具有抗炎、抗血小板凝集及免疫抑制活性的吡啶-2-甲酸衍生物Ⅱ及其应用的制作方法

本发明涉及一种化合物，更具体的讲涉及具有免疫抑制活性的吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ及其应用。

技术背景

传统中医在临床长期辨症施治的过程中，发现卫矛科雷公藤属植物用于风湿痹证的治疗具有悠久历史，其性味苦、寒，有毒，具祛风除湿、舒筋活络、清热解毒的功效，是临床上重要的免疫抑制剂，在类风湿性关节炎、原发肾病综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗中具有重要作用。

雷公藤属(tripterygium)植物主要包含昆明山海棠(tripterygiumhypoglaucum(levl.)hutch)、东北雷公藤(tripterygiumregelⅱspragueettakeda)和雷公藤(tripterygiumwilfordⅱhook.f.)三种。根据国家药品监督管理局官方网站统计数据显示，目前国内有43家药品生产企业的45种雷公藤属药材的相关制剂上市。雷公藤属植物化学成分主要包含倍半萜生物碱类、二萜类及三萜类等成分。其中雷公藤总生物碱含量约0.07-0.29％，该类成分在免疫抑制作用方面具有重要作用。倍半萜生物碱结构特征为为二氢呋喃型倍半萜，已报道结构主要包含wilfordate/evoninate、hydroxy-wilfordate/evoninate和iso-wilfordate/evoninate三种类型共71种。雷公藤倍半萜生物碱是一类含氧量较高的倍半萜类化合物，结构特征为含有特殊的大环双内酯骨架结构，包含2-(羧烷基)烟酸(2-(carboxyalkyl)nicotinicacid)和多羟基-二氢-贝塔-琼香呋喃倍半萜(polyoxygenateddihydro-beita-agarofuransesquiterpenoid)两部分。倍半萜部分的羟基通常由各种有机酸进行酯化，包括乙酸、苯甲酸、呋喃酸、烟酸和脂肪酸；2-(羧烷基)烟酸部分主要来源于炔酸、维生素酸、羟基维生素酸或其同系物，同时2-(羧烷基)烟酸部分的差异是大环双内酯骨架结构存在差异的核心，也是雷公藤生物碱化学成分结构多样性的核心。

传统中医在临床长期辨症施治的过程中发现，卫矛科雷公藤属植物用于风湿痹证的治疗具有确切疗效，其性味苦、寒，有毒，具祛风除湿、舒筋活络、清热解毒的功效，在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗中具有重要作用。雷公藤药材治疗类风湿性关节炎的机制与炎症发生和t细胞免疫调控的关键靶标密切相关。昆明山海棠给与类风湿性关节炎治疗一周后，其对佐剂性关节炎模型大鼠的继发性足肿胀度及关节炎指数均有明显的抑制作用；对血清中的促炎因子il-1α、il-1β及功能蛋白mmp3的浓度有明显降低作用，对血清中的抑炎因子il-4、il-10的浓度有明显的升高作用；给药三周后，调节性t细胞(tregs)占t淋巴细胞的比例明显较模型组高，其治疗作用明显显现。针对雷公藤属中药材中的免疫抑制活性成分的研究，申请人进行深入系统的研究，所述研究先后通过国家即省级科研项目投入资金1500余万元；相关课题分别是：科技部国家重大新药创制科技专项：蒿藤祛风胶囊治疗类风湿的新药研究(项目编号：2017zx09101002-002-004)；重庆市卫生局项目：“火把花根片大品种技术提升与适应症拓展研究(项目编号：cstc2013jcsf10011)”，重庆市科技局项目：”火把花根片大品种产业化推广与提升”(项目编号：cstc2014jcsf10001)，重庆市科技局项目：“基于中药代谢组学的火把花根片用于类风湿性关节炎的免疫抑制的作用机制研究”(项目编号：2015cstc-jbky-01913)；重庆市科技局项目：雷公藤次碱在beagle犬体内的代谢动力学研究(项目编号：cstc2018jxjl130055)。

技术实现要素：

在上述现有技术的基础上，本发明提供了一种具有免疫抑制活性的吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ，其结构通式为：

所述结构式为：

所述结构式为：

所述的一种雷公藤属具有免疫抑制活性的吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ在制备治疗类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病中的应用。

所述的种雷公藤属具有抗癌活性的吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ在制备治疗抗肝脏肿瘤药物中的应用。

所述的种雷公藤属具有降糖活性的吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ在制备治疗抗ⅱ型糖尿病药物中的应用。

所述的雷公藤属具有抗血小板凝集活性的吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ在制备抗血小板凝集等疾病中的应用。

本发明的有益技术效果是：本发明提供的烟酸类化合物具有良好的免疫抑制活性及抗肝脏肿瘤活性和抗ⅱ型糖尿病的活性，且选择性强，具有良好的临床应用价值。

附图说明

图1吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ-1的¹h-nmr图谱；

图2吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ-1的esi-ms图谱；

图3吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ-2的1h-nmr图谱；

图4吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ-2的esi-ms图谱；

图5吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ化合物的抗ra活性；

图6吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的抗炎活性；

图7吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的抗血小板凝集活性；

图8吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ与5lyw对接结果；

图9吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ与6ⅱv对接结果；

图10吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ与2uzq对接结果。

具体实施方式

实施例1吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的制备方法

昆明山海棠根皮粉碎，称取药材粉末1kg，置于5000ml圆底烧瓶中，分别加水3000ml、2000ml体积回流提取，每次提取前浸泡60min，并分别回流提取60min；合并两次提取液后浓缩至膏状，浸膏以少量水稀释，分别用1.5倍、1倍、0.5倍乙酸乙酯萃取。①取乙酸乙酯层合并后回收有机相；浸膏蒸干取5g，纯甲醇7.5ml溶解后，加0.4mol/l的naoh甲醇溶液2.5ml，60℃水浴恒温反应4h，反应液蒸干甲醇，10ml水稀释后2倍量乙酸乙酯萃取3次，取水层蒸干。取水层湿法上柱过c18柱，以5％甲醇水自然流速洗脱，分段截取洗脱液，以lc-ms监测洗脱液组分。②水层浓缩至浸膏，少量水溶解，过聚酰胺柱。5倍柱体积水淋洗，收集洗脱液，蒸干，少量水复溶后，加入3倍量95％乙醇搅拌30min，离心取上清，蒸干，5％甲醇溶解后制备液相分离，以15％甲醇水为流动相洗脱，分段收集洗脱液，并以lc-ms监测洗脱液组分。

实施例2异烟酸衍生物ⅱ的制备方法

昆明山海棠根皮粉碎，称取药材粉末1kg，置于5000ml圆底烧瓶中，取80％的乙醇溶液分别以3000ml、2000ml体积回流提取，每次提取前浸泡60min，并分别回流提取60min，ph调节至4.0；合并两次提取液后回收乙醇，浸膏以少量水稀释，分别用1.5倍、1倍、0.5倍乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层合并后回收有机相；浸膏蒸干取5g，纯甲醇7.5ml溶解后，加0.4mol/l的naoh甲醇溶液2.5ml，60℃水浴恒温反应4h，反应液蒸干甲醇，10ml水稀释后2倍量乙酸乙酯萃取3次，取水层蒸干。取水层湿法上柱过c18柱，以5％甲醇水自然流速洗脱，分段截取洗脱液，以lc-ms监测洗脱液组分。

将上述合成获得的吡啶-2-甲酸衍生物进行¹h-nmr化学结构分析和esi-ms化学结构分析，具体结果见附录。

实施例3吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ化合物的抗ra活性考察

①药物浓度毒性试验将ra-flss细胞(成纤维样滑膜细胞)用含10％fbs和1％双抗的dmem培养基，于37℃、5％co2的培养箱中进行培养，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔150μl；培养24h后，加入不同浓度的待测样品200μl，继续培养至所需时间；弃上清，加入80μl的新鲜培养液，再加入20μlmtt溶液，继续培养3h；弃上清，每孔加入100μl二甲基亚砜，置于摇床上低速震荡10min后，在570处测定各孔的吸收值，计算细胞活力。②抗ra活性检测将ra-flss细胞传代铺于六孔板，分为3组，对照pbs组、待测分子组、待测分子+pbs组，加药后培养12h提取细胞rna，逆转录后，进行rt-pcr分析，检测检测各实验组细胞中炎症因子(il-6、il-8、mcp-1、tnf-α)及转录调控因子(pparγ)的转录表达水平的变化。结果如图5所示。

实施例4吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的抗炎活性考察

将巨噬细胞传代铺于六孔板，分为3组，对照pbs组、待测分子组、待测分子+pbs组，加药后培养12h提取细胞rna，逆转录后，进行rt-pcr分析，检测检测各实验组细胞中炎症因子(il-6、il-8、mcp-1、tnf-α)及转录调控因子(pparγ)的转录表达水平的变化。结果如图6所示。

实施例5吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的抗血小板凝集活性考察

采用born氏比浊法，测试7个目标化合物对二磷酸腺苷(adp)诱导的家兔血小板聚集的抑制活性。家兔心脏取血，用体积分数3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝，以1000r/min离心10min，制备富血小板血浆(prp)，剩余部分以3000r/min离心15min，制备贫血小板血浆(ppp)，按比浊法进行血小板聚集活性验。测定管中加入280μlprp和10μl不同浓度(1000、500、200、100、10μmol/l)的受试化合物，温孵5min，再加入10μladp(终浓度10μmol/l)为诱导剂，观察记录5min内最大血小板聚集率，每个浓度平行测定。结果如图7所示。

实施例6吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的分子对接分析

反向对接靶标是从以下三个来源收集的：disgenetdatabase(https://www.disgenet.org/,v6),onlinemendelianinheritanceinman(omim)database(http://www.omim.org/,updatedonjune26,2020),andgenecardsdatabase(https://www.genecards.org/,updatedonmarch11,2020)。

为了验证候选靶标与化合物的结合亲和力，使用discoverystudio16.1(ds16.1)的libdock程序中实现模拟分子对接。如表1所示，从rcsb蛋白数据库直接下载候选靶标的所有晶体结构(http://www.pdb.org/,updatedonjune2020)并检查分辨率，除共结晶的配体和结构水分子，将每种蛋白质定义为受体，并使用discoverystudio工具在受体腔中发现蛋白质的活性位点，随后，使用libdock执行对接协议，以显示discoverystudio中的组件与差异蛋白之间的相互作用。由于libdock可以提供10-100个预测的libdock分数，并且每种结合蛋白在蛋白质结合口袋中的位置都不同，因此我们仅考虑了最佳的libdock分数。得分最高的蛋白质被认为是假定的复合靶标。结果如图8、9、10所示。

表1吡啶-2-甲酸衍生物ⅱ的靶点反向对接分析