一种低固含量底物逐次吸附提高纤维素酶回收利用率的方法与流程

本发明属于木质纤维素酶解技术领域，也属于工业生物技术领域，特别涉及一种低固含量底物逐次吸附提高纤维素酶回收利用率的方法。

背景技术：

利用富含纤维素和半纤维素的木质纤维原料生产燃料乙醇是发展绿色、可持续能源最具潜力的生产路线之一。纤维素酶是木质纤维素转化为糖平台化合物过程的催化剂，然而，因其活力低、耗量大和成本高等特点，已成为纤维素乙醇商业化进程的主要障碍。大部分纤维素酶在转化完后仍然具有活性，可以通过多种途径进行回收和循环利用，从而降低用酶成本。因此，纤维素酶高效回收再用工艺的开发强化，有利于大幅降低纤维素酶成本，已成为解决这一问题的重要途径。

重吸附法回收纤维素酶工艺简单、设备要求低、适于大规模操作，具有广阔的工业化前景。在利用新鲜物料重吸附方法中，已有的报道几乎都是加入与首轮水解相同质量的底物来回收水解液中的游离酶，完成重吸附后再经固液分离，进一步补充缓冲液进入第二轮水解或同步糖化发酵过程。由于乙醇蒸馏经济性要求，在生物质转化中要求底物固含量要大于10%。而利用大量新鲜物料重吸附游离酶，其固液分离过程需要更长时间和大量能耗，更重要的是会吸附携带较多的产物糖或乙醇进入第二轮反应中，从而对第二轮的生物转化产生较严重的抑制现象。因此，低固体含量底物回收纤维素酶作为一种新型便捷的酶回收方法，大大提高了操作便捷性，有望用于实际工业过程。

技术实现要素：

【要解决的技术问题】

针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提出一种更加简便、高效的纤维素酶回收方法，以提高纤维素酶的利用率，降低生物乙醇生产过程中纤维素酶的成本，有望用于实际工业过程。

【本发明的技术方案】

一种低固含量底物逐次吸附提高纤维素酶回收利用率的方法，操作步骤如下：

步骤一：将柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶液混合，得到含有纤维素酶的混合溶液；

步骤二：向步骤一得到的混合溶液中加入新鲜纤维素底物，进行吸附实验，得到吸附结束后的混合液；

步骤三：将步骤二得到的混合液进行固液分离，分离得到的液相被用于非吸附蛋白质浓度分析。

优选地，步骤一中含有纤维素酶的混合溶液制备如下进行：将ph值为4.8的10~100mm柠檬酸钠缓冲液和0.1~1fpu/ml纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中。

优选地，步骤二中吸附结束后的混合液制备如下进行：将新鲜纤维素底物avicelph-101（固含量为1%~15%）添加到上述溶液中，吸附实验在温度4~25℃、转速0~200rpm的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，吸附时间为30~180min。

优选地，步骤三中固液分离是利用减压过滤的方式将上步所得溶液通过玻璃超纤维滤纸（whatman1821-025），固体被过滤掉，液相采用考马斯亮蓝染色法进行非吸附蛋白质浓度分析。

优选地，固含量为1%~15%的所述新鲜纤维素底物是通过一次性加料或分批逐次加料的方式加入。

【有益效果】

（1）本发明提供的一种低固含量底物逐次吸附提高纤维素酶回收利用率的方法，可有效地避免释放到水解液里的纤维素酶的浪费，极大地提高了纤维素酶的利用效率；

（2）本发明使用低固含量新鲜底物逐次吸附的操作有利于降低过程中的搅拌成本和后续反应中的底物抑制作用；

（3）该方法工艺简单、操作方便、成本低廉，易于建立起经济可行的纤维素酶回收工艺，在乙醇工业化生产中有非常重要的应用前景。

附图说明

图1为低固含量底物逐次吸附提高纤维素酶回收利用率方法过程的示意图。

图2为实施例3、6、7中纤维素酶回收效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

下面的实施例是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明,但并不对权利要求作任何限定。

实施例1

将ph值为4.8、10mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为1fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为10%）一次性添加到上述溶液中，吸附实验在温度4℃、无转速的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，吸附时间为30min，最后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为27.5%。

实施例2

将ph值为4.8、100mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为0.1fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为2%）添加到上述溶液中，吸附实验在温度25℃、转速为200rpm的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，180min后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行第二轮纤维素酶回收；再次添加avicelph-101（固含量为2%）到所得滤液中，在温度25℃、转速为200rpm的往复式水浴振荡摇床中进行120min吸附实验，然后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，最后收集滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为60.2%。

实施例3

将ph值为4.8、50mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为1fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为4%）添加到上述溶液中，吸附实验在温度25℃、无转速的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，120min后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行第二轮纤维素酶回收；再次添加avicelph-101（固含量为4%）到所得滤液中，在温度25℃、无转速的往复式恒温水浴振荡摇床中进行120min吸附实验，然后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，最后收集滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为71.58%，数据结果展示在图2（4+4）。

实施例4

将ph值为4.8、50mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为0.2fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为5%）一次性添加到上述溶液中，吸附实验在温度25℃、转速50rpm的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，吸附时间为120min，最后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为23.49%。

实施例5

将ph值为4.8、50mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为1fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为10%）一次性添加到上述溶液中，吸附实验在温度25℃、转速150rpm的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，吸附时间为120min，最后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为34.92%。

实施例6

将ph值为4.8、50mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为1fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为10%）一次性添加到上述溶液中，吸附实验在温度25℃、无转速的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，吸附时间为120min，最后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为58.84%。数据结果展示在图2（10）。

实施例7

将ph值为4.8、50mm柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶溶液加入具有玻璃塞的锥形瓶中，纤维素酶浓度为1fpu/ml，再将avicelph-101（固含量为2%）添加到上述溶液中，吸附实验在温度25℃、无转速的往复式恒温水浴振荡摇床中进行，120min后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，保留滤液进行第二轮纤维素酶回收；再次添加avicelph-101（固含量为2%）到所得滤液中，在温度25℃、无转速的往复式恒温水浴振荡摇床中进行120min吸附实验，然后减压过滤，通过玻璃超纤维滤纸把固体被过滤掉，最后收集滤液进行后续非吸附蛋白质浓度分析，计算得到纤维素酶回收率为67.38%。数据结果展示在图2（2+2）。