光值，od0表示对照孔的吸光值)为纵坐标，绘制基质匹配标准曲线，见图7，结果表明，在0.051～0.580μg
·
l
‑1的范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝0.14678
‑
0.45212x，相关系数r为0.992。检测限 (limit ofdetection,lod)可达0.043μg
·
l
‑1。
[0090]
(4)加标回收率考察
[0091]
对酸枣仁样品的加标回收率进行考察，计算不同加标水平的回收率。该ic
‑
elisa法的回收率在88.79％～118.66％之间，rsd均小于10％，表明该方法回收率良好，可用于实际中药材样品的检测。
[0092]
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动任处于本发明的保护范围之内。