一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的SNP标志物、检测试剂、试剂盒及应用的制作方法

文档序号:23463317发布日期:2020-12-29 12:44阅读:207来源:国知局
一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的SNP标志物、检测试剂、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域,尤其是涉及一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物、检测试剂、试剂盒及应用。



背景技术:

结核病(tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)感染引起并经呼吸道传播的一种威胁全球人群健康的重大传染病。根据世界卫生组织(who)报道,中国是全球第二大结核发病国家,也是22个结核高负担国家之一。近年来,由于人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)流行、药物滥用导致耐药mtb的出现,世界范围的结核病又死灰复燃。2019年约有120万hiv阴性者和25.1万hiv阳性者死于结核病。结核病占我国2017年法定传染病发病数第二位,死亡率第二位,结核病的预防和诊疗形势仍然十分严峻。然而,低下的检出率仍然是结核病精准防治的主要障碍之一。最近研究表明,明确诊断的活动性结核病病例仅占结核分枝杆菌感染人口的5-15%,大多数感染者能够控制甚至清除体内的结核分枝杆菌,可见结核分枝杆菌感染过程中,宿主的遗传易感性是宿主感染mtb后是否发展为活动性结核病的关键因素。因此,亟需发现一种结核病相关的易感基因用于高危易感人群的早期筛查、结核病的有效预防和早期治疗以遏制结核病的流行。

个体遗传背景的不同是导致疾病易感性差异的关键因素,而其中单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)标志物是目前基因组学中最主要的分子标志物之一。snps仅发生单个核苷酸的变化,其发挥功能的方式有很多种,如位于编码区的snps可以通过碱基序列的改变导致蛋白质序列发生改变从而影响蛋白质的功能,或者通过改变核糖体通过mrna特定区域的速度,进而影响翻译动力学,最终导致蛋白质结构和功能的改变;位于基因内含子的snps可以通过影响剪接位点活性发挥功能;而基因调控区的snps通常通过影响启动子或其他转录因子(tf)来调节基因的功能。因此,从snps角度发掘结核病易感性的分子标志物研究具有重要的潜在临床应用价值。



技术实现要素:

本发明的第一目的在于提供一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物,应用于结核病早期筛查中,通过sirt3基因多态性的检测,以预测结核病高危易感人群的发病风险,为早期预防、个体化治疗和我国结核病感染的基因防治工作提供一定的依据。

本发明的第二目的是提供一种snp标志物的检测方法。

本发明的第三目的是提供一种用于结核病易感性预测的检测试剂。

本发明的第四目的是提供一种试剂盒。

本发明的第五目的是提供所述的试剂盒在预测结核病易感性产品中的应用。

本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的,本发明提供了以下技术方案:

本发明提供的一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物,所述snp标志物为sirt3基因的snp位点,所述sirt3基因的snp位点包括rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927中的一个或多个。

本发明还提供了一种所述的snp标志物的检测方法,所述方法包括检测snp标志物在如下snp位点处的基因型:rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927。

本发明还提供了一种用于结核病易感性预测的检测试剂,所述检测试剂用于检测sirt3基因在以下一个或多个snp位点的基因型:rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927。

根据一种优选实施方式,所述检测试剂中包括sirt3基因的一个或多个snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物。

根据一种优选实施方式,所述特异性扩增引物中包括如下snp位点特异性扩增引物序列中的一种或几种:

包括seqidno.1所示的上游引物序列和seqidno.2所示的下游引物序列的snp位点rs511744的特异性扩增引物序列;

包括seqidno.3所示的上游引物序列和seqidno.4所示的下游引物序列的snp位点rs3782118的特异性扩增引物序列;

包括seqidno.5所示的上游引物序列和seqidno.6所示的下游引物序列的snp位点rs7104764的特异性扩增引物序列;

包括seqidno.7所示的上游引物序列和seqidno.8所示的下游引物序列的snp位点rs536715的特异性扩增引物序列;以及

包括seqidno.9所示的上游引物序列和seqidno.10所示的下游引物序列的snp位点rs28365927的特异性扩增引物序列。

根据一种优选实施方式,所述特异性延伸引物中包括如下snp位点特异性延伸引物序列中的一种或几种:

如seqidno.11所示的snp位点rs511744的延伸引物序列;

如seqidno.12所示的snp位点rs3782118的延伸引物序列;

如seqidno.13所示的snp位点rs7104764的延伸引物序列;

如seqidno.14所示的snp位点rs536715的延伸引物序列;以及

如seqidno.15所示的snp位点rs28365927的延伸引物序列。

本发明还提供了一种试剂盒,所述试剂盒内含有前述的用于结核病易感性预测的检测试剂。

根据一种优选实施方式,所述试剂盒内还包括基因组dna提取试剂、pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntps和单碱基延伸反应试剂。

本发明还提供了一种如所述的试剂盒在预测结核病易感性的产品中的应用。

根据一种优选实施方式,所述结核病为活动性结核病。

基于上述技术方案,本发明基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物、检测方法、检测试剂、试剂盒及应用至少具有如下技术效果:

本发明所提供的基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物,snp标志物为包括rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927中的一个或多个的sirt3基因的snp位点。通过检测上述位点的基因型,预测患者的结核病发病风险,如果预测结果显示风险较高,则可以提前进行预防或治疗;如果预测结果显示风险较低,则可继续密切随访。为早期预防、个体化治疗和我国结核病感染的基因防治工作提供一定的指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是sirt3基因的snps图谱和单倍型分析图;

图2是单碱基延伸终止法的原理图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。

本发明的第一目的在于提供一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物,该snp标志物为sirt3基因的snp位点,该sirt3基因的snp位点包括rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927中的一个或多个。

sirt3是一种由sirt3基因编码的依赖nad+的脱乙酰酶,位于线粒体基质中,其基础作用是调节线粒体新陈代谢和能量产生,还可以通过去乙酰化foxo3和增强ros清除能力来保护线粒体免受氧化应激损伤。sirt3基因位于著名的长寿基因区(染色体11p15.5),sirt3基因编码的sirt3的激活是自噬所必需的,可以为被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的线粒体提供保护,通过协调线粒体功能和自噬作用等在抗分枝杆菌反应中发挥重要作用。sirt3缺陷与体内外结核分枝杆菌的感染风险呈高度相关性,并进一步导致线粒体ros产生增加和促炎细胞因子反应。因此,本申请人提供了基于sirt3基因的与结核病易感性相关的snp标志物,包括rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927中的一个或多个的sirt3基因的snp位点,为结核病易感性的早期筛查和诊断提供指导作用。

本发明第二目的在于提供一种前述snp标志物的检测方法,该检测方法包括检测snp标志物在如下snp位点处的基因型:rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927。以便根据snp位点的基因型来确定检测个体结核病发病风险。优选的,针对snp标志物的检测方法还包括但不限于限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性、pcr-aso探针法、pcr-sso法、pcr-ssp法、pcr-荧光法、pcr-dna测序法、直接测序法、pcr指纹图法、基因芯片法、aflp、dgge、rapd和单碱基延伸终止法等检测方法。

本发明的第三目的在于提供一种用于结核病易感性预测的检测试剂,该检测试剂用于检测sirt3基因在以下一个或多个snp位点的基因型:rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927。优选的,检测试剂中包括sirt3基因的一个或多个snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物。

优选的,特异性扩增引物中包括如下snp位点特异性扩增引物序列中的一种或几种:

包括seqidno.1所示的上游引物序列和seqidno.2所示的下游引物序列的snp位点rs511744的特异性扩增引物序列;

包括seqidno.3所示的上游引物序列和seqidno.4所示的下游引物序列的snp位点rs3782118的特异性扩增引物序列;

包括seqidno.5所示的上游引物序列和seqidno.6所示的下游引物序列的snp位点rs7104764的特异性扩增引物序列;

包括seqidno.7所示的上游引物序列和seqidno.8所示的下游引物序列的snp位点rs536715的特异性扩增引物序列;以及

包括seqidno.9所示的上游引物序列和seqidno.10所示的下游引物序列的snp位点rs28365927的特异性扩增引物序列。如下表1所示。

表1sirt3基因的snp位点的特异性扩增引物序列

优选的,特异性延伸引物中包括如下snp位点特异性延伸引物序列中的一种或几种:

如seqidno.11所示的snp位点rs511744的延伸引物序列;

如seqidno.12所示的snp位点rs3782118的延伸引物序列;

如seqidno.13所示的snp位点rs7104764的延伸引物序列;

如seqidno.14所示的snp位点rs536715的延伸引物序列;以及

如seqidno.15所示的snp位点rs28365927的延伸引物序列。如下表2所示。

表2sirt3基因的snp位点的特异性延伸引物序列

上述检测试剂的类型不作任何限定,上述的检测试剂可以是任何能够实现对上述snp位点基因型检测的试剂,其只要能够实现对上述snp位点基因型的检测即可。优选的,上述的检测试剂可以是适用于任何检测方法的试剂,其包括但不限于适用于上述的限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性、pcr-aso探针法、pcr-sso法、pcr-ssp法、pcr-荧光法、pcr-dna测序法、直接测序法、pcr指纹图法、基因芯片法、aflp、dgge、rapd和单碱基延伸终止法等检测方法。

本发明的第四目的在于提供一种试剂盒,该试剂盒内含有前述的用于结核病易感性预测的检测试剂。优选的,试剂盒内还包括基因组dna提取试剂、pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntps和单碱基延伸反应试剂。以便采用单碱基延伸终止法检测上述snp位点的基因型。

本发明的第五目的在于提供一种如所述的试剂盒在预测结核病易感性的产品中的应用。优选的,该结核病为活动性结核病。

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本实施例1提供了对结核病易感性相关snp位点的挖掘过程。

1.1、中国西部结核病人群及健康对照者的纳入。

连续纳入2014年1月至2016年2月在四川大学华西医院就诊的900名结核病患者和1534名健康对照者。根据世界卫生组织指南(2018年),900名结核病患者900例合格病例由经验丰富的专家根据微生物学(培养/抗酸染色/tb-dna)、医学影像学、抗结核治疗反应或结核病组织病理学证据确定诊断。

结核病例的纳入排除标准如下:

纳入标准:1)具有典型的结核病症状和体征;2)抗酸染色涂片阳性或结核分枝杆菌培养阳性或核酸检测阳性;3)影像学资料显示典型的活动性结核病变证据;4)病理学结果支持结核病变;5)结核菌素皮肤试验中度阳性或强阳性;6)γ-干扰素释放试验阳性;7)抗结核治疗有效,综合考虑以上条件纳入临床诊断活动性结核病的患者。

排除标准:(1)hiv/hbv/hcv病毒感染;(2)合并其他呼吸道疾病,如肺部感染和慢性阻塞性肺疾病;(3)合并自身免疫性疾病或既往接收免疫抑制剂或免疫增强剂治疗等。

健康对照者来自华西医院体检中心,全血细胞计数和肝功能检查正常,结核相关检查(医学影像学和γ-干扰素释放试验)阴性,无结核病史,家庭成员中没有结核患者。

1.2、研究群体的基本资料与临床实验室数据。

本研究课题共纳入中国西部汉族900例活动性结核病患者和1534名健康对照者。研究对象的人口特征如表3所示:病例组中男性542例,女性358例;平均年龄42.51±18.11岁。对照组男性821人,女性713人;平均年龄37.96±11.07岁。经统计学检验,病例组与健康对照组年龄、性别分布均有显著性差异(p<0.05)。因此,在随后的分析中使用年龄和(或)性别作为协变量进行logistic回归分析。

表3研究对象人口学和临床资料特征

1.3、与结核病易感性相关的snps位点的发现。

sirt3基因在中国北京汉族人中的单核苷酸多态性(snps)原始数据来源于在线数据库(1000genomesproject,https://www.internationalgenome.org/),并用haploview软件4.2版排序(hardy-weinbergp截断值=0.01,最小等位基因频率>0.05)。然后使用haploviewv4.2从重新排序的snp中筛选r2阈值≥0.8的snp作为tagsnp。最后通过dbsnp数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)从东亚人群中筛选出最小等位基因频率(maf)>0.15的5个snp(rs511744、rs3782118、rs7104764、13rs536715和rs28365927)。5个snp位点的基因型分布在本研究队列中均符合哈迪温伯格平衡(hardy-weinberg,hwe)(hwe,p>0.05),具体情况见图1和表4。其中,如图1所示,图1示出了sirt3基因的snps图谱和单倍型分析示意图。图1显示sirt3位于11号染色体215,030-236,931(两条切线之间),绿色区域(即图1中的灰色区域)代表共同编码序列(ccds)集合,其他区域代表调控和内含子。下面是sirt3基因的5个snps的连锁不平衡(ld)。不同snps之间的连锁不平衡程度用r2值和逐渐加深的红色表示。所有snp对的r2值显示为百分比。当snp间完美连锁时,r2值等于1。

表4候选snps信息

1.4、snp遗传模型与结核病易感性的相关性。

基因型分布总体结果显示,snprs3782118(a>g)与结核病易感性相关,结果见表5。结核病例组和健康对照组的rs3782118的最小等位基因(a)频率分别为30.44%和33.31%,等位基因(a)与结核病的低易感性相关(p=0.039,or=0.876,95%ci:0.773-0.993)。然而,这种显著性差异在bonferroni校正后变弱(p=0.195)。就基因型分布而言,rs3782118的aa和ag基因型同样是结核病发病风险的保护性因素(p=0.006,pbonferroni=0.032)。其余4个snp(rs511744、rs7104764、rs536715和rs28365927)与结核病无明显相关性(p值均>0.05)。

表5sirt3中5个snp的等位基因和基因型频率

备注:p*为p值采用卡方检验计算。

pbonf:p值经bonferroni校正。

为进一步探索sirt3基因的5个snps基因型分布与结核病易感性之间的关系,我们通过遗传模型对其进行了分析,遗传模型包括加性模型、显性模型和隐性模型,结果见表6。显性模型分析发现snprs3782118与结核病发病风险呈显著相关性(or=0.787,95%ci:0.666-0.931,p=0.005),经bonferroni校正后,p值为0.026。与此同时,在遗传模型分析中,其余4个snp(rs511744、rs7104764、rs536715和rs28365927)仍显示与结核病没有相关性。

表6snp位点的不同遗传模型与结核病易感性的关联

此外,单倍型构建结果显示单倍型agaag与结核病风险的增加呈显著相关性,结果见表7。图1中的ld作图表明所有5个snp都为低ld(r2<0.8)。

表7单倍型分析

1.5、分层分析。

为了进一步评估sirt3基因多态性与结核病易感性的关系,我们基于年龄和性别2个亚组对其进行了分析,结果见表8-10。我们发现rs3782118的aa和ag基因型在青年组(年龄<40岁,p=0.017)和女性组(p=0.018)中是结核病发病的保护性因素,尽管两者在bonferroni校正(pbonferroni=0.083和0.091)中被减弱。此外,我们在显性模型分析中发现rs3782118与女性组的低结核病易感性相关(p=0.003,pbonferroni=0.016,or=0.678,95%ci:0.523-0.878)。经bonferroni校正后的减弱趋势与青年组rs3782118相似(p=0.021,pbonferroni=0.105,or=0.744,95%:ci0.579-0.956)。

表8分层分析

表9年龄亚组分析结果

表10性别亚组分析结果

1.6、snprs3782118在电子计算机分析中的应用。

为进一步研究结核病低易感性相关的非编码基因突变体rs3782118的潜在功能,我们通过在线生物信息学数据库对其进行了分析,结果见表11、12。通过在线工具haploreg4.1,我们搜索到ld阈值r2>0.8的18个snp(rs56232710、rs1045454、rs56357554、rs3782120、rs7930823、rs6598075、rs58692051、rs4029256、rs2293167、rs76552490、rs1533825、rs6598074、rs6598072、rs65980),通过将群体设置为亚洲人群来进一步筛选位点,最终将rs7930823、rs3782118、rs3782116和rs3782115四者放入注释池中。全基因组分析结果表明,rs7930823是位于sirt3基因上游的bet1l基因内含子变异,其余3个snps(rs3782118、rs3782116和rs3782115)在sirt3基因的不同转录本中常作为3个主要的utr变异、nmd转录变异或内含子变异。4个snp均未发现与基因表达相关,但其中3个(rs7930823、rs3782116和rs3782115)却被预测为启动子区域和开放染色质区域的调节区变体,并负责改变基序。

表11rs3782118及其强关联的snp(r2>0.80)的haploreg功能分析结果

表12亚洲人群rs3782118及其强关联的snp(r2>0.80)的数据库计算机功能分析结果

实施例2

本实施例提供了检测rs511744、rs3782118、rs7104764、13rs536715和rs28365927位点基因型的方法,该方法为小测序,即单碱基延伸终止法。其原理见图2,如下:在一个含有测序酶,四种荧光标记的ddntps,紧挨多态位点5’或3’端的不同长度延伸引物和pcr产物模板的反应体系中,引物延伸一个碱基即终止,最后通过abi3730毛细管电泳读取荧光信号,根据峰的颜色即可知道掺入的碱基种类,从而确定该位点基因型,同时利用多重pcr技术,对多个已知位点进行检测。

sirt3基因上的rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs2836592五个snp位点所在部分核苷酸序列见下表13。

表13sirt3的五个snp位点所在的核苷酸序列

表中下划线表示snp位点。

本实施例提供的采用单碱基延伸终止法检测上述snp位点基因型的方法,具体步骤如下:

2.1、根据表13中序列,提供特异性扩增5个snp位点核苷酸序列的引物序列,见表14。

表145个snp位点的孔增引物序列

2.2、配制pcr延伸扩增的反应体系

用热启动taq酶,以提取自待预测风险的结核病患者的基因组dna为模板进行pcr扩增;扩增反应体系:总体积为20μl;体系组成如下:

2.3、pcr扩增,条件如下:

(95℃5min)×1个循环,(94℃10s,55℃40s,72℃30s)×25个循环,4℃5min。

2.4、pcr产物电泳

用1%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下扫描并拍照,切胶纯化回收。

2.5、纯化

pcr产物用sap(phosphatasealkalineshrimp)和外切酶i(exonucleasei,exoi)进行纯化处理,去除多余的引物和dntp,纯化条件如下:

2usap,1uexoi,5ulpcr产物,在37℃下孵育80min,75℃、15min灭活酶活性。

2.6、单碱基延伸反应

提供单碱基延伸扩增的引物,引物的3’末端位于snp位点的上游第一个碱基处,产物长度范围在20bp左右,引物序列见表15。

表155个snp位点的单碱基测序引物

2.6.1、单碱基延伸反应体系:

2.6.2、单碱基延伸反应条件:

(96℃1min)×1个循环;(96℃10s,70℃60s)×30个循环。

2.6.3、反应结束后,用sap酶处理:产物+1usap在37℃孵育60min,75℃孵育15min后纯化处理。

2.7、荧光信号检测

获得的产物经abi3100-xl基因分析仪毛细管电泳法检测荧光信号,通过genemapper软件分析确定snp位点,通过不同的荧光检测结果确定检测snp位点处碱基变化确定基因型。

2.8、结果预测:

如果rs3782118位点基因型为aa(纯合突变型)或ag(杂合突变型),预示该个体结核病发病风险较低。如果为单倍型agaag(rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715、rs28365927),其中包括rs3782118的主要等位基因g,则预示该个体的结核病发病风险较高。另外,在女性受试者个体中,snprs3782118预示着较低结核病易感性。

综上,本发明基于sirt3基因上snp位点即rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927所形成的单倍型均与结核病易感性相关。具体地,相较于rs3782118位点基因型为gg(野生型)时,当rs3782118位点基因型为aa(纯合突变型)或ag(杂合突变型),预示该个体结核病发病风险较低。另外,单倍型agaag(rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715、rs28365927)预示该个体的结核病发病风险较高,其中包括rs3782118的主要等位基因g。另外,女性受试者个体中,snprs3782118预示着较低结核病易感性。因此,基于本发明研究的内容,通过检测结核病患者rs511744、rs3782118、rs7104764、rs536715和rs28365927位点的基因型,可以为该患者的结核病发病风险预测,如果预测结果显示风险较高,则建议提前进行预防或治疗,如果预测结果显示风险较低,则可继续密切随访。

以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>四川大学华西医院

<120>一种基于sirt3基因与结核病易感性相关的snp标志物、检测试剂、试剂盒及应用

<130>2020.11.05

<141>2020-11-05

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

cacggcctcggtcaagc17

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工合成()

<400>2

ttttccctatatcgcaggctct22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工合成()

<400>3

tgccagccggtgattacctac21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工合成()

<400>4

ctgaagtttgagaggactccg21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工合成()

<400>5

cagaactatacacaagagcag21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工合成()

<400>6

tcgccttgtagcttgtgtt19

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工合成()

<400>7

gctcatggaacctttgcc18

<210>8

<211>20

<212>dna

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