[0001]
本发明属于分离提纯技术领域，涉及一种脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，具体涉及一种脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法。
背景技术：
[0002]
脱氧核糖核苷酸是组成dna结构的基本单位，脱氧核糖核苷三磷酸即dntp，是deoxy-ribonucleosidetriphosphate的缩写，在dna的应用中具有广泛的应用。dntp 的制备研究曾有不少报道，如chemical abstract88，117297；chemical abstract89，180281；acta.biochim.biophys.acad.sci.hung.16，131-3(1981)。但大部分合成方法得到的混合物的后续分离提纯比较困难，为了得到纯度较高的目标产物甚至有些竟然使用毒性较大的有机溶剂。
[0003]
目前，公开号为cn1269422a的发明专利公开了一种脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其采用酶解、酶促、化学合成全新工艺得到相应的dntp，采用层析法纯化分离，层析条件为色层柱150
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1000mm，100-200目阴离子交换树脂，解析液0.01n 盐酸，流速200-250毫升/分钟，最终可以得到纯度为95%的dntp。
[0004]
现有的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法存在以下主要缺陷：（1）采用层析法，方法复杂，分离条件需要严格监控，收率不高；（2）纯度再难提升。
技术实现要素：
[0005]
本发明针对以上不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法。本发明可以实现以下发明目的：（1）本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，突破传统的采用离子交换树脂分离提纯，方法更简单高效，得到的脱氧核糖核苷三磷酸收率得以提高；（2）本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，得到的脱氧核糖核苷三磷酸纯度好。
[0006]
为解决上述技术问题，采用以下技术方案：本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，包括混合沉降剂溶液的制备、超声沉降、冷冻离心和盐析。
[0007]
以下方案是对本发明技术方案的优化：所述混合沉降剂溶液，氯化钠质量百分含量0.1-3wt%，乙醇质量百分含量为75-90%，溶剂为去离子水。
[0008]
所述混合沉降剂溶液的制备方法为：（1）称取：按重量百分比关系称取去离子水、乙醇和氯化钠，备用；（2）制氯化钠溶液：将占总质量三分之二的氯化钠加入去离子水，加热升温至30-40℃，在1000-1200rad/min搅拌条件下恒温溶解获得氯化钠溶液，30-40℃恒温12-20min后冷却至室温，备用；
（3）混搅：向步骤（2）中制得的氯化钠溶液中缓慢注入乙醇，同时进行搅拌，温度在20-30℃时，通过水浴恒温箱保持温度在20-30℃，保持20-40min后，将温度提高至35-45℃，将剩余的氯化钠添加至其中，继续搅拌，待内部溶液搅拌均匀，即获得混合沉降剂溶液。
[0009]
所述超声沉降，超声处理，超声频率25-35khz，处理时间为3-7min。
[0010]
所述超声沉降，脱氧核苷三磷酸混合液的加入量为5-15wt%，温度控制7-12℃下进行初步沉降，当出现白色固体时保持该温度，调整超声频率15khz下处理1-3min。
[0011]
所述冷冻离心，离心力大小设置为2300-2500g，离心的时间为7-11min。
[0012]
所述冷冻离心，将混合液置于-5至0℃下冷冻离心。
[0013]
所述盐析，向抽离后得到的固体中加入5-8倍固体质量的去离子水混合，常温下加入固体氯化钠至氯化钠达到饱和为止，加入的同时不停止搅拌，搅拌速率为180-220rad/min。
[0014]
所述氯化钠，有效成分含量99.7%，水不溶物≤0.005%，总氮量≤0.001%所述分离提纯方法，得到的脱氧核糖核苷三磷酸收率提高，收率82.1-86.5%。
[0015]
本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，包括以下步骤：步骤一、混合沉降剂溶液的制备本发明所述的混合沉降剂溶液，氯化钠质量百分含量0.1-3wt%，乙醇质量百分含量为75-90%，溶剂为去离子水。
[0016]
其制备方法为：（1）称取：按重量百分比关系称取去离子水、乙醇和氯化钠，备用；所述氯化钠，有效成分含量99.5%，水不溶物≤0.005%，总氮量≤0.001%；（2）制氯化钠溶液：将占总质量三分之二的氯化钠加入去离子水，加热升温至35℃，在1000rad/min搅拌条件下恒温溶解获得氯化钠溶液，35℃恒温15min后冷却至室温，备用；（3）混搅：向步骤（2）中制得的氯化钠溶液中缓慢注入乙醇，同时进行搅拌，温度在25℃时，通过水浴恒温箱保持温度在25℃，保持30min后，将温度提高至40℃，将剩余的氯化钠添加至其中，继续搅拌，待内部溶液搅拌均匀，即获得混合沉降剂溶液。
[0017]
步骤二、超声沉降将反应后的脱氧核苷三磷酸混合液加入混合沉降剂溶液中，同时开启超声处理，超声频率30khz，处理时间为5min；脱氧核苷三磷酸混合液（采用高效液相色谱仪测定四种脱氧核苷三磷酸的总质量m1）的加入量为5-15wt%，控制温度保持在7-12℃下进行初步沉降，当出现白色固体时保持该温度，调整超声频率15khz下继续超声处理1-3min。
[0018]
所述脱氧核苷三磷酸混合液，为采用酶解法制备脱氧核苷三磷酸得到的脱氧核苷三磷酸混合液。
[0019]
步骤三、冷冻离心将上述混合液置于-5至0℃下冷冻离心，离心力大小设置为2300g-2500g，离心的时间为7-11min，离心温度-5至0℃，抽出离心后的得到的固体。
[0020]
步骤四、盐析向抽离后得到的固体中加入5-8倍固体质量的去离子水混合，常温下加入固体氯化钠至氯化钠达到饱和为止，加入的同时不停止搅拌，搅拌速率为180-220rad/min，在2min内加入完毕。再次冷冻静置，得到提纯的脱氧核苷三磷酸m2。
[0021]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：(1)本发明脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，突破传统的采用离子交换树脂分离提纯，方法更简单高效，得到的脱氧核糖核苷三磷酸收率得以提高，收率82.1-86.5%，超过82%；(2) 本发明脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，得到的脱氧核糖核苷三磷酸纯度好，纯度大于99.0%。
具体实施方式
[0022]
实施例1一种脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，包括以下步骤：步骤一、混合沉降剂溶液的制备本发明所述的混合沉降剂溶液，氯化钠质量百分含量1.3wt%，乙醇质量百分含量为75%，溶剂为去离子水。
[0023]
其制备方法为：（1）称取：按重量百分比关系称取去离子水、乙醇和氯化钠，备用；（2）制氯化钠溶液：将占总质量三分之二的氯化钠加入去离子水，加热升温至35℃，在1000rad/min搅拌条件下恒温溶解获得氯化钠溶液，35℃恒温15min后冷却至室温，备用；（3）混搅：向步骤（2）中制得的氯化钠溶液中缓慢注入乙醇，同时进行搅拌，温度在25℃时，通过水浴恒温箱保持温度在25℃，保持30min后，将温度提高至40℃，将剩余的氯化钠添加至其中，继续搅拌，待内部溶液搅拌均匀，即获得混合沉降剂溶液。
[0024]
步骤二、超声沉降将反应后的脱氧核苷三磷酸混合液（采用高效液相色谱仪测定四种脱氧核苷三磷酸的总质量m1）加入特定量的混合沉降剂溶液中，同时开启超声处理，超声频率30khz，处理时间为5min；脱氧核苷三磷酸混合液的加入量为总质量的15wt%，控制温度保持在7℃下进行初步沉降，当出现白色固体时保持该温度，调整超声频率15khz下继续超声处理2min。
[0025]
所述脱氧核苷三磷酸混合液，为采用酶解法制备脱氧核苷三磷酸得到的脱氧核苷三磷酸混合液。
[0026]
步骤三、冷冻离心将上述混合液置于-1至0℃下冷冻离心，离心力大小设置为2500g，离心的时间为10min，离心温度-1至0℃，抽出离心后的得到的固体。
[0027]
步骤四、盐析向抽离后得到的固体中加入8倍固体质量的去离子水混合，常温下加入固体氯化钠至氯化钠达到饱和为止，加入的同时不停止搅拌，搅拌速率为220rad/min，在2min内加入完毕。再次冷冻静置，得到提纯的脱氧核苷三磷酸m2。由m1、m2计算收率，收率为85.4%。
[0028]
经高效液相色谱仪分析，经提纯的脱氧核苷三磷酸的纯度为99.0%。
[0029]
实施例2一种脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，包括以下步骤：步骤一、混合沉降剂溶液的制备本发明所述的混合沉降剂溶液，氯化钠质量百分含量2.5wt%，乙醇质量百分含量为
85%，溶剂为去离子水。
[0030]
所述氯化钠，有效成分含量99.7%，水不溶物≤0.005%，总氮量≤0.001%。
[0031]
其制备方法为：（1）称取：按重量百分比关系称取去离子水、乙醇和氯化钠，备用；（2）制氯化钠溶液：将占总质量三分之二的氯化钠加入去离子水，加热升温至35℃，在1100rad/min搅拌条件下恒温溶解获得氯化钠溶液，35℃恒温17min后冷却至室温，备用；（3）混搅：向步骤（2）中制得的氯化钠溶液中缓慢注入乙醇，同时进行搅拌，温度在28℃时，通过水浴恒温箱保持温度在28℃，保持25min后，将温度提高至38℃，将剩余的氯化钠添加至其中，继续搅拌，待内部溶液搅拌均匀，即获得混合沉降剂溶液。
[0032]
步骤二、超声沉降将反应后的脱氧核苷三磷酸混合液（采用高效液相色谱仪测定四种脱氧核苷三磷酸的总质量m1）加入同实施例1等质量的混合沉降剂溶液中，同时开启超声处理，超声频率30khz，处理时间为6min；脱氧核苷三磷酸混合液的加入量为12wt%，控制温度保持在10℃下进行初步沉降，当出现白色固体时保持该温度，调整超声频率15khz下继续超声处理3min。
[0033]
所述脱氧核苷三磷酸混合液，为采用酶解法制备脱氧核苷三磷酸得到的脱氧核苷三磷酸混合液。
[0034]
步骤三、冷冻离心将上述混合液置于-5至-4℃下冷冻离心，离心力大小设置为2300g，离心的时间为8min，离心温度-5至-4℃，抽出离心后的得到的固体。
[0035]
步骤四、盐析向抽离后得到的固体中加入5倍固体质量的去离子水混合，常温下加入固体氯化钠至氯化钠达到饱和为止，加入的同时不停止搅拌，搅拌速率为200rad/min，在3min内加入完毕。再次冷冻静置，得到提纯的脱氧核苷三磷酸m2。由m1、m2计算收率，收率为86.5%。
[0036]
经高效液相色谱仪分析，经提纯的脱氧核苷三磷酸的纯度为99.4%。
[0037]
实施例3一种脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法本发明的脱氧核糖核苷三磷酸的分离提纯方法，包括以下步骤：步骤一、混合沉降剂溶液的制备本发明所述的混合沉降剂溶液，氯化钠质量百分含量1.4wt%，乙醇质量百分含量为90%，溶剂为去离子水。
[0038]
其制备方法为：（1）称取：按重量百分比关系称取去离子水、乙醇和氯化钠，备用；（2）制氯化钠溶液：将占总质量三分之二的氯化钠加入去离子水，加热升温至32℃，在900rad/min搅拌条件下恒温溶解获得氯化钠溶液，32℃恒温18min后冷却至室温，备用；（3）混搅：向步骤（2）中制得的氯化钠溶液中缓慢注入乙醇，同时进行搅拌，温度在30℃时，通过水浴恒温箱保持温度在30℃，保持25min后，将温度提高至40℃，将剩余的氯化钠添加至其中，继续搅拌，待内部溶液搅拌均匀，即获得混合沉降剂溶液。
[0039]
步骤二、超声沉降将反应后的脱氧核苷三磷酸混合液（采用高效液相色谱仪测定四种脱氧核苷三磷酸的总质量m1）加入同实施例1等质量的混合沉降剂溶液中，同时开启超声处理，超声频率
30khz，处理时间为5min；脱氧核苷三磷酸混合液的加入量为12wt%，控制温度保持在11℃下进行初步沉降，当出现白色固体时保持该温度，调整超声频率15khz下继续超声处理3min。
[0040]
所述脱氧核苷三磷酸混合液，为采用酶解法制备脱氧核苷三磷酸得到的脱氧核苷三磷酸混合液。
[0041]
步骤三、冷冻离心将上述混合液置于-3至-2℃下冷冻离心，离心力大小设置为2400g，离心的时间为8min，离心温度-3至-2℃，抽出离心后的得到的固体。
[0042]
步骤四、盐析向抽离后得到的固体中加入7倍固体质量的去离子水混合，常温下加入固体氯化钠至氯化钠达到饱和为止，加入的同时不停止搅拌，搅拌速率为225rad/min，在2min内加入完毕。再次冷冻静置，得到提纯的脱氧核苷三磷酸m2。由m1、m2计算收率，收率为82.1%。
[0043]
经高效液相色谱仪分析，经提纯的脱氧核苷三磷酸的纯度为99.1%。
[0044]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0045]
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数，本发明所述的比例，均为质量比例。
[0046]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。