成像系统硬件的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月6日递交的临时专利申请号62/931,779的优先权。

这些申请的全部内容以引用的方式并入。

背景技术：

由于不同细胞内变化的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，受试者组织内的细胞在细胞形态和/或功能上具有差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞的相对于相邻细胞的位置或细胞的相对于组织微环境的位置)可以影响例如细胞的形态、分化、命运、活性、增殖、行为和与组织中的其它细胞的信号转导和交互作用。

先前已利用一些技术对空间异质性进行了研究，所述技术仅在接触完整组织或组织的一部分时提供针对少量分析物的数据的技术、或者提供针对单细胞的大量分析物数据，而未能提供有关单细胞在亲本生物学样品(例如组织样品)中的位置。

此外，关于空间分析物数据所使用的成像系统固有地在其分辨率和灵敏度上是可变的。这除了成像设备的布置结构、成像设备的各种类型之间的差异以及图像采集软件(的原因)之外，很大程度上还归结于针对成像系统部件的制造商的变化性。图像质量另外还受到由用户执行的图像采集的变动的影响。当试图对未知荧光强度的样品进行成像或由经验不同的用户对样品进行成像时，此问题将变得更加明显。

此外，在实验室环境中，使用各种处理方案来制备供分析用的样品。可以在试管中、在载玻片上或更一般地在由基板支撑的样品上执行这些方案。某些方案在稳定、受控的温度条件下执行，以确保样品和方案试剂的保真度。其它方案涉及温度循环及其它步骤，其中样品的温度以受控的方式被调节。为了在方案期间加热样品与其支撑基板，热循环仪、加热板或其它加热装置可被使用。作为一个示例，热循环仪可作为用于核酸扩增及转录和反转录分析序列中的聚合酶链反应方案的一部分。以热循环仪和其它加热装置对样品受控加热还可发生来促进对于例如限制性酶切消化和快速诊断的温度敏感性反应。

另外，生物样品可被置于固体支撑物上用于分析，以鉴定或特征化样品内的分析物(比如dna、rna或其它遗传物质)。印制的指南可有助于改善样品在固体支撑物上的置放。

技术实现要素：

用于评估成像设备和成像系统的质量和分辨率的对照载玻片、方法和系统可利用各种基板实现。如本文中所使用的，术语“基板”指的是具有表面的支撑物(例如玻璃载玻片、水凝胶、膜层、层、多孔膜、流动池、固体材料等)。在实施例中，基板是玻璃载玻片。

“基板”如本文中所使用的且当未加修饰语“化学”或“序列分析”时指的是具有至少一个表面的构件，所述表面通常用于为生物样品、分析物和/或本文中所描述的任何其它化学的和/或物理的部分、试剂和结构(比如列阵)提供物理支撑。基板可以由以下形成：各种固体材料、基于凝胶的材料、胶体材料、半固体材料(例如至少部分交联的材料)、完全固化或部分固化的材料、以及为提供物理支撑经过相变或相转变的材料。可用在本文中描述的方法和系统中的基板的示例包括但不限于载玻片(例如由各种玻璃形成的载玻片、由各种聚合物形成的载玻片)、水凝胶、层和/或膜层、膜(例如多孔膜)、流动池、比色皿、晶片、板。在一些实施例中，基板可以可选地包括功能元素，比如凹部、突出结构、微流体元件(例如通道、贮器、电极、阀、密封件)和各种标记，如将在以下进一步详细论述的。

本公开进一步描述了用于保持或支撑基板的装置。尤其，所描述的装置包括分别接收第一和第二基板的第一和第二构件。在一些实施例中，本公开的装置可用于将第一和第二基板夹叠(sandwich)在一起，以用于空间转录组学应用。在一些实施例中，第一基板可在它的表面上支撑样品(例如，生物基质)。在一些实施例中，第二基板可包括多个条形码探针和/或透化试剂。

所描述的用于保持或支撑基板的装置还包括对正机构，所述对正机构连接到所述构件中的至少一者并使第一构件和第二构件对正。因此，本公开的装置可以有利地使第一基板和第二基板以及可处在第一和第二基板的表面上的任何样品、条形码探针或透化试剂对正。也即，本公开的装置可通过使第一和第二基板以对正的方式彼此接触来促进对样品(例如，生物样品)的分析。在空间转录组学应用中，第一和第二基板的对正是关键的，因为会需要样品(例如，生物样品)与基板的条形码区域对正。

当前在空间转录组学测定中使生物样品与条形码区域对正的方法涉及用户将生物样品仔细地置放到包括多个条形码探针的基板上。因此，在一些实施例中，所描述的装置的优点在于，为用户提供了使样品与条形码区域对正的对正工具。本公开的装置可减少测定期间的用户差错，从而还降低了样品分析成本。在一些实施例中，本公开的装置的另一优点在于，减少了在对正生物样品和基板的条形码化区域时可由用户差错引起的像差或成像瑕疵的数量。在一些实施例中，本公开的装置允许针对感兴趣区域预筛选样品。在一些实施例中，本公开的装置允许检查存档样品。

在一个方面中，本公开涉及一种样品保持器，所述样品保持器包括：第一构件，第一构件包括第一保持机构，第一保持机构配置为保持包括样品的第一基板；第二构件，第二构件包括第二保持机构，第二保持机构配置为保持包括试剂介质的第二基板；以及对正机构，对正机构连接到第一和第二构件中的一者或两者，并配置为对正第一和第二构件使得在第一和第二构件对正时样品接触试剂介质的至少一部分。

在一些实施例中，对正机构包括连接到第一和第二构件的旋转致动器。在一些实施例中，对正机构包括位于第一和第二构件中的一者或两者上的一个或多个连接器以及位于第一和第二构件中的一者或两者上的一个或多个接收器，其中所述一个或多个接收器定位成与所述一个或多个连接器接合。在一些实施例中，旋转致动器包括铰链。在一些实施例中，旋转致动器包括折叠构件。在一些实施例中，旋转致动器包括至少一个臂。在一些实施例中，第一保持机构包括尺寸设计为接收第一基板的凹部。在一些实施例中，样品保持器还包括垫片，所述垫片定位在凹部内并配置为维持凹部与第一基板之间的过盈配合。在一些实施例中，第一保持机构包括配置为向第一基板施加力来维持第一基板与第一构件之间接触的一个或多个构件。

在一些实施例中，第二保持机构包括尺寸设计为接收第二基板的凹部。在一些实施例中，第二保持机构包括配置为向第二基板施加力来维持第二基板与第二构件之间接触的一个或多个构件。在一些实施方案中，试剂介质包括以下中的至少一种：包含透化试剂的溶液、固体透化试剂、以及包含透化试剂的水凝胶化合物。在一些实施例中，第一构件包括孔口，所述孔口定位成使得在第一基板被保持时该孔口与第一基板的样品区域对正。在一些实施例中，第二构件包括至少一个孔口，所述至少一个孔口定位成使得在第一基板被保持并且第一和第二构件通过对正机构被对正时该至少一个孔口中的孔口与第一基板的样品区域的至少一部分对正。

在一些实施例中，样品保持器还包括试剂井，试剂井通过所述至少一个孔口的一个或多个边界表面且通过第二基板的后表面形成，其中，添加到试剂井的试剂溶液通过所述边界表面被容纳并渗透通过第二基板的后表面。在一些实施例中，第二基板的后表面与第二基板的面向在第一基板上的样品的前表面相反。在一些实施例中，样品保持器还包括第一调节机构，第一调节机构连接到第一构件并配置为使第一基板在与第一基板的支撑样品的表面平行的至少一个方向上平移。在一些实施例中，对正机构配置为在第一和第二基板对正时维持第一和第二基板之间的分隔。在一些实施例中，对正机构配置为维持所述分隔使得第一基板上的样品的至少一部分接触第二基板上的试剂介质的至少一部分。在一些实施例中，在与第一基板的支撑样品的表面正交的方向上测量，第一基板和第二基板之间的分隔在50微米与1mm之间。在一些实施例中，在与第一基板的支撑样品的表面正交的方向上测量，第一基板和第二基板之间的分隔在2.5微米与25微米之间。

在一些实施例中，第一基板和第二基板之间的分隔在50微米与500微米之间。在一些实施例中，对正机构配置为在第一和第二基板对正时维持第一和第二基板大致平行使得第一和第二基板之间的角度为两度或更小。在一些实施例中，所述角度是0.5度或更小。在一些实施例中，样品保持器还包括连接到第一和第二构件中的一者或两者的一个或多个间隔构件，所述一个或多个间隔构件定位成使得当第一和第二基板对正时所述一个或多个间隔构件处在第一和第二构件之间。在一些实施例中，样品保持器还包括第二调节机构，所述第二调节机构配置为在与第一基板的支撑样品的表面正交的方向上调节所述分隔的距离。在一些实施例中，第二调节机构是对正机构的组成部分。在一些实施例中，第二调节机构连接到第一和第二构件中的一者或两者。

在另一方面中，本公开涉及一种样品保持器。该样品保持器包括第一构件，该第一构件包括第一保持机构，第一保持机构配置为保持包括样品的第一基板。样品保持器还包括第二构件，该第二构件包括第二保持机构，第二保持机构配置为保持包括列阵的第二基板。样品保持器还包括对正机构，该对正机构连接到第一和第二构件中的一者或两者。对正机构配置为对正第一和第二构件使得当第一和第二构件对正时样品的至少一部分与列阵的至少一部分竖直对正。

在一些实施例中，样品包括呈空间布置结构的分析物。在一些实施例中，样品保持器还包括连接至第一和第二构件中的一者或两者的一个或多个间隔构件，所述一个或多个间隔构件定位成使得当第一和第二基板对正时，一个或多个间隔构件处在第一和第二构件之间和/或处在第一和第二基板之间且配置为提供第一基板和第二基板之间的最小的间隔。在一些实施例中，第一构件还包括第二第一保持机构，该第二第一保持机构配置为保持包括第二样品的第二第一基板。在一些实施例中，对正机构还配置为对正第一和第二构件使得当第一和第二构件对正时第二样品与第二基板的第二列阵的至少一部分竖直对正。在一些实施例中，当第一和第二构件对正时，第一基板、第二基板和一个或多个间隔构件形成腔室。在一些实施例中，第二构件包括至少一个孔口，所述至少一个孔口定位成使得在第一基板被保持并且第一和第二构件通过对正机构被对正时，所述至少一个孔口中的孔口与第一基板的样品区域的至少一部分和/或至少所述部分所述列阵对正。

在一些实施例中，样品保持器还包括试剂井，试剂井通过所述至少一个孔口的一个或多个边界表面且通过第二构件的后表面形成。在一些实施例中，添加到试剂井的试剂溶液通过所述边界表面被容纳并在第一和第二构件对正时从所述试剂井行进为接触样品。在一些实施例中，试剂井包括配置为接收试剂溶液的端口。在一些实施例中，端口包括单向阀。在一些实施例中，第一构件包括至少一个第一孔口，所述至少一个第一孔口定位成使得在第一基板被保持并且第一和第二构件通过对正机构被对正时，所述至少一个第一孔口中的第一孔口与第一基板的样品区域的至少一部分和/或至少所述部分所述列阵对正。在一些实施例中，样品保持器还包括第一试剂井，第一试剂井通过所述至少一个第一孔口的一个或多个边界表面并通过第一构件的表面形成，其中，添加到第一试剂井的试剂溶液通过所述边界表面被容纳并在第一和第二构件对正时从第一试剂井行进为接触样品。在一些实施例中，第一试剂井包括配置为接收试剂溶液的端口。

在一些实施例中，第二构件包括所述至少一个孔口中的第二孔口。第二孔口可配置为使试剂溶液从第二构件移迁。在一些实施例中，一个或多个间隔构件包括联接到第一构件和/或第一基板的第一间隔构件和联接到第二构件和/或第二基板的第二间隔构件。在一些实施例中，第一间隔构件包括大于第二间隔构件的厚度。在一些实施例中，当第一和第二构件对正时，第一基板、第二基板、第一间隔构件和第二间隔构件形成腔室。在一些实施例中，所述腔室包括流动池。在一些实施例中，第二构件包括可移迁部分，所述可移迁部分包括第二基板。在一些实施例中，第一基板包括组织学载玻片。在一些实施例中，第二基板包括包含列阵的载玻片。在一些实施例中，样品保持器还包括所述第一基板和第二第一基板。

在另一方面中，本公开涉及一种系统。该系统包括如前述实施例中任一项所述的样品保持器和热循环仪。

在另一方面中，本公开涉及一种用于空间分析的生物样品的制备方法。方法包括提供样品保持器。所述样品保持器包括第一构件，所述第一构件包括第一保持机构，第一保持机构配置为保持包括生物样品的第一基板。样品保持器还包括第二构件，第二构件包括第二保持机构，第二保持机构配置为保持包括列阵的第二基板。样品保持器还包括对正机构，对正机构连接到第一和第二部件中的一者或两者，并配置为对正第一和第二构件使得在第一和第二构件对正时样品与列阵的至少一部分竖直对正。方法还包括将包括生物样品的第一基板定位在第一构件的第一保持机构中。方法还包括：经由对正机构，手动对正第一和第二构件使得当第一和第二构件对正时样品的至少一部分与列阵的至少一部分竖直对正。方法还包括将分析物从样品的竖直对正部分迁移到列阵的所述部分。

在一些实施例中，定位第一基板包括将第一基板定位在第一保持机构中使得生物样品与在第一保持机构的表面上的列阵区域指示部对正。在一些实施例中，定位第一基板包括在第一构件相对于第二构件处在打开位置中时将第一基板定位在第一保持机构中，并且其中，第一和第二构件的手动对正包括使第一构件附在第二构件闭合。在一些实施例中，迁移分析物包括使分析物通过与生物样品的对正部分及列阵接触的试剂介质迁移。在一些实施例中，方法还包括：响应于手动对正，通过第二构件中的端口将试剂介质添加到样品保持器。在一些实施例中，方法还包括：在手动对正之前，将试剂介质添加到第二基板的表面。在一些实施例中，方法还包括将样品保持器引入在热循环仪中以在迁移过程中促进捕获分析物。在一些实施例中，方法还包括将第二基板定位在第二保持机构中。

所有可在互联网上获得且在本说明书中提到的出版物、专利、专利申请和信息都以引用的方式并入本文中，就好像每件个体出版物、专利、专利申请或信息项被专门且单独地指示为通过引用并入。在通过引用方式并入的出版物、专利、专利申请和信息项与说明书中包含的公开内容矛盾的情况下，说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

在以范围来描述值的情况下，应该理解的是，说明书包括对在这类范围内的所有可行子范围及落入此类范围内的特定数值的公开，无论特定数值或特定子范围是否被明确陈述。

术语“每个”当在对项目集合的引用中被用到时旨在标识集合中的个体项，但不一定指的是集合中的每项，除非另外明确说明，或者除非使用语境明确表示相反。

本文中描述了本公开的特征的各种实施例。然而，应当理解，这类实施例仅以示例的方式被提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。还应当理解，本文中所描述的具体实施方案的各种替代方案也在本公开的范围内。

附图说明

以下附图图示出本公开的特征和优点的某些实施例。这些实施例无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中相似的附图标记指示相似的元件。

图1示出了根据一些示例实施方式的示例性空间分析工作流程。

图2绘示根据一些示例实施方式的用于在载玻片上制备生物样品的示例工作流程。

图3是示意图，绘示了根据一些示例实施方式的在呈夹叠构型的组织载玻片和基因表达载玻片之间的示例性透化溶液相互作用。

图4是示意图，示出了根据一些示例实施方式的在第一基板上安装的样品和在第二基板上设置的特征列阵。

图5a是根据一些示例实施方式的样品保持器的示例的示意性俯视图。

图5b-5f是根据一些示例实施方式的样品保持器的示例的示意性侧视图。

图6是根据一些示例实施方式的样品保持器的示例的示意性侧视图。

图7示出根据一些示例实施方式的使用示例样品保持器的示例分析工作流程。

图8示出根据一些示例实施方式的使用具有折叠构件的示例样品保持器的示例分析工作流程。

图9示出根据一些示例实施方式的使用形成流动池的示例样品保持器的示例分析工作流程。

图10a绘示根据一些示例实施方式的预加载有第二基板和间隔构件的示例第二构件。

图10b绘示根据一些示例实施方式的图10a的第二构件、第二基板和间隔构件的分解图。

图11a、图11b绘示用于将第一基板加载到示例样品保持器中的示例工作流程。

图12a-12c示出根据一些示例实施方式的处于打开和闭合构型的示例样品保持器的不同视图。

图13a-13c示出根据一些示例实施方式的将试剂溶液添加到示例样品保持器的示例工作流程。

图14a和图14b示出根据一些示例实施方式的具有盖的示例第二构件的底部立体图。

图15a绘示根据一些示例实施方式的、带有处于闭合构型的盖的图14b的第二构件的立体图。

图15b绘示根据一些示例实施方式的具有可移迁部分的第二构件的分解图。

图16绘示根据一些示例实施方式的具有处于打开构型的盖的第二构件的分解图。

相似的附图标记在各个附图中指示相似的元件。

具体实施方式

i.引言

本公开描述了用于生物样品的空间分析的设备、系统、方法和组合物。本章节描述了在本公开的后续章节中提及的某些通用术语、分析物、样品类型和制备步骤。

本公开描述了用于生物样品空间分析的设备、系统、方法和组合物。本章节描述了本公开后续章节中提及的某些通用术语、分析物、样品类型和制备步骤。例如，术语和短语：空间分析，条形码，核酸，核苷酸，探针，靶标，寡核苷酸，多核苷酸，受试者，基因组，衔接子，衔接物，标记，杂交的，杂交，重组的，重组，引物，引物延伸，邻位连接，核酸牵引，聚合酶链反应(pcr)扩增，抗体，亲和基团，标签，可检测标签，光学标签，模板转换寡核苷酸，夹板寡核苷酸，分析物，生物样品，基于空间列阵的通用分析方法，空间分析方法，免疫组织化学和免疫荧光，捕获探针，基板，列阵，分析物捕获，隔断，对被捕获分析物的分析，和/或质量控制等，这些在pct专利申请公开号wo2020/123320中进行了更详细的描述，该pct专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

(a)空间分析

可以从任何来源获得组织和细胞。例如，组织和细胞可获自单细胞或多细胞有机体(例如哺乳动物)。从哺乳动物(例如人类)获得的组织和细胞通常具有变化的分析物水平(例如基因和/或蛋白质表达)，这可导致细胞形态和/或功能的差异。细胞在组织内的位置会影响例如细胞的命运、行为、形态和与组织中其它细胞的信号转导及交互作用。有关哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平(基因和/或蛋白质表达)差异的信息还可帮助医生基于检测到的组织中不同细胞内分析物水平的差异来选择或给予在单细胞或多细胞有机体(例如哺乳动物)中有效的治疗。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异还可提供有关组织(例如，健康的和患病的组织)如何起作用和/或发展的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异还可提供有关组织中疾病发病机理的不同机制以及治疗措施在组织内的作用机制的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异还可提供有关耐药机制及其在哺乳动物组织中的发展的信息。多细胞有机体(例如哺乳动物)组织中不同细胞内分析物存在或不存在上的差异可提供有关耐药机制及其在多细胞有机体组织中的发展的信息。

本文中的空间分析方法学提供用于哺乳动物组织中不同细胞内或来自哺乳动物的单个细胞内的分析物水平(例如基因和/或蛋白质表达)差异的检测。例如，空间分析方法学可用于检测组织学载玻片样品中不同细胞内分析物水平(例如基因和/或蛋白质表达)的差异，来自所述检测的数据可被重新整合而生成针对从哺乳动物获得的组织样品的分析物水平(例如基因和/或蛋白质表达)的、例如具有一定程度的空间分辨率(例如单细胞分辨率)的三维图。

通常经由rna杂交、免疫组织化学、荧光报道分子或者纯化或诱导预定义亚群以及随后的基因组图谱分析(例如rna序列)来研究发育系统中的空间异质性。但是，此类方法依赖于相对较小的一组预定义标记，因此会引入限制发现的选择偏向。这些现有方法还依赖于先验知识。传统上，空间rna测定依赖于对有限数量的rna种类的染色。相比之下，单细胞rna测序允许对细胞基因表达(包括非编码rna)的深度图谱分析，但所建立的方法将细胞与其天然空间环境分开。

当前的空间分析方法学以高空间分辨率提供针对样品中各种多个分析物的大量分析物水平和/或表达数据、例如同时仍保留了天然空间环境。空间分析方法包括例如使用包含空间条形码的捕获探针(例如核酸序列，核酸序列提供有关捕获探针在细胞或组织样品(例如哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置的信息)，以及例如捕获域，捕获域能够结合到由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物(例如蛋白质和/或核酸)。如本文中所描述的，空间条形码可以是具有以下特征的核酸：独特的序列、独特的荧光团或独特的荧光团组合、独特的氨基酸序列、独特的重金属或独特的重金属组合、或者任何其它独特的可检测剂。捕获域可以是任何能够与由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物结合的任何试剂(例如，能够与来自细胞的核酸杂交的核酸(例如mrna、基因组dna、线粒体dna或mirna)、包含分析物的基质、分析物的结合伴侣、或者专门结合到分析物的抗体)。捕获探针可还包括与通用正向和/或通用反向引物的序列互补的核酸序列。捕获探针可还包括切割位点(例如，限制性内切核酸酶的切割识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。

可以使用多种不同方法来检测分析物与捕获探针的结合，比如核酸测序、荧光团检测、核酸扩增、核酸连接检测和/或核酸切割产物检测。在一些示例中，检测被用于使特定空间条形码与由细胞(例如，哺乳动物细胞)产生和/或存在于细胞中的特定分析物关联。

捕获探针可例如依附于诸如固体列阵、珠粒或盖玻片之类的表面。在一些示例中，捕获探针未依附于表面。在一些示例中，捕获探针可封装在可渗透组合物(例如，本文中描述的任何基板)的表面内、嵌置在可渗透组合物的表面内、或层叠在可渗透组合物的表面上。例如，捕获探针可封装或设置在可渗透的珠粒(例如，凝胶珠粒)内。在一些示例中，捕获探针可封装在基板(例如，本文中描述的任何示例性基板，比如水凝胶或多孔膜)的表面内、嵌置在基板的表面内、或层叠在基板的表面上。

在一些示例中，细胞或包含细胞的组织样品与依附于基板(例如，基板的表面)的捕获探针接触，并且细胞或组织样品可被透化以允许分析物从细胞中释放并结合到依附于基板的捕获探针。在一些示例中，可以使用多种方法例如电泳、化学梯度、压力梯度、流体流或磁场，来将从细胞释放的分析物主动引导至依附于基质的捕获探针。

在其它示例中，可以使用多种方法引导捕获探针与细胞或组织样品相互作用，例如，在捕获探针中包括脂质锚定剂、包含专门与捕获探针中的膜蛋白结合或与捕获探针中的膜蛋白形成共价键的试剂、流体流、压力梯度、化学梯度或磁场。

以下中描述了空间分析方法学的非限制性方面：wo2011/127099，wo2014/210233，wo2014/210225，wo2016/162309，wo2018/091676，wo2012/140224，wo2014/060483，美国专利号10,002,316，美国专利号9,727,810，美国专利申请公开号2017/0016053，rodriquesetal.,science363(6434):1463-1467,2019；wo2018/045186，leeetal.,nat.protoc.10(3):442-458,2015；wo2016/007839，wo2018/045181，wo2014/163886，trejoetal.,plosone14(2):e0212031,2019，美国专利申请公开号2018/0245142，chenetal.,science348(6233):aaa6090,2015，gaoetal.,bmcbiol.15:50,2017，wo2017/144338，wo2018/107054，wo2017/222453，wo2019/068880，wo2011/094669，美国专利号7,709,198，美国专利号8,604,182，美国专利号8,951,726美国专利号9,783,841，美国专利号10,041,949，wo2016/057552，wo2017/147483，wo2018/022809，wo2016/166128，wo2017/027367，wo2017/027368，wo2018/136856，wo2019/075091，美国专利号10,059,990，wo2018/057999，wo2015/161173，以及guptaetal.,naturebiotechnol.36:1197-1202,2018，以上全部内容通过引用的方式并入本文中且可以以任何组合在本文中使用。本文中描述了空间分析方法学的另外的非限制性方面。

本文中所描述的实施例可利用这样的载玻片(例如基因表达载玻片)来映现(例如在组织载玻片上的)复杂组织样品的空间基因表达，所述载玻片利用分析物和/或mrna转录捕获物及空间条形码技术进行文库制备。组织(例如，新鲜冷冻的、福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)等等)可被切片并被置放在具有数千个条形码斑点的载玻片附近，每个斑点包含数百万个带有该斑点所特有的空间条形码的捕获寡核苷酸。在组织切片被固定、染色和透化之后，组织切片释放mrna，该mrna与来自组织上邻近位置的捕获寡核苷酸结合。当组织仍在原位时可发生逆转录反应，生成包含空间条形码并且保存空间信息的cdna文库。条形码cdna文库被映射回条形码斑点捕获区域上的特定斑点。随后可将该基因表达数据层叠在组织切片的高分辨率显微镜图像上，从而有可能以空间分辨的方式可视化组织形态内的任何mrna或mrna组合的表达。

图1示出了根据一些示例实施方式的示例性空间分析工作流程100。工作流程100包括在载玻片(例如，病理载玻片)101上制备生物样品、固定样品和/或对生物样品染色102以进行成像。染色后的样品然后可在载玻片上利用明场(以对样品苏木精和伊红染色剂成像)和/或荧光(以对特征成像)成像。成像可以包括高分辨率成像(例如，可以揭示病理学和组织学特征的图像)。任选地，在103处，可以使样品在透化之前脱色。在104处，当病理学载玻片以“夹叠”构型与包括空间条形码列阵(例如在gex载玻片上)的载玻片对正时，透化溶液可被施加到生物样品。透化溶液允许分析物和/或mrna转录物远离样品迁移、遍及透化溶液并朝向列阵扩散。分析物和/或mrna转录物与载玻片上的空间条形码列阵上的捕获探针相互作用。

在105处，捕获探针可以可选地从列阵被切割/分开，并且可通过执行逆转录酶第一链cdna反应来对捕获的分析物带有空间条形码。第一链cdna反应可以可选地利用模板转换寡核苷酸执行。在106处，第一链cdna可被扩增(例如利用聚合酶链反应(pcr))，其中正向和反向引物处在空间条形码和感兴趣的分析物区域的侧面，生成与特定空间条形码相关联的文库。在一些实施方案中，cdna包含合成测序(sbs)引物序列。文库扩增子可被测序和分析以解码空间信息。

图2绘示了根据一些示例实施方式的用于在载玻片(例如病理载玻片)上制备生物样品的示例工作流程101。在载玻片上制备生物样品可以包括选择病理玻璃载玻片201。工作流程101还包括将组织切片置于玻璃载玻片202上。将组织切片置于玻璃载玻片上可以包括将组织置于玻璃载玻片上的任何位置，包括将组织置于在玻璃载玻片上设置的基准上或相对于所述基准置放。基准可包括辅助组织在载玻片上置放和/或辅助组织载玻片相对于基因表达载玻片对正的任何标记。工作流程101还包括利用苏木精和伊红203或另一种染色剂或方法对组织进行染色。工作流程101还包括利用明场(以对样品苏木精和伊红染色剂成像)或另一种成像技术对载玻片上的组织204进行成像。成像可包括在用户成像系统上高分辨率成像。成像可允许用户确认相关病理和/或鉴别用于分析的任何目标区域。

本文中与在载玻片上制备生物样品相关所描述的实施例可以有益地允许用户确认组织切片上的病理或相关区域、确认对最佳的或未损坏的用于分析的组织切片的选择，以及通过允许置放在病理载玻片上的任何地方处而改善列阵组织的对正。此外，用于在载玻片上制备生物样品的工作流程可以使用户或科学家有权选择要测序的内容(例如，要测序的组织切片)。

图3是示意图，绘示了根据一些示例实施方式的在呈夹叠构型的组织载玻片与基因表达载玻片之间的示例性透化溶液相互作用104。在示例性构型中，样品(组织或生物样品)302被设置在载玻片303(例如病理载玻片或组织学载玻片)上并且被夹叠在载玻片303与充斥有空间条形码捕获探针306的载玻片304(例如基因表达载玻片)之间。如图所示，载玻片304处在病理载玻片303上方的位置。在一些实施例中，载玻片303可高于载玻片304定位。当透化溶液305被施加到载玻片303与载玻片304之间的间隙307时，透化溶液305产生透化缓冲液，透化缓冲液透化或溶解样品302，并且组织样品302的分析物和/或mrna转录物308可以释放、横穿间隙307朝向捕获探针306扩散并结合在捕获探针306上。在转录物308结合在捕获探针306上之后，可发生逆转录反应，生成与特定空间条形码关联的cdna文库。条形码cdna文库可被映射回捕获探针306的捕获区域上的特定斑点。随后可将该基因表达数据层叠在组织切片的高分辨率显微镜图像(例如，在图2的204处获得)上，使之有可能以空间分辨方式可视化组织形态内的任何mrna或mrna组合的表达。

样品302、载玻片303和载玻片304的夹叠构型可提供优于其它空间分析和/或分析物捕获方法的优点。例如，夹叠构型可减少用户扩展室内组织切片和/或组织安装专业知识的负担。此外，夹叠构型可使样品制备/组织成像与条形码列阵(例如，空间条形码捕获探针306)解耦，并允许对分析特别关注的区域的选择(例如，对于比条形码列阵大的组织切片)。夹叠构型还有利地使得能够进行空间转录组学测定而不必将组织切片302直接置于基因表达载玻片(例如，载玻片304)上，这可降低成本和样品制备过程中失误/问题发生的风险。夹叠构型还可通过将目标分子竖直地限制在扩散距离内而提供灵敏度和空间分辨率的改善。

(b)基板保持器

本文中描述的是这样的方法，其中位于基板上的带有捕获探针的列阵与位于不同基板上的生物样品接触或接近，从而使列阵与生物样品的部分(例如分析物或其它分子)接触(例如，各基板被夹叠在一起)。在一些实施例中，列阵和生物样品可在未借助于基板保持器的情况下接触(例如，被夹叠)。在一些实施例中，可将列阵和生物样品基板置于基板保持器(例如，列阵对正装置)中，所述基板保持器设计为使生物样品和列阵对正。例如，基板保持器可具有用于一个或多个基板的预留位置部(placeholder)。在一些实施例中，可以将包含捕获探针的列阵定位在基板保持器的一侧上(例如，在第一基板预留位置部中)。在一些实施例中，生物样品可在基板保持器的相邻侧上置于第二预留位置部中。

在一些实施例中，铰链可位于两个基板预留位置部之间，所述铰链允许基板保持器闭合、例如使两个基板预留位置部之间形成夹叠。在一些实施例中，当基板保持器闭合时，生物样品和带有捕获探针的列阵在足以允许生物样品中存在的分析物与列阵的捕获探针相互作用的条件下彼此接触。例如，干燥的透化试剂可置于生物样品上并再水化。透化溶液可流动通过基板保持器以透化生物样品并允许生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。另外，基板或透化溶液的温度可用于启动透化或控制透化速率。例如，可以使包括列阵的基板、包括生物样品的基板或两种基板都保持在低温条件下以减慢扩散和透化效率。在被夹叠之后，在一些实施例中，可加热基板来启动透化和/或增加扩散效率。从透化组织中释放出来的转录物可扩散到列阵并被捕获探针捕获。夹叠可被打开，并且cdna合成可在列阵上执行。

在本文中所描述的各种组合中的任何中，在两个不同的基板上包括具有捕获探针的列阵和生物样品的夹叠体可被置于基板保持器中，所述基板保持器设计为使生物样品与列阵对正。例如，基板保持器可具有用于一个或多个基板的预留位置部。在一些实施例中，包括捕获探针的列阵可定位在基板保持器的一侧上(例如，在第一基板预留位置部中)。在一些实施例中，生物样品可在基板保持器的相邻侧上置于第二预留位置部中。在一些实施例中，两个基板预留位置部之间中可设有铰链，铰链允许基板保持器闭合、例如使两个基板预留位置部之间形成夹叠。在一些实施例中，当基板保持器闭合时，生物样品和具有捕获探针的列阵可在足以允许生物样品中存在的分析物与列阵的捕获探针相互作用的条件下彼此接触，以便通过本文中所描述的任何方法来进行空间分析。例如，干燥的透化试剂可被置于生物样品上并再水化。另外，透化溶液可流动通过基板保持器以透化生物样品并使生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。

在一些实施例中，本文中所描述的柔性列阵可被置于基板保持器中，并夹叠有生物样品。在一些实施例中，柔性列阵可包括空间条形码的交联特征。在一些实施例中，柔性列阵可在被置于基板保持器中之前预浸于透化试剂中。在一些实施例中，柔性列阵可在被置于基板保持器中之后浸入透化试剂中。在一些实施例中，在一个预留位置部中包括生物样品并包括柔性列阵的基板保持器可被闭合(例如，形成夹叠)，使得透化试剂允许生物样品中存在的分析物与柔性列阵的捕获探针(例如，在空间条形码特征上的探针)相互作用。

在一些实施例中，可以加热或冷却基板保持器以调节透化和/或扩散效率。

ii.用于样品分析的系统

以上描述的用于分析生物样品的方法可利用各种硬件部件来实现。在本章节中，将描述此类部件的示例。但是，应该理解，一般而言，本文中所论述的各种步骤和技术可以利用各种不同的装置和系统部件来执行，它们中并非全部都被明确陈述。

本文中所描述的系统、方法和计算机可读介质可以实现样品和列阵的高效且精确的对正，从而促进本文中所描述的空间转录组成像和分析工作流程或测定。样品(例如组织的部分)可被置于第一基板上。第一基板可包括载玻片，用户可将组织的样品置于所述载玻片上。列阵、例如试剂列阵可形成在第二基板上。第二基板可包括载玻片，并且列阵可形成在所述第二基板上。对样品和列阵使用单独的基板可有利地允许用户执行本文中所描述的空间转录组测定而无需将样品置于列阵基板上。本文中所描述的样品保持器和使用方法可改善用户提供用于空间转录组分析的样品的难易程度。例如，本文中描述的系统和方法减轻了用户拥有高级样品或组织切片或安装专业知识的需求。对于样品和列阵采用单独的基板的另外的益处可包括：改进的样品制备和样品成像时间、更大的执行感兴趣区域(roi)选择的能力、以及更有效地使用样品和列阵基板。在一些方面中，感兴趣区域可以包括生物样品302和捕获探针306以夹叠构型重叠的区域。

样品和列阵对正装置及方法

空间分析工作流程通常涉及使样品与特征列阵接触。在一些实施例中，为了实现样品与列阵之间的接触，在第一基板(例如载玻片)上制备样品，并且在第二基板(例如载玻片)上制备列阵，并且使两个载玻片接近以便使第一基板上的样品与第二基板上的特征列阵对正并接触(例如，经由透化溶液)。图4是示意图，示出了安装在第一基板(例如载玻片303)上的样品302和设置在第二基板(例如载玻片304)上的特征列阵306。

在某些工作流程中，对正和接触操作手动执行。然而，手动对正容易导致操作者差错以及不一致：样品302与特征列阵306之间的对正操作可能不一致和/或有瑕疵。出于多种原因，样品302和特征列阵3066之间的不正确对正会是不利的。例如，如果在发生接触时样品和列阵有瑕疵地对正，则可能无法成功移迁样品并尝试重新对正，并且可致使列阵无法使用。对于昂贵的特征列阵，这导致显著增加的测定成本。

此外，某些测定涉及通过特征列阵对样品成像。如果样品和列阵未正确对正，则成像可能会有瑕疵并会受由未对正引起的瑕疵的不良影响。

另外，许多组织样品可以以存档(即，载玻片安装式)形式获得。结果，依赖于组织样品在特征列阵上的直接物理置放的工作流程可能无法适应此类样品。这将此类工作流程的适用性限制于仅只可用样品的子集。

本公开的特征在于用于样品302与特征列阵306对正的装置和方法。所述装置和方法确保样品与特征列阵之间正确对正及接触，从而可以以不会受到对正误差的系统性变动显著影响的方式来进行可再现的空间分析。装置和方法减少了消耗品浪费(即，浪费的特征列阵)和成本，并且还减少了样品浪费。在一些实施例中，特征列阵306包括印刷的斑点、条形码化的凝胶，条形码化的微球，凝胶膜层或它们的任何组合。特征列阵306还可以是探针的均匀涂层，例如在组织优化载玻片中。

图5a是样品保持器500的示例的示意性俯视图，并且图5b和图5c是样品保持器500的示意性侧视图。样品保持器500包括第一构件502，所述第一构件包括第一保持机构504，所述第一保持机构保持带有样品302的基板303。样品保持器500还包括第二构件506，所述第二构件506包括第二保持机构508，所述第二保持机构保持带有特征列阵306的第二基板304。对正机构510连接到第一构件502和第二构件506中的至少一者(在图5a和图5b中，连接到第一构件502和第二构件506两者)。在对正和接触过程期间，对正机构510用于使第一构件502和第二构件506对正，从而确保样品302和特征列阵306也被对正并被带向接触而促进对样品302的分析。

如图5a-5c中所示，在一些实施例中，对正机构510可以被实现为连接至第一构件502和第二构件506的旋转致动器。对正机构510可以被实现为连接到第一构件502和第二构件502的定位销和/或定位凸片。旋转致动器的一个示例是铰链。如图5b中所示，在基板安装式样品303被定位在第一构件502中并且基板安装式特征列阵304被定位在第二构件506中之后，所述构件中的一者绕着铰链轴线的旋转使构件502与506对正，且还使样品302与特征列阵306对正。构件可绕着铰链轴线旋转，直到如图5c中所示的样品302和特征列阵306对正并接触为止。

尽管在一些实施例中旋转致动器会被实现为铰链(如图5a-5c中所示)，然而其它的实施方式也是可行的。例如，在某些实施例中，旋转致动器被实现为折叠构件。图5d示出了示例样品保持器500的示意性侧视图，所述样品保持器500包括连接至第一构件502和第二构件506的折叠构件512。折叠构件512以类似于上述铰链的方式起作用，使构件502和506以及样品302和特征列阵306对正。折叠构件可以由各种材料形成，包括诸如橡胶和乙烯基之类的顺应性材料、金属和金属合金以及塑料。

在某些实施例中，旋转致动器510可包括至少一个臂。图5e示出了示例样品保持器500的示意性侧视图，该样品保持器500包括实现为连接至第一构件502和第二构件506的臂514的旋转致动器。臂514包括内部枢转机构516(例如，销)，所述内部枢转机构允许臂514折叠、使构件502和506对正，从而使样品302和特征列阵306对正。尽管仅一个臂514被示出在图5e中，然而更一般而言，旋转致动器510可包括多个臂(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多，或甚至更多)。

在以上论述的样品保持器500的每个示例中，样品保持器500都被实现为一体式(即，一件式的)装置。样品保持器500也可以被实现为两件式装置，其中第一构件502和第二构件506是分离的但可经由对正机构510可再现地连接。图5f示出了两件式样品保持器500的示例的示意性侧视图。可以以各种方式来实现对正机构。在图5f中，对正机构由位于第二构件506上的连接器518和位于第一构件502上的接收器520组成。当第一构件502和第二构件506接近时，连接器518与接收器520接合，使第一构件502和第二构件506对正，并且也使样品302与特征列阵306对正。应该注意的是，尽管在图5中连接器518位于第二构件506上并且接收器520位于第一构件502上，但相反的情况也可成立。此外，第一构件502和第二构件506可各自具有一个或多个连接器518和一个或多个接收器520。

第一保持机构504可以以各种方式实现。在一些实施例中，第一保持机构504可对应于尺寸设计为接收第一基板303的凹部。此外，垫片可以可选地定位在凹部内，以维持凹部和第一基板303的边缘之间的过盈配合。

在某些实施例中，第一保持机构504可对应于一个或多个构件，所述一个或多个构件定位成向第一基板303施加力，特别是来维持第一基板303和第一构件502之间的接触。这类构件的示例包括但不限于夹子、螺钉和其它带螺纹的保持紧固件、以及与第一构件502卡合紧固或以其它方式接合的构件。这些构件可以向第一基板303的样品承载表面和/或向第一基板303的一个或多个侧向表面施加力。

一般而言，第二保持机构508可以对应于以上关于第一保持机构504所论述的任何不同类型的保持机构。第一保持机构504和第二保持机构508可以不同或相同。

在一些实施例中，第一构件502包括第一孔口522。第一孔口522可以例如定位成使得当第一基板303被保持在第一构件502中时，第一孔口522与第一基板303上的样品区域(例如，样品302通常位于的区域、或者被指定用于置放样品302的区域)对正。孔口522可以定位成使得样品302可以从第一构件502的后表面(例如，与支撑第一基板303的表面相反的表面)通过第一孔口522被观察到，并且可以通过第一孔口522获得样品302的一个或多个图像。

如上所述，特征列阵306可以定位在第二基板304上。然而，更一般地，第二基板304支撑用于分析样品302的试剂介质。在一些实施例中，试剂介质对应于特征列阵306。在某些实施例中，试剂介质包括特征列阵306和一个或多个另外的组分。例如，另外的组分可包括透化试剂(例如固体的、液体的、凝胶的或干燥的透化试剂)。作为另外的示例，另外的组分可包括嵌置有透化试剂的水凝胶化合物或层。

在一些实施例中，第二构件506包括至少一个孔口。图6示出了样品保持器500的示例的示意性侧视图，其中第二构件506包括孔口524。更一般地，第二构件506可以包括一个或多个(例如，两个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、8个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多，或甚至更多个)第二孔口524。在某些实施例中，当第一构件502和第二构件506对正时，第二孔口524与基板303上的样品区域的至少一部分和/或第一孔口522对正。

第二孔口524可用于各种目的。例如，在一些实施例中，特征列阵306和/或样品302可通过第二孔口524进行观察或成像。观察/成像可被用来调节特征列阵306和样品302的相对位置以例如改善对正。

在某些实施例中，第二孔口524的一个或多个边界表面和第二基板304的后表面(即，第二基板304的与第二基板304的面向样品302并支撑特征列阵306的表面相反的表面)协作以形成试剂井。添加到试剂井的试剂溶液526(例如，包含透化试剂)通过第二孔口524的边界表面被容纳。如果第二基板304由可渗透或可半渗透的材料形成，则试剂溶液526可渗透(例如，通过扩散)通过第二基板304的后表面并接触样品302。

在一些实施例中，样品保持器500包括连接至第一构件500的第一调节机构528。第一调节机构528使第一基板303在与第一基板303的支撑样品302的表面平行的至少一个方向上平移。在一些实施例中，第一调节机构528使第一基板303在与第一基板303的表面平行的两个方向上平移。

第一调节机构528可以以各种方式实现。在一些实施例中，例如，第一调节机构528包括可用于平移第一基板303的一个或多个指旋螺钉(例如，如图5a中所示)或直线致动器。

除了使第一构件502和第二构件506对正之外，对正机构510还可配置为在基板(及构件)对正时维持第一基板303与第二基板304(以及第一构件502与第二构件506)之间的分隔。例如，所述分隔可维持成使得样品302的至少一部分接触试剂介质(例如，试剂介质的特征列阵306)。

在与第一基板303的支撑样品302的表面正交的方向上测量，第一基板303与第二基板304之间的分隔可维持在50微米与1mm之间(例如，50微米与800微米之间、50微米与700微米之间、50微米与600微米之间、50微米与500微米之间、50微米与400微米之间、50微米与300微米之间、50微米与200微米之间、50微米与100微米之间)。

在某些实施例中，当基板(以及第一构件502和第二构件506)对正时，对正机构510维持第一基板303和第二基板304处于大致平行的关系。在这种情况下，第一基板303和第二基板304之间的夹角可以是2度或更小(例如，1度或更小、0.5度或更小、0.25度或更小)。

在一些实施例中，样品保持器500可包括一个或多个间隔构件530，所述一个或多个间隔构件协助维持第一基板303和第二基板304的间隔和/或近似平行的布置结构。这种间隔构件530的示例被示出在图5c中。间隔构件530可以连接到第一构件502和第二构件506中的任一者或两者。

在某些实施例中，样品保持器500包括第二调节机构532，如图5c中所示的。第二调节机构532调节第一基板303和第二基板304之间的间隔的距离(即，在与第一基板303的支撑样品302的表面正交的方向上)。如图5c中所示，在一些实施例中，第二调节机构532连接至第一构件502和第二构件506中的至少一者；在某些实施例中，调节机构532连接到构件502和506两者。第二调节机构532可以是调节机构510的组成部分，或者替代地，第二调节机构可实现为如图5c中的单独部件。

第二调节机构532可以以各种方式实现。在一些实施例中，第二调节机构532包括一个或多个指旋螺钉或可调节销或柱。在某些实施例中，第二调节机构532包括一个或多个直线致动器。在一些实施例中，第二调节机构532包括位于第一构件502和第二构件506之间的可鼓胀或可膨胀的膜、垫片或层。

作为分析工作流程的后续步骤，在样品302和特征列阵306通过样品保持器500被带入接触之后，可以将样品保持器500引入热循环仪中，以促进特征列阵306从样品302捕获分析物。为此目的，可以将样品保持器500直接插入到合适的热循环仪中。替代地，在一些实施例中，样品保持器500可以联接至热循环仪适配器，并将联接后的保持器和适配器插入到热循环仪中。在例如于2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,575中描述了用于与样品保持器500一起使用的适合的热循环仪适配器，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文中。

样品保持器500与用于使样品302和透化试剂接触以促进分析物捕获的多种不同方案兼容。在一些实施例中，将透化试剂溶液直接沉积在第二基板304上(例如，形成包括透化试剂和特征列阵306的试剂介质)和/或直接沉积在第一基板303上，且然后使样品302与特征列阵306接触(例如通过闭合样品保持器500，如图5c中所示)。

在某些实施例中，在使样品302和特征列阵306接触之前，干燥的透化试剂被施加或被形成作为在第一基板303或第二基板304或两者上的层。例如，试剂可以以溶液的形式被沉积在第一基板303或第二基板304或两者上且然后被干燥。干燥的方法包括但不限于旋涂试剂的稀溶液且然后蒸发试剂中包含的溶剂或试剂本身。替代地，在其它实施例中，试剂可以以干燥的形式被直接施加到第一基板303或第二基板304或两者上。在一些实施例中，可以在分析工作流程之前完成涂覆过程，并且第一基板303和第二基板304可以以预涂覆的方式存储。替代地，涂覆过程可以作为分析工作流程的一部分来完成。在一些实施例中，试剂是透化试剂。在一些实施例中，试剂是透化酶、缓冲剂、去污剂或它们的任何组合。在一些实施例中，透化酶是胃蛋白酶。在一些实施例中，试剂是干燥的试剂(例如，没有水分或液体的试剂)。

可以使包括特征列阵306的第一基板303与干燥的透化试剂526接触。在一些实施例中，使第一基板303与作为凝胶或液体的透化试剂接触。样品302可以与缓冲液接触。第一基板303和第二基板304两者可被置于较低温度条件下以减慢扩散和透化效率。替代地，在一些实施例中，样品302会直接与液体透化试剂接触，而不会引入因基板处于第二温度条件下而带来的不希望的透化启动。在一些实施例中，低温减慢或阻止透化的启动。

样品保持器500(及因此第一基板303和第二基板304)可被加热升温以启动或增加透化。在一些实施例中，样品保持器500被加热升温至第三温度。在一些实施例中，第三温度高于室温(例如25摄氏度)(例如，30摄氏度或更高、35摄氏度或更高、40摄氏度或更高、50摄氏度或更高、60摄氏度或更高)。在一些实施例中，从样品302的透化组织释放的分析物扩散到第一基板303的表面，并被捕获在第二基板304的特征列阵306(例如，条形码探针)上。在加热之后，第一基板303和第二基板304可以分离(例如，拉开)，并且温度控制可以停止。

在一些实施例中，在第一基板303或第二基板304(或两者)包括井的情况下，可以将透化溶液引入到一些或所有井中，且然后可以通过闭合样品保持器500来使样品302和特征列阵306接触以透化样品302。在某些实施例中，透化溶液可以浸入到直接向样品302施加的水凝胶膜层中，和/或浸入到形成特征列阵306的特征(例如，珠粒)中。当通过闭合样品保持器500使样品302和特征列阵306接触时，透化溶液促进分析物从样品302迁移到特征列阵306。

在某些实施例中，如上所述，可以将不同的透化剂或不同浓度的透化剂注入到列阵特征(例如珠粒)中或注入水凝胶层中。通过局部改变透化试剂的性质，可以在空间上调节自样品302的分析物捕获过程。

还应注意，与以上任何透化方法相关地，在一些实施例中，透化剂向样品302中的迁移可以是被动的(例如，经由扩散)。替代地，在某些实施例中，透化剂向样品302中的迁移可以主动地执行(例如电泳，通过施加电场来促进迁移)。

在样品保持器500的前述描述中，组装或闭合样品保持器500(如图5c中所示)可手动执行。替代地，在一些实施例中，可以使用一个或多个电动致动器(例如，作为对正机构510)来闭合样品保持器500，所述一个或多个电动致动器由专用控制器或由在包括一个或多个电子处理器、专用集成电路和/或专用可编程控制器的专用或通用计算装置上运行的软件控制。

尽管第一基板303和第二基板304在图5a中被示出为具有相同的尺寸，然而更一般地，第一构件502和第二构件506可以容纳不同尺寸和/或形状的第一基板303和第二基板304。在某些实施例中，第一保持机构504和/或第二保持机构508的形状适于容纳第一基板303和第二基板304的特定尺寸和/或形状。在某些实施例中，第一保持机构504和/或第二保持机构508可以调节，并且可以容纳具有不同尺寸和/或形状的基板。

在第一基板303和第二基板304沿着一个横向方向比沿着另一横向方向更长(如图5a中所示)的一些实施例中，样品保持器500可被配置为接收第一基板303和第二基板304使得当样品保持器500闭合时各基板的较长尺寸正交对正。由于第一调节机构528允许第一基板303平行于方向平移，因此样品302可定位在基板303上的几乎任何位置处且仍然与特征列阵306对正(通过调节第一调节机构528)。

为了确保样品302和特征列阵306通过样品保持器500被带入对正，在一些实施例中，可以(例如，通过第一孔口522和/或第二孔口524)观察或成像第一基板303和/或第二基板5106上的基准标记，并且可以调节第一调节机构528以使基准标记彼此对正。即使在第一基板303和第二基板304未包括基准标记时，也可以调节第一基板303和第二基板304之间的对正。

示例

示例1

为了评估使用样品保持器500的不同透化方案，进行了一系列实验。在第一实验中，将透化溶液施加到第二基板304的表面，并且将第一基板303和第二基板304对正使得样品302接触特征列阵306，并且透化溶液扩散到样品302中，促进从样品302释放分析物。分析物被列阵306捕获。使用总共20μl的4x透化溶液，并且透化和分析物迁移在37℃条件下进行6分钟。

图7示出了使用示例样品保持器500的示例分析工作流程。在第一步骤702处，空的样品保持器500被置于打开位置中。打开位置可以允许用户更容易地将载玻片(例如，基板)添加到样品保持器500或从样品保持器移迁载玻片。如图7的示例中所示的，样品保持器500包括两个第一保持机构504，第一构件502包括两个第一孔口522，并且第二构件506包括两个第二孔口524。

在步骤704处，第二基板304(例如，经由第二保持机构508)会被加载到第二构件506中。如图所示，第二基板304包括两个特征列阵306。当第二基板304在第二构件506内对正时，特征列阵306会定位在第二图片524上方。

在步骤706处，间隔构件530会被定位在样品保持器500内。在步骤708处，间隔构件530被定位在样品保持器500内的示例位置中。如在步骤708中所示，间隔构件530附在第二基板304上置于第二构件506内。如进一步所示，间隔构件530包括尺寸和形状设计成可装配在第二基板304的特征列阵306上方的孔口。在一些方面中，间隔构件530和/或第二构件506可包括粘合部(例如，压敏粘合剂(psa)、胶水、velcro、胶带等)，粘合部配置为将间隔构件530联接至第二构件506并将间隔构件530保持在期望的位置中。

在步骤710处，第一基板303(例如，经由第一保持机构504)会被加载到第一构件502中。如图所示，第一基板303可以包括样品302。在步骤712处，第二第一基板303会被加载到第一构件502中(例如，经由第二个第一保持机构504)。如图所示，第二第一基板303包括第二样品302。在一些方面中，在使第一构件502附在第二构件506上闭合之后，样品302会与特征列阵306对正和/或会接触特征列阵。

在步骤714处，用户可将试剂溶液(例如，透化溶液305)添加到第一基板303和/或第二基板304。在一些方面中，用户可将试剂溶液添加到特征列阵306附近或上方的位置。在一些实施例中，样品保持器设备可被配置为添加试剂溶液。在添加试剂溶液之后，用户可以使第一构件502附在第二构件506上闭合。替代地，在一些实施例中，可以使用一个或多个电动致动器(例如，作为对正机构510)来闭合样品保持器500，所述一个或多个电动致动器由专用控制器或由在包括一个或多个电子处理器、专用集成电路和/或专用可编程控制器的专用或通用计算装置上运行的软件控制。如在步骤714中示出的，闭合的样品保持器500包括第一构件502的第一孔口522。在使第一构件502附在第二构件506上闭合之后，透化溶液305可以接触一个或多个样品302并促进分析物从一个或多个样品302释放到第二基板304的特征列阵306。

在步骤716处，闭合的样品保持器500包括第二构件506的第二孔口524。闭合的样品保持器500然后可被转移到不同的设备或位置以进行成像、加热、分析等。

图8示出了使用具有折叠构件512的示例样品保持器500的示例分析工作流程。在步骤802处，样品保持器500处于打开位置，其中第二基板304位于第二构件506内。如进一步所示，样品保持器500包括两个第一构件502，并包括第二构件506。图8的示例样品保持器500包括联接到第二构件506和第一构件502的折叠构件512。第二基板包括两个特征列阵306。如进一步所示，具有第一样品302的第一基板303被加载到第一构件502中(例如，经由位于步骤802处所示的样品保持器500的右手侧处的第一保持机构504)。

在步骤804处，具有第二样品302的第二第一基板303被加载到第一构件502中(例如，经由位于步骤804处所示的样品保持器500左侧处的第二第一保持机构504)。

在步骤806处，样品保持器500配置为处于打开位置，其中第一基板303位于第一构件502内并且第二基板304位于第二构件506内。

在步骤808处，第一构件502(例如，在样品保持器500的右手侧处的)开始经由折叠构件512附在第二构件506上闭合。在步骤810处，第一构件502进一步附在第二构件506上闭合。在步骤812处，右侧的第一构件502附在第二构件506上闭合。如图所示，使第一构件502折叠附在第二构件506上可以使第一样品302附在第二基板304的特征列阵306上对正。如步骤812中进一步所示，左侧的第一构件502开始附在第二构件506上闭合。

在步骤814处，左侧的第一构件502附在第二构件506上闭合，并且左侧的第一构件502的第二样品302可以与第二基板304的余下的特征列阵306对正。

在步骤816处，闭合的样品保持器500然后可被转移到不同的设备或位置以进行成像、加热、分析等。

在步骤818处，样品保持器500可以被打开并且第二基板304可以被移迁以执行空间分析、反转录等。

在步骤820处，第一基板303可从第一构件502被移迁。在一些方面中，可以更换第一基板303和/或第二基板304来执行附加分析。

在步骤822处，样品保持器500部分地闭合，其中第一基板303被设置在左侧的第一构件502内并且第二第一基板303在第一构件502外并附在第二基板304上定位。

在步骤824处，闭合的样品保持器500然后可被转移到不同的设备或位置以进行成像、加热、分析等。

图9示出了使用形成流动池的示例样品保持器500的示例分析工作流程。图9类似于根据图7的示例工作流的改型。为了简洁起见，图7和图9之间的至少一些差异在此被描述。

在步骤902处，样品保持器500被显示为处于打开构型。第二构件506包括尺寸设计为接收第二基板304的凹进部分。如图所示，凹进部分包括垫片930。垫片930可以包括硅酮垫片，所述硅酮垫片配置为接触第二基板304并与第二基板形成密封。这样的密封可以促进流动池构型并允许透化溶液305向特征列阵306和/或样品302扩散。

在步骤904处，第二基板304被加载到第二构件506中(例如，在凹进部分内)。如图所示，垫片930可以在凹进部分内并附在试剂井924上定位。试剂井924可配置为保持一定量的透化溶液305，使得当第一构件502附在第二构件506上闭合时，透化溶液305向样品保持器500内的特征列阵306和/或样品302扩散。

在步骤906处，间隔构件530可被定位在样品保持器500内。如图所示，间隔构件530的尺寸和形状设计为与特征列阵306和试剂井924匹配。

在步骤908-914处，间隔构件530被固定在位，并且具有样品302的第一基板303被加载到样品保持器500中。

在步骤916处，第一构件502(例如，样品保持器500的盖)附在第二构件506上闭合。该闭合可以形成用于第一基板303和第二基板304的夹叠构型。该闭合还可形成流动池。形成流动池可以包括形成可以在其中插入和/或移迁流体(例如试剂溶液，比如透化溶液305)的腔室(例如，由第一基板303、第二基板304、间隔构件530等限定的体积)。在一些方面中，在闭合步骤916之后，样品保持器500可被转移到不同的设备或位置以进行成像、加热、分析等。

在步骤918处，用户可以将样品保持器500翻转过来，并且可以通过在第二构件506的后表面上邻近第二孔口524定位的端口925来加载试剂溶液(例如，透化溶液305)。在一些方面中，端口925可以包括单向阀，并且可以允许将限定体积的流体(例如经由移液、注射器、毛细管流等)注入到流动池中，以促进透化和分析物释放。利用端口925而不是将液滴直接置于第一基板303和/或第二基板304上(例如，如针对步骤714所描述的)可以有益地减少或消除透化过程中试剂溶液中气泡的形成。在一些实施方式中，在添加试剂溶液之后，可以将样品保持器500转移到不同的设备或位置以进行成像、加热、分析等。

图10a绘示了示例预加载有第二基板304的第二构件506、以及间隔构件530。在一些方面中，可以使用各种联接手段来将间隔构件530预组装并联接至第二构件506和/或第二基板304。例如，间隔构件530和/或第二构件506可以包括粘合部来固定并维持间隔构件530和第二构件506之间的连接。粘合部可以包括压敏粘合剂(psa)、胶水、胶带、磁铁、机械连接器等。

图10b绘示了图10a的第二构件506、第二基板304和间隔构件530的分解图。如在图10b的示例中所示的，在第二构件506上，各位置1008可包括可以联接至间隔构件530的粘合部。在一些方面中，在间隔构件530的接触第二构件506和/或第二基板304的侧部上，间隔构件530可包括可移迁的背衬(例如，塑料背衬)。可移迁的背衬可在将间隔构件固定至第二构件506和/或第二基板304之前保护间隔构件530上设置的粘合部。

图11a绘示了用于将第一基板303加载到示例样品保持器500中的示例工作流程1100。在步骤1102处，第二构件506被加载有第二基板304和间隔构件530，并且第一构件502是空的。在步骤1104处，具有样品302的第一基板303(例如，经由第一保持机构504)被加载到第一构件502中。在步骤1106处，试剂溶液(例如透化溶液305)可被添加到第二基板304，并且第一构件502可附在第二构件506上闭合以形成夹叠构型(例如，如图3中所示)并启动透化步骤。

图11b绘示了用于将第一基板303加载到示例样品保持器500中的示例工作流程1150。在步骤1152处，第二构件506被加载有第二基板304和间隔构件530，并且第一构件502被加载有第一第一基板303。如图11b中所示，间隔构件530的尺寸和形状设计成至少部分地包围特征列阵306和试剂井924。在步骤1154处，第二第一基板303被加载到第一构件502中(例如，经由第一保持机构504)。在步骤1156处，第一构件502可附在第二构件506上闭合以形成流动池。为了插入试剂溶液，可以将样品保持器500翻转过来以暴露第二构件506的后表面，并且用户可以将试剂溶液通过在第二构件506的后表面中的流动池端口(例如，试剂井924)插入。试剂溶液(例如透化溶液305)可向样品保持器内的特征列阵306和/或样品302扩散。在一些方面中，可以将样品保持器500转移到另一位置或设备以在插入试剂溶液之前进行成像。附加地或替代地，可以将样品保持器500转移到另一位置或设备以在插入试剂溶液(例如，经由试剂井924)之后进行加热、分析或成像。

图12a-12c示出了根据一些示例实施方式的处于打开和闭合构型的示例样品保持器500的不同视图。

图12a示出了处于打开构型的示例样品保持器500的俯视图。如图所示，具有两个特征列阵306的第二基板304(例如，经由第二保持机构508)被加载到第二构件506中，并且两个第一基板303(例如，经由第一保持机构504)被加载到第一构件502中。如进一步所示，样品保持器500包括联接到第一构件502的第一间隔构件530a和联接到第二基板304的第二间隔构件530b。在一些方面中，第二间隔构件530b可以附加地或替代地联接到第二构件506。第一间隔构件530a可以具有大于第二间隔构件530b的厚度。例如，第一间隔构件530a可以具有50μm的厚度，并且第二间隔构件530b可以具有12.5μm的厚度。尽管示例厚度值在本文中被用于第一间隔构件530a和第二间隔构件530b，但是其它的值也是可行的。在一些实施例中，当第一构件502和第二构件506对正时(例如，当第一构件502附在第二构件506上闭合时)，第一基板303、第二基板304、第一间隔构件530a和第二间隔构件530b可形成腔室(例如，流动池)。

图12b是根据一些示例实施方式的处于闭合位置(例如，第一构件502附在第二构件506上闭合)的图12a的示例样品保持器500的俯视图。如图所示，可以经由第一孔口522从顶部观察第一基板303和/或第二基板304。

图12c是根据一些示例实施方式的处于闭合位置(例如，第一构件502附在第二构件506上闭合)的图12a的示例样品保持器500的仰视图。如图所示，可以经由第二孔口524从底部观察第二基板304和/或第一基板303。

图13a-13c示出了根据一些示例实施方式的将试剂溶液添加到示例样品保持器500的示例工作流程。

图13a是处于闭合位置的样品保持器500的立体图。在图13a的示例中，具有样品302的第一基板303已经被加载在第一构件502中，并且具有列阵306的第二基板304已经被加载在第二构件506中。参考图12a，样品保持器500可包括具有不同厚度的第一间隔构件530a和第二间隔构件530b。例如，第一间隔构件530a可具有50-200μm的厚度，并且第二间隔构件530b可具有12.5μm的厚度。在一些方面中，当第一构件502和第二构件506对正时(例如，如图13a的示例所示)，第一基板303、第二基板304、第一间隔构件530a和第二间隔构件530b可形成腔室(例如，流动池)。腔室的第一高度可由第一间隔构件530a限定(例如，200μm)。

图13b示出了被翻转并处于闭合位置的示例样品保持器500的立体图。如图所示，可将试剂溶液插入在试剂井924(例如，在第二构件506的后表面中的端口)中。

图13c示出了处于闭合位置的示例样品保持器500的侧视图。如图所示，样品保持器500可以被压缩到由第二间隔构件530b限定的第二高度(例如，12.5μm)。在一些方面中，压缩样品保持器可以促进或推压经由试剂井924添加的试剂溶液朝向样品302和/或特征列阵306。在一些实施方式中，在将样品保持器500压缩到第二高度之后，样品保持器500可被转移到不同的位置或设备(例如，热循环仪)以加热第一基板303和/或第二基板304。

图14a-14b示出了根据一些示例实施方式的具有盖1410的示例第二构件506的底部立体图。图14a绘示了具有处于打开构型的盖1410的第二构件506。如图所示，第二基板(例如载玻片304)、垫片930被加载到第二构件506中。在一些方面中，垫片930可被安设在第二构件506的凹部中。垫片930可附在第二构件506的后表面上定位并可与在第二构件的后表面上的端口(比如试剂井924)连接。垫片930可以在上但且接触第二基板304的侧部，以便垫片930在垫片930与第二基板304之间形成密封。密封可允许经由端口(例如试剂井924)添加的试剂溶液迁移到特征列阵306和/或样品302。如进一步所示，间隔构件530也可安设到第二构件506中(例如，经由盖1410)。在一些方面中，第二基板304、垫片930和/或间隔构件530可以由制造商在工厂中预先安设并运送给客户(例如，作为套件)。顾客然后可以将其自己的具有对应样品302的顾客载玻片(例如，载玻片303)添加或联接到第二构件506，以执行空间分析(例如，经由本文中描述的夹叠构型)。

图14b给出了具有处于打开构型的盖1410的示例第二构件506的底部立体图。在图14b的示例中，第二构件506被预加载有第二基板304垫片930和间隔构件530。如进一步所示，第一基板(例如，载玻片303)被加载到示例第二构件506中。在一些方面中，顾客可手动将第一基板303加载到第二构件506中。在一些实施例中，客户可将整个预安设的第二构件506加载到样品保持器设备(例如样品保持器500)中以执行如本文中所述的空间分析。

图15a绘示了图14b的第二构件506的立体图，其中盖1410处于闭合构型。在闭合盖1410之后，第二构件506可被安设到热循环仪中，以促进通过特征列阵306从样品302捕获分析物。替代地或附加地，可以将图15a的闭合的第二构件506安设或转移到图像捕获装置以捕获样品302和/或特征列阵306的图像。这种图像捕获可以发生在将试剂溶液(例如，透化溶液305)插入到第二构件506中之前或之后。

图15b绘示了具有可移迁部分1504的第二构件506的分解图。如图所示，可移迁部分1504包括第二基板304。在一些方面中，可移迁部分1504可包括垫片930和/或间隔构件530。在一些实施方式中，可移迁部分1504可被安设或转移到另一装置以执行进一步的分析(例如，逆转录、文库测序、空间分析等)。

图16绘示了具有处于打开构型的盖1410的第二构件506的分解图。图16的示例图示出，第二基板304和垫片930可被预加载到第二构件506中。如图所示，间隔构件530可附在第二基板304上安设于第二构件506内。如进一步所示，一个或多个第一基板303可以附在间隔构件530上安设到第二构件506中，并且一个或多个第一基板303的样品302可以与预安设的第二基板304的特征列阵306对正。

其它实施例

将理解的是，尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是以上的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。

公开了系统、设备(例如，装置)、方法和组合物，所述系统、设备、方法和组合物可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用在所公开的方法和组合物的制备中、或者是所公开的方法和组成的产物。这些及其它的系统、设备、方法和组合物的组合、子集、相互作用、组群等也被公开。也就是说，尽管可能没有明确地公开对这些系统、设备组成和方法的每个不同的个体和集体的组合和排列的具体引用，但是本文中特别地考虑到和描述了每者。例如，如果特定的系统、设备、物质组成或特定的方法被公开并论述，并且许多系统、设备、组合物或方法被论述，则除非有相反的特别说明，否则系统、设备、组合物和方法的每种及每个组合和排列都被具体地考虑到。同样，这些的任何子集或组合也被特别地考虑到且公开。

其它的方面、优点和修改也在所附权利要求的范围内。