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[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于柱层析法分离目标双特异性抗体与副产物的方法。
背景技术：
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[0002]
双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。目前制备双特异性抗体的方法主要有化学偶联法，杂交-杂交瘤法，基因工程抗体制备法(最常用也最先进)。在制备过程中，双特异性抗体的重组生产通常伴随着由重链同源二聚体化、重链和轻链的错配、不同链的不平衡表达以及分子间的错误分配等导致的目标物中杂质的增加(副产物或聚集体)。这些副产物表现出与目标双抗的高度类似性，在纯化工艺中很难被去除。因此，如何纯化双特异性抗体成为制备高性能双特异性抗体的关键。
[0003]
专利cn201910525890.0公开了一种利用磁珠纯化提高双特异性抗体的纯度的方法，包括步骤：将经活化的proteina包被磁珠与待纯化的含双特异性抗体的上清液混合，孵育，待磁珠与双特异性抗体充分结合后，通过磁分离去除上清；先用平衡缓冲液清洗磁珠，清洗2～5次；再用水清洗磁珠；将得到的清洗后的磁珠用洗脱液进行洗脱，磁分离并收集洗脱液；分离后的磁珠再用洗脱液进行洗脱1～3次，合并洗脱液，得纯化后的双特异性抗体。专利cn201911376026.5公开了一种采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法，包括：将待纯化双特异性抗体样品依次经过层析柱1和层析柱2进行平衡、上样、清洗、洗脱等步骤完成分离纯化；所述层析柱1的层析填料选自capto l，protein l，kappaselect中的至少一种；所述层析柱2的层析填料选自lambdafabselect。由上述现有技术可知，目前对于纯化双特异性抗体通常是采用填料与副产物以及双特异性抗体不同的结合性能来讲二者分离开来；对于该技术操作较简单，但是要想得到高纯度高性能的双特异性抗体，该填料不仅需要与双特异性抗体具有良好的结合性，且易洗脱，不能影响双特异性抗体的活性。
技术实现要素：
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[0004]
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种基于柱层析法分离目标双特异性抗体与副产物的方法；该方法操作简单，成本低，得到的双特异性抗体纯度高。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0006]
一种基于柱层析法分离目标双特异性抗体与副产物的方法，包括以下步骤：
[0007]
(1)将plla常温条件下溶于三氯甲烷内，得到质量浓度为12-15％的溶解液置于模具内并加入冰晶片，搅拌混合处理，之后进行真空冷冻干燥处理，最后进行加热干燥，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0008]
(2)将纳米羟基磷灰石分散于去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将琼脂糖
和去离子水加热溶解制得琼脂糖溶液，滴加纳米羟基磷灰石分散液，最后加入上述制得的聚乳酸多孔凝胶，搅拌混合处理，最后降温凝胶化处理，干燥后制得柱层析填料；
[0009]
(3)将上述制得的柱层析填料装进层析柱内，首先采用pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用pbs缓冲液进行清洗；最后采用洗脱液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0010]
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述冰晶片的添加量为plla质量的5-10％。
[0011]
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述真空冷冻干燥的条件为：首先在-1～-5℃、0.01-0.04mpa的压力下处理1-2h，然后在-30～-40℃下处理10-20h。
[0012]
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述加热干燥的温度为35-45℃，所述加热干燥的时间为5-10h。
[0013]
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述纳米羟基磷灰石分散液的质量浓度为1-4％；所述琼脂糖溶液的主质量浓度为3-5％，所述纳米羟基磷灰石、所述琼脂糖、所述聚乳酸多孔凝胶的质量比为3：(1-2)：10。
[0014]
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述加热溶解的温度为95-100℃，加热溶解的时间为1-2h。
[0015]
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述搅拌混合处理的转速为800-1000rpm，温度为95-100℃，时间为60-100min。
[0016]
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述降温凝胶化处理的条件为：首先以5-8℃/min的速率降温至55-65℃，搅拌处理30-50min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理3-5h。
[0017]
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述pbs缓冲液的ph为7-7.5。
[0018]
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述洗脱液为0.35-0.55mol/l的甘氨酸溶液，其ph为2.5-3.5。
[0019]
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
[0020]
聚乳酸具有良好的生物相容性和可生物降解性能；本发明首先以冰晶片为致孔剂，通过调节冰晶片的添加量来控制制得的聚乳酸多孔凝胶的孔隙率；在制备聚乳酸多孔凝胶中，本发明首先制备plla溶液，然后将其加入到装有冰晶片的模具内，在具有一定压力的状态下，将plla溶液深入到多个冰晶片内进行预冷处理，然后继续进行冷冻干燥定型，最后加热干燥出去凝胶中的冰晶片，从而制得尺寸均匀、结构稳定性优异的聚乳酸多孔凝胶。为了改善聚乳酸多孔凝胶的亲水性和吸附能力，本发明将聚乳酸多孔凝胶置于琼脂糖溶液和纳米羟基磷灰石溶液的混合溶液内；琼脂糖溶液和纳米羟基磷灰石溶液渗入到聚乳酸多孔凝胶内，然后合理调节降温凝胶化条件以调节凝胶的强度，制得的琼脂糖网状结构将纳米羟基磷灰石包覆在聚乳酸多孔凝胶表面，不仅改善了聚乳酸多孔凝胶的亲水性，而且提高了聚乳酸多孔凝胶的吸附能力，改善了聚乳酸多孔凝胶的孔结构稳定性。
[0021]
本发明制得的柱层析填料具有良好的机械性能，孔隙率大且孔结构稳定，用于纯化双特异性抗体时，可有效捕获双特异性抗体，具有较高的置换速度，动态吸附能力和静态吸附能力强。本发明制得的纯化双特异性抗体的方法操作简单，对设备要求低，得到的双特异性抗体的纯度高。
具体实施方式：
[0022]
下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。
[0023]
下述实施例中的双特异性抗体以wuxibody双特异性抗体为例。
[0024]
实施例1
[0025]
(1)将12gplla常温条件下溶于100g三氯甲烷内，得到质量浓度为12％的溶解液置于模具内并加入0.15g冰晶片，搅拌混合处理，然后首先在-1℃、0.01mpa的压力下处理1h，然后在-30℃下处理10h；最后在35℃下干燥5h，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0026]
(2)将4g纳米羟基磷灰石分散于100ml去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将1.5g琼脂糖和50ml去离子水在100℃下加热溶解2h，制得琼脂糖溶液，滴加上述纳米羟基磷灰石分散液，最后加入10g上述制得的聚乳酸多孔凝胶，1000rpm、100℃的条件下搅拌混合处理100min，最后首先以8℃/min的速率降温至65℃，搅拌处理50min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理5h，干燥后制得柱层析填料；
[0027]
(3)将上述制得的柱层析填料装进直径为0.5cm、高度为15cm的层析柱内，首先采用ph为7.2的pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用ph为7.2的pbs缓冲液进行清洗；最后采用0.35mol/l、ph为2.5的甘氨酸溶液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0028]
实施例2
[0029]
(1)将15gplla常温条件下溶于100g三氯甲烷内，得到质量浓度为15％的溶解液置于模具内并加入0.15g冰晶片，搅拌混合处理，然后首先在-5℃、0.04mpa的压力下处理2h，然后在-40℃下处理20h；最后在45℃下干燥10h，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0030]
(2)将4g纳米羟基磷灰石分散于100ml去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将1.5g琼脂糖和50ml去离子水在100℃下加热溶解2h，制得琼脂糖溶液，滴加上述纳米羟基磷灰石分散液，最后加入10g上述制得的聚乳酸多孔凝胶，1000rpm、100℃的条件下搅拌混合处理100min，最后首先以8℃/min的速率降温至65℃，搅拌处理50min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理5h，干燥后制得柱层析填料；
[0031]
(3)将上述制得的柱层析填料装进直径为0.5cm、高度为15cm的层析柱内，首先采用ph为7.5的pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用ph为7.5的pbs缓冲液进行清洗；最后采用0.55mol/l、ph为3.5的甘氨酸溶液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0032]
实施例3
[0033]
(1)将13gplla常温条件下溶于100g三氯甲烷内，得到质量浓度为13％的溶解液置于模具内并加入0.15g冰晶片，搅拌混合处理，然后首先在-2℃、0.02mpa的压力下处理1h，然后在-35℃下处理12h；最后在40℃下干燥6h，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0034]
(2)将2g纳米羟基磷灰石分散于100ml去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将1.5g琼脂糖和50ml去离子水在95℃下加热溶解1h，制得琼脂糖溶液，滴加上述纳米羟基磷灰石分散液，最后加入10g上述制得的聚乳酸多孔凝胶，900pm、95℃的条件下搅拌混合处理70min，最后首先以6℃/min的速率降温至60℃，搅拌处理40min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理4h，干燥后制得柱层析填料；
[0035]
(3)将上述制得的柱层析填料装进直径为0.5cm、高度为15cm的层析柱内，首先采用ph为7.5的pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用ph为7的pbs缓冲液进行清洗；最后采用0.45mol/l、ph为3的甘氨酸溶液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0036]
实施例4
[0037]
(1)将14gplla常温条件下溶于100g三氯甲烷内，得到质量浓度为13％的溶解液置于模具内并加入0.15g冰晶片，搅拌混合处理，然后首先在-3℃、0.035mpa的压力下处理2h，然后在-35℃下处理15h；最后在40℃下干燥7h，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0038]
(2)将3g纳米羟基磷灰石分散于100ml去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将1.5g琼脂糖和50ml去离子水在100℃下加热溶解2h，制得琼脂糖溶液，滴加上述纳米羟基磷灰石分散液，最后加入10g上述制得的聚乳酸多孔凝胶，1000rpm、100℃的条件下搅拌混合处理80min，最后首先以7℃/min的速率降温至55℃，搅拌处理40min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理4h，干燥后制得柱层析填料；
[0039]
(3)将上述制得的柱层析填料装进直径为0.5cm、高度为15cm的层析柱内，首先采用ph为7的pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用ph为7.2的pbs缓冲液进行清洗；最后采用0.45mol/l、ph为3的甘氨酸溶液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0040]
实施例5
[0041]
(1)将14gplla常温条件下溶于100g三氯甲烷内，得到质量浓度为15％的溶解液置于模具内并加入0.15g冰晶片，搅拌混合处理，然后首先在-4℃、0.03mpa的压力下处理1h，然后在-40℃下处理15h；最后在40℃下干燥8h，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0042]
(2)将3.5g纳米羟基磷灰石分散于100ml去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将1.5g琼脂糖和50ml去离子水在95℃下加热溶解2h，制得琼脂糖溶液，滴加上述纳米羟基磷灰石分散液，最后加入10g上述制得的聚乳酸多孔凝胶，900rpm、95℃的条件下搅拌混合处理90min，最后首先以7℃/min的速率降温至60℃，搅拌处理45min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理4h，干燥后制得柱层析填料；
[0043]
(3)将上述制得的柱层析填料装进直径为0.5cm、高度为15cm的层析柱内，首先采用ph为7.3的pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用ph为7.2的pbs缓冲液进行清洗；最后采用0.4mol/l、ph为3.2的甘氨酸溶液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0044]
实施例6
[0045]
(1)将13.5gplla常温条件下溶于100g三氯甲烷内，得到质量浓度为14％的溶解液置于模具内并加入0.15g冰晶片，搅拌混合处理，然后首先在-4℃、0.02mpa的压力下处理2h，然后在-40℃下处理18h；最后在40℃下干燥8h，制得聚乳酸多孔凝胶；
[0046]
(2)将3.5g纳米羟基磷灰石分散于100ml去离子水中制得纳米羟基磷灰石分散液；将1.5g琼脂糖和50ml去离子水在100℃下加热溶解1h，制得琼脂糖溶液，滴加上述纳米羟基磷灰石分散液，最后加入10g上述制得的聚乳酸多孔凝胶，800rpm、100℃的条件下搅拌混合处理90min，最后首先以7.5℃/min的速率降温至60℃，搅拌处理40min，最后以1℃/min的降温速率降温至常温，搅拌处理4h，干燥后制得柱层析填料；
[0047]
(3)将上述制得的柱层析填料装进直径为0.5cm、高度为15cm的层析柱内，首先采用ph为7.5的pbs缓冲液对层析柱进行预平衡处理，然后将待纯化的双特异性抗体样品上样至层析柱内；然后采用ph为7.5的pbs缓冲液进行清洗；最后采用0.4mol/l、ph为3的甘氨酸溶液对层析柱进行洗脱，并收集洗脱液，制得纯化的双特异性抗体。
[0048]
对上述纯化的双特异性抗体的纯度和回收率进行测试，测试结果如下：
[0049]
表1
[0050] 回收率，％纯度，％实施例196.35＞99.9实施例297.03＞99.9实施例396.85＞99.9实施例497.05＞99.9实施例596.79＞99.9实施例697.02＞99.9
[0051]
从上述测试结果来看，本发明公开纯化双特异性抗体的方法制得的双特异性抗体纯度和回收率高。
[0052]
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本发明的许多其他形式和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。应理解所附权利要求和本发明通常涵盖本发明真实精神和范围内的所有这些明显的形式和改变。