一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法与流程

本发明涉及一种猴头菌发酵培养基的改进及发酵方法优化的技术，属于猴头菌发酵领域。

背景技术：

猴头菌又名猴头菇，刺猬菌，猴菇菌等，属担子菌亚门、红菇目、猴头菌科、猴头菌属，是著名的药食兼用真菌，享有“四大山珍”之美称。据记载，猴头菌性平味甘，有助消化、利五脏等功能。猴头菌含有多种糖类、萜类、酚类、甾体类等化学成分。药效学研究表明，猴头菌具有抗炎、抗溃疡、抗肿瘤、抗衰老、降低血糖等多种药理作用。野生猴头菌生长速度较慢，资源有限。人工栽培周期长，产量低，不适合工业化生产。深层液体发酵培养法可以在较短的时间内获得大量的猴头菌丝体及其发酵代谢产物。其优点为：质量可控、成本低，能够突破猴头菌生长的环境限制因素，提供充足的养料以供生物活性物质的积累。

猴头菌多糖目前主要发酵方法分为固体培养与液体培养，发酵得到猴头菌子实体和菌丝体，上海市农业科学院2017年申请专利cn107739230a中，固体发酵以玉米芯、棉籽壳、麸皮、米糠、大豆皮为主要原料，发酵时间20～26天；黑龙江省科学院微生物研究所2019年申请专利cn110074303a中，液体深层发酵以蔗糖为主要原料，发酵时间6～7天。猴头菌发酵普遍出现发酵时间长，发酵液浓稠、发酵罐浓缩现象严重的问题；同时发酵时间过长，还会出现菌粉多糖含量下降的现象。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法。本发明的技术方案是：

一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，包括种子罐培养和发酵罐培养，其中，所采用的种子培养基为豆粕1.3-2.0％、蛋白胨0.4-0.6％、葡萄糖2.8-3.2％、kh2po40.12-0.18％、mgso40.07-0.08％、消泡剂0.16-0.18％；发酵培养基为豆粕2.8-3.5％、葡萄糖0.8-1.2％、糖蜜2.8-3.2％、玉米淀粉1.8-2.2％、淀粉酶18-22mg/l、消泡剂0.1％，其中，种子培养基中豆粕为不去渣豆粕，发酵培养基中豆粕为去渣豆粕。

优选的所采用的种子培养基为豆粕1.4-1.7％、蛋白胨0.535％、葡萄糖3.03％、kh2po40.15％、mgso40.075％、消泡剂0.178％；发酵培养基为豆粕2.8-3.5％、葡萄糖1.0％、糖蜜3.0％、玉米淀粉2.0％、淀粉酶20mg/l、消泡剂0.1％。

所述不去渣豆粕，其制作方法为：首先，将水和浓硫酸按照5:1～4:1体积比例加入石墨反应釜中搅拌均匀，设定水和硫酸混合液的温度85～95℃；然后，第一次将20％反应釜体积的豆粕加入石墨反应釜，加热到95℃之后保持2个小时，第二次将5％反应釜体积的豆粕添加入石墨反应釜，加温到110～120℃并保持22h，形成豆粕水解液；再冷却降温至55～65℃完成豆粕水解，得到不去渣豆粕。该不去渣豆粕总氮含量为2.8-3％，氨氮含量为0.3-0.4％。

优选地，所述(2)种子罐培养基中豆粕为去渣豆粕，制作方法为将不去渣豆粕6000～8000rpm/min离心10～20min，取上清液为去渣豆粕。

所述种子罐及发酵罐在接菌前对罐体及培养基进行空消和实消，灭菌的方式为高压蒸汽在位灭菌。空消温度121℃，时间20min；实消温度121℃，时间25min。

本发明所述种子罐及发酵罐培养基中豆粕、蛋白胨、葡萄糖、kh2po4、mgso4、糖蜜、玉米淀粉均为食品级。

上述种子培养条件为ph4.3～5.5，温度25.6℃～26.3℃，种子培养时间为85～100h。

优选地上述种子培养条件为ph5.2，温度26.3℃，种子培养时间为95h。

所述的发酵培养条件为ph4.3～5.5，温度25.6℃～26.3℃，发酵培养时间为108～131h。

优选地发酵培养条件为ph5.2，温度26.3℃，发酵培养时间为108h。

种子罐选择10～30l，液体培养基灌装量为种子罐容积的65～85％，培养基一次性全部加入种子罐。

发酵罐选择30～100l，液体培养基装液量为发酵罐容积的70～80％。

猴头菌全营养流加半连续发酵的方法过程中，是将发酵培养基分为两部分，一部分作为初始培养基一次性添加到发酵罐，剩下一部分作为补充液从发酵开始流加，直至发酵结束；发酵培养基可以以任意比例分为初始培养基与补充液(流加液)，优选初始培养基成分与补充液体培养基成分比例为60-80:20-40。

发酵过程中每隔2-4h观察发酵液体积，将超出70～80％装液量的发酵液放出，以防发酵液过满而导致渗漏染菌以及供氧不足、搅拌困难等问题。

发明人在研发过程中发现发酵前期营养过多会造成营养中毒，产生高营养的抑制作用，且容易染杂菌，营养不易于利用，菌丝体生长缓慢，延长发酵周期，本发明合理分割一部分营养用于中后期发酵，发酵速度快，能缩短发酵周期30-50％，且菌体不会分裂，染杂菌，所得菌丝粗壮。特别是从镜检照片中可以明显见到该情况。

优选上述猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，具体步骤如下：

(1)种子罐培养：无菌条件下，将猴头菌斜面菌种打碎，接种于有种子液体培养基的发酵罐中，配制种子罐液体培养基：不去渣豆粕1.4-1.7％、蛋白胨0.535％、葡萄糖3.03％、kh2po40.15％、mgso40.075％、消泡剂0.178％组成，加水定容到种子罐体积的80％，制成种子液。培养条件：ph4.3～5.5，温度25.6℃～26.3℃，培养时间95h。

(2)发酵罐培养：接种1-2.5％的种子液到发酵罐，连续全营养流加补料培养，得到发酵液，配制发酵培养基：去渣豆粕3.0％、葡萄糖1.0％、糖蜜3.0％、玉米淀粉2.0％、淀粉酶20mg/l、消泡剂0.1％，加水定容到规定体积，制成发酵液。培养条件：ph4.3～5.5，温度25.6℃～26.3℃，培养时间108-131h。

所述步骤(2)中发酵罐培养的全营养半连续流加发酵方法为：

如在30l发酵罐中，发酵培养基总容积为24l，其中60％培养基成分作为初始培养基用水定容到20l一次性添加到30l发酵罐中，剩下40％培养基成分用水定容到4l作为补充液从发酵0h开始向发酵罐中流加，流加时间为108～131h，发酵全程流加。同时由于菌丝体及泡沫的生成，发酵液虚高，每隔2h观察罐内发酵液体积，将多余发酵液从取料口放出，始终维持发酵罐65～80％的装液量。

如在100l发酵罐中，发酵培养基总容积为80l，其中60％培养基成分作为初始培养基水定容到67l，一次性添加到100l发酵罐中，剩下40％培养基成分水定容到13l作为补充液从发酵0h开始向发酵罐中流加，发酵全程流加，得到发酵液；同时每隔2h观察罐内发酵液体积，将多余发酵液从取料口放出，始终维持发酵罐65～80％的装液量。

优选地，发酵罐培养的全营养半连续流加发酵方法中，一次性添加到发酵罐中初始培养基可为40～70％发酵培养基。

与现有技术比较本发明的有益效果：

1、本发明中种子培养基使用不去渣豆粕提高了猴头菌菌体生长速度，发酵培养基使用去渣豆粕促进了猴头菌液体培养过程中菌丝体的生成，同时提高菌丝的收率，猴头菌菌粉多糖含量高，多肽含量合格，培养基中其他成分均为严格实验筛选，最适菌体生长分裂、终产物合成的条件。

2、上述猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，有效解决猴头菌发酵中后期发酵时间长，发酵液浓稠、发酵罐浓缩现象严重的问题，同时缩短发酵时间，发酵108-131h，有效的避免了发酵131h后菌粉多糖含下降的问题。

附图说明

图1为本发明实施例1发酵中期得到的菌丝体的镜检图。

图2为本发明实施例1发酵中期得到的菌丝体的镜检图。

图3为传统一次性单罐发酵发酵中期的菌丝体镜检图。

图4为传统一次性单罐发酵发酵中期的菌丝体镜检图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明，本专利实验豆粕购自于长治市金泽生物工程有限公司。

实施例1

一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，具体步骤如下：

(1)种子罐培养：无菌条件下，将猴头菇(hericiumerinaceus)(菌株保藏号为cgmcc20754，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月29日)斜面菌种打碎，接种于种子液体培养基，种子罐液体培养基由不去渣豆粕1.42％、蛋白胨0.535％、葡萄糖3.03％、kh2po40.15％、mgso40.075％、消泡剂0.178％组成，加水制成种子液，装液量80％，ph为5.2，温度26.3℃，培养时间95h。

(2)发酵罐培养：接种1％的种子液到发酵罐，发酵培养基总容积为24l，其中60％培养基成分作为初始培养基定容到20l，一次性添加到30l发酵罐中，剩下40％培养基成分定容到4l作为补充液从发酵0h开始向发酵罐中流加，发酵全程流加，得到发酵液；同时每隔2h观察罐内发酵液体积，将多余发酵液从取料口放出，始终维持发酵罐80％的装液量。采用的发酵培养基为去渣豆粕3.0％、葡萄糖1.0％、糖蜜3.0％、玉米淀粉2.0％、淀粉酶20mg/l、消泡剂0.1％，加水到24l制成发酵液，ph为5.2，温度26.3℃，培养时间108h。

镜检发酵中期和后期菌丝体状态：猴头发酵菌丝粗壮、完整。见图1和图2。

对比传统一次性单罐发酵：一次性投料，温度26℃，转速150rpm，通气量1：0.5-1，单罐发酵时间150h，镜检所得菌丝体发酵后期见图3和图4，菌丝细小，活力较弱。

实施例2

(1)种子罐培养：无菌条件下，将猴头菌斜面菌种打碎，接种于有种子液体培养基的30l发酵罐中，种子罐液体培养基由不去渣豆粕1.42％、蛋白胨0.535％、葡萄糖3.03％、kh2po40.15％、mgso40.075％、消泡剂0.178％组成，加水到24l制成种子液，装液量80％，ph为5.2，温度26.3℃，培养时间95h。

(2)发酵罐培养：接种1％的种子液到发酵罐，发酵培养基总容积为80l，其中60％培养基成分作为初始培养基定容到67l，一次性添加到100l发酵罐中，剩下40％培养基成分定容到13l作为补充液从发酵0h开始向发酵罐中流加，发酵全程流加，得到发酵液；同时每隔2h观察罐内发酵液体积，将多余发酵液从取料口放出，始终维持发酵罐70％的装液量。采用的发酵培养基为去渣豆粕3.0％、葡萄糖1.0％、糖蜜3.0％、玉米淀粉2.0％、淀粉酶20mg/l、消泡剂0.1％，ph为5.2，温度26.3℃，培养时间108h。

实施例3

一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，参照实施例1，不同之处在于：(1)种子罐培养中种子培养基使用1.6％不去渣豆粕，ph为4.8，发酵温度26.0℃；(2)发酵罐培养中发酵培养基使用3.5％去渣豆粕，发酵培养基总容积为24l，其中70％成分作为初始培养基定容到20l，一次性添加到30l发酵罐中，剩下30％培养基成分定容到4l作为补充液，ph为4.8，发酵温度26.0℃，培养时间120h。

实施例4

一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，参照实施例1，不同之处在于：(1)种子罐培养中种子培养基使用2％不去渣豆粕，ph为5.0，发酵温度25.6℃；(2)发酵罐培养中发酵培养基使用4％去渣豆粕，发酵培养基总容积为24l，其中80％培养基成分作为初始培养基定容到20l，一次性添加到30l发酵罐中，剩下20％培养基成分定容到4l作为补充液，ph为5.0，发酵温度25.6℃，培养时间130h。

实施例5

一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，参照实施例2，不同之处在于：(1)种子罐培养中种子培养基使用2％不去渣豆粕，ph为5.0，发酵温度25.6℃；(2)发酵罐培养中发酵培养基使用4％去渣豆粕，发酵培养基总容积为80l，其中70％培养基成分作为初始培养基定容到67l，一次性添加到100l发酵罐中，剩下30％培养基成分定容到13l作为补充液，ph为5.0，发酵温度25.6℃，培养时间130h。

实施例6

一种猴头菌全营养流加半连续发酵的方法，参照实施例2，不同之处在于：(1)种子罐培养中，ph为5.0，发酵温度26.0℃；(2)发酵罐培养中发酵培养基使用4％去渣豆粕，发酵培养基总容积为80l，其中50％培养基成分作为初始培养基定容到67l，一次性添加到100l发酵罐中，剩下50％培养基成分定容到13l作为补充液，ph为5.0，发酵温度25.6℃，培养时间120h。

表1猴头菌发酵结果数据对比表

由表1可知，实施例2效果最好，在种子罐中，培养时间95h，猴头菌得率2.2％，菌粉多糖为2.77％，菌粉多肽为11.85％；在发酵罐中，培养时间108h，猴头菌得率1.5％，菌粉多糖为12.03％，菌粉多肽为9.53％.

上述实施例1-6不去渣豆粕，其制作方法为：将水和浓硫酸按照5:1～4:1体积比例加入石墨反应釜中搅拌均匀，设定水和硫酸混合液的温度85～95℃；然后，第一次将20％反应釜体积的豆粕加入石墨反应釜，加热到95℃并保持2小时之后，第二次将5％反应釜体积的豆粕添加入石墨反应釜，加温到110～120℃并保持22h，形成豆粕水解液；再冷却降温至55～65℃完成豆粕水解，得到不去渣豆粕。去渣豆粕的制作方法为将不去渣豆粕8000rpm/min离心10min，取上清液为去渣豆粕。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。