一种大菱鲆来源的副乳房链球菌及其应用的制作方法

本发明属于病原微生物筛选领域；尤其涉及一种大菱鲆来源的副乳房链球菌及其应用。
背景技术：
：鲆鲽类养殖成功推动了我国海水养殖第四次产业化浪潮的形成，是北方海水养殖的重要产业。大菱鲆是我国北方地区鲆鲽类养殖的最主要种类，自苗种繁育技术获得突破后，山东省养殖产量、养殖面积均具全国前列。近年来，随着养殖规模的扩大及种质资源的退化，大菱鲆病害频发，严重制约了海水养殖业的绿色健康发展。在大菱鲆病害中，细菌性疾病发生比较频繁，给养殖户造成了巨大经济损失。抗生素类药物的频繁使用不仅造成食品安全隐患，也使病原菌逐渐产生耐药性，防控难度增加。链球菌病是一种全球范围流行的主要细菌性疾病，在以色列、意大利、美国、日本、韩国等地水产养殖中均有报道。自1958年鱼类首次报道链球菌病在日本养殖虹鳟中爆发以来，众多养殖及野生鱼类发生该病的案例相继报道，链球菌病已成为危害范围广、感染种类多的严重疾病。副乳房链球菌隶属于链球菌科（streptococcaceae），链球菌属（streptococcus），是一种球状革兰氏阳性菌。最初认为副乳房链球菌是引起牛乳房炎的主要病原之一，1993年西班牙养殖大菱鲆爆发链球菌病，分离到该菌，由此将其认定为鱼类病原菌。目前副乳房链球菌被认为是引起鱼类链球菌病的主要病原菌，尤其是引起日韩养殖鱼类链球菌病的主要病原。在我国还未见由副乳房链球菌引起鱼类链球菌病的报道。疫苗的使用可提高鱼类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，且注射后无污染、无残留，是鱼类病害防控的主流研究方向。技术实现要素：本发明的目的是提供了一种大菱鲆来源的副乳房链球菌及其应用。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种大菱鲆来源的副乳房链球菌，所述副乳房链球菌为副乳房链球菌bh2-4（streptococcusparauberisbh2-4），其基因序列如seqidno.1所示，该菌株已于2020年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为cctccno:m2020451。本发明还涉及前述的大菱鲆来源的副乳房链球菌在制备疫苗中的应用，本发明还涉及前述的大菱鲆来源的副乳房链球菌能够用于制备灭活疫苗，其中所述疫苗为灭活疫苗。本发明具有以下优点：（1）本发明所提供的副乳房链球菌是从发病的大菱鲆中筛选获得的，该菌株是国内首次鱼源副乳房链球菌的报道，用于制备疫苗，从而对大菱鲆链球菌病的防治有效手段。（2）本发明还涉及前述的大菱鲆来源的副乳房链球菌能够用于制备灭活疫苗。附图说明图1为副乳房链球菌bh2-4菌株的23srdna（spa）、伴侣蛋白60（cpn60）、超氧化物歧化酶a（soda）基因片段pcr检测结果效果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。实施例1本实施例涉及副乳房链球菌的分离及其鉴定，所述副乳房链球菌为副乳房链球菌bh2-4株，其基因序列如seqidno.1所示，具体步骤如下：患病大菱鲆样品采集自山东烟台大菱鲆养殖场，个体质量195g至535g之间，平均体重458g。患病大菱鲆表现为食欲减退、体色发黑、游泳状态失衡、打转，具眼球突出、下颌及鳍条基部充血等特征，个别腹部肿胀、体表溃疡。剖检发现肝花斑状充血，脾肿大、颜色暗黑，个别腹腔腹水。取典型症状的濒死个体，无菌解剖内脏，取肝、肾、脾、脑、眼等组织，无菌水冲洗、研磨后于bhi琼脂平板划线，28℃倒置培养24-48h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养物。将分离获得的纯培养物在bhi平板上扩大培养，用0.9%的无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，采用比浊法将菌株浓度定为6.3×109cfu/ml，腹腔注射。选取与患病大菱鲆规格相近的健康大菱鲆作为实验用鱼，人工感染。实验用鱼暂养一周后，随机分为4组，其中3组注射0.1ml菌悬液，1组注射无菌生理盐水作为对照。养殖水温18±1℃，全天充气，日换水30%，每天观察记录死亡数量及发病症状。取发病个体再次分离病原菌。感染结果显示，菌株bh2-4表现出较强的致病力，可引起90%实验大菱鲆死亡，且死亡个体出现与患病大菱鲆一致的临床症状。证实菌株bh2-4是引起大菱鲆凸眼、红肿的病原，且在感染患病个体中可再次分离到该菌。应用mata（2004）、alber（2004）等人针对副乳房链球菌23srdna（spa）、伴侣蛋白60（cpn60）、超氧化物歧化酶a（soda）基因片段设计的特异性引物对菌株bh2-4进行扩增，分别得到片段大小为718、400、254bp的产物（图1，m为dna分子标准质量；1为副乳房链球菌soda基因特异性扩增结果（254bp）；2为spa基因特异性扩增结果（718bp）；3为cpn60基因特异性扩增结果（400bp）。结果表明，菌株bh2-4为副乳房链球菌。实施例2本实施例涉及使用副乳房链球菌制备灭活疫苗。具体步骤如下：将副乳房链球菌株bh2-4菌株接种到营养琼脂培养基（na）平板上，37℃培养24-48h进行复苏；挑取上述病原菌到nb培养基中，37℃震荡培养24h，收集培养液在4℃条件下5000rpm离心10min，将离心后的沉积菌体用ph=7.2的pbs缓冲液冲洗3遍后，用无菌生理盐水（含2%nacl）制成浓度为109cfu/ml的菌悬液原液；加入37%的福尔马林溶液至甲醛终浓度为0.2%，在37℃、140r/min条件下进行灭活，分别取灭活12h和24h的菌液进行灭活情况检测，观察灭活情况。将灭活的菌液在4℃条件下5000rpm离心10min，将离心后的沉积菌体用ph=7.2的pbs缓冲液冲洗3遍后，用无菌生理盐水（含2%nacl）制成浓度为109cfu/ml的灭活菌悬液；将副乳房链球菌株bh2-4灭活菌悬液、天蚕素抗菌肽（华北制药福分有限公司）、弗氏不完全佐剂（sigma公司）按照2:1:3的比例混合均匀，制成灭活疫苗；实施例3本实施例涉及疫苗的效果检测。具体步骤如下：按照步骤2制备疫苗的步骤，将副乳房链球菌株bh2-4作为抗原制备成疫苗。将灭活疫苗浓度调整至od600为0.1±0.01，腹腔注射免疫大菱鲆，每尾注射0.1ml，对照组注射同等剂量的无菌生理盐水。每组免疫20尾，设置3个重复、1个对照。养殖水温18±1℃，全天充气，日换水30%；免疫30天后用副乳房链球菌对其进行攻毒，每尾注射浓度为9.2×1010cfu/ml的菌液0.1ml；每天观察并记录各实验组死亡数量，计算灭活疫苗对副乳房链球菌的免疫保护率。结果表明，注射生理盐水组的鱼体在攻毒后第5天开始出现死亡，并在7-9天出现死亡高峰，攻毒后第10天死亡率达91.67%；攻毒后鱼体出现鳍条充血、眼球突出、下颌红肿、腹部膨大等典型症状，与自然感染发病鱼体表症状及剖解病变一致，并能从受感死亡个体再次分离到该菌。疫苗免疫组的死亡率显著低于对照组，免疫组死亡率仅为13.3%，其测试结果见表1，备灭活疫苗的免疫保护测试结果如表1所示：表1攻毒菌株免疫保护率bh2-452/60生理盐水对照组55/60注：表示存活数/攻毒总数由上述结果表明本发明所筛选获得链球菌株是副乳房链球菌，基于该菌株制备的灭活疫苗具有较高的免疫保护率，可为大菱鲆副乳房链球菌引起的疾病提供一定程度的免疫保护。针对现有技术的不足，本发明具有以下优点：本发明所提供的副乳房链球菌是从发病的大菱鲆中筛选获得的，该菌株是国内首次鱼源副乳房链球菌的报道，用于制备疫苗，从而对大菱鲆链球菌病的防治有效手段。本发明还涉及前述的大菱鲆来源的副乳房链球菌能够用于制备灭活疫苗。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。序列表<110>烟台市海洋经济研究院（烟台市海洋科学技术研究所、烟台市渔业技术推广站、烟台市水生动物疫病防控中心）<120>一种大菱鲆来源的副乳房链球菌及其应用<141>2020-08-31<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1448<212>dna<213>副乳房链球菌(bh2-4streptococcusparauberisbh2-4)<400>1ataggggggcctatactggcagtagaacgctgaagactggtgcttgcactagtcagatga60gttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctacctcatagcgggggataactattgga120aacgatagctaataccgcatgacaattaagtactcatgtactaaatttaaaaggagcaat180tgcttcactatgagatggacctgcgttgtattagctagttggtgaggtaacggctcacca240aggccacgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggc300ccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgggggcaaccctgaccga360gcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagagaagaac420ggtaatgggagtggaaaatccattacgtgacggtaactaaccagaaagggacggctaact480acgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtctcgagcgttgtccggatttattgggcgta540aagcgagcgcaggcggttatttaagtctgaagttaaaggccgtggctcaaccatggttcg600ctttggaaactggataacttgagtgcagaaggggagagtggaattccatgtgtagcggtg660aaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggtctgtaactga720cgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgt780aaacgatgagtgctaggtgttaggccctttccggggcttagtgccgcagctaacgcatta840agcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggccc900gcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtctt960gacatccctctgaccgtcctagagataggactttccttcgggacagaggtgacaggtggt1020gcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaac1080ccctattgttagttgccatcattaagttgggcactctagcgagactgccggtaataaacc1140ggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtg1200ctacaatggttggtacaacgagtcgcaagccggtgacggcaagctaatctcttaaagcca1260atctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcg1320cggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacca1380cgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctaataggagccagccgcctaaagg1440tgaataga1448当前第1页12