一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法与流程

[0001]
本发明涉及2-氨基2，3二甲基丁酰胺制备技术领域，尤其涉及一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法。


背景技术：

[0002]
2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，外观为白色片状晶体，熔点为84℃，能溶于水和大多数有机溶剂。是咪唑啉酮类超高效除草剂如咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草烟等的通用中间体，市场需求广阔。但是至制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的过程中，其中所含的腈水合酶在中性偏酸的条件下，稳定性较好，而其碱性环境会对该酶的酶活造成严重的抑制，影响2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的被吸收反应效果。因此，我们提出了一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法用于解决上述问题。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法。
[0004]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0005]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0006]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.2mm金属离子和0.8ml有机溶剂，以获得新菌株；
[0007]
s3、发酵条件优化：令新菌株在30-40℃下生长至od600为0.8-1.0时，向其中添加诱导剂，令其在发酵培养基内进行发酵24-48h以获得腈水合酶，在培养过程中，间隔补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0008]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于ph6.0-10.0、20-40℃环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0009]
优选的，所述菌株的筛选过程采用的是铁离子显色反应，其中，铁离子显色反应的标准为颜色呈深紫色且带有金属光泽。
[0010]
优选的，所述金属离子为ni
2+
、k
+
和ca
2+
中的任意一种，有机溶剂为异辛烷、醋酸甲酯和乙二醇单甲醚的其中一种。
[0011]
优选的，所述载体与大肠杆菌重组菌的结合过程如下：先利用ecori和hindiii酶切割位点，然后进行蛋白诱导表达，将切割下的质粒与基因用dna连接酶连接成重组质粒，最后与大肠杆菌重组菌的感受态细胞混合。
[0012]
优选的，所述诱导剂为0.1mm iptg，诱导温度为20℃。
[0013]
优选的，所述发酵培养基组分为1.6％(w/v)山梨醇、2％(w/v)鲜骨蛋白胨、1％(w/v)oxoid酵母提取物和0.25％(w/v)na2hpo4。
[0014]
优选的，所述新菌株为大肠杆菌重组菌中的e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)nhase。
[0015]
优选的，所述s3中补加鲜骨蛋白胨的起始时间为第4个小时，且补加的时间间隔为4h。
[0016]
优选的，所述2-氨基-2,3-二甲基丁腈的初始浓度为0.03-0.3m，且在s4中，2-氨基-2,3-二甲基丁腈和腈水合酶的配比为(1.1-1.3)：1。
[0017]
本发明的有益效果是：
[0018]
1、本发明在制备过程中，向其中添加金属离子，其可以维持多相体系的渗透平衡，且在添加的过程中，发现在加入了ni
2+
后，经发酵后，腈水合酶的活性提幅都高于其他金属离子。
[0019]
2、本发明在制备过程中，向其中添加有机溶剂，其可以改善腈水合酶的稳定性，且在添加的过程中，发现在加入量异辛烷后，经发酵后，其对腈水合酶活性的促进作用都优于其他有机溶剂的效果。
[0020]
综上所述，本发明在制备过程中，加入金属离子和有机溶剂，能够对腈水合酶的活力存在一定的影响，既能进一步提高其在中性偏酸的条件下的稳定性，又能改善碱性环境下对酶的抑制作用。
具体实施方式
[0021]
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
[0022]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0023]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0024]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.2mm金属离子和0.8ml有机溶剂，以获得新菌株，其中金属离子为ni
2+
、k
+
和ca
2+
中的任意一种，有机溶剂为异辛烷、醋酸甲酯和乙二醇单甲醚的其中一种，在将载体与大肠杆菌重组菌结合时，先利用ecori和hindiii酶切割位点，然后进行蛋白诱导表达，将切割下的质粒与基因用dna连接酶连接成重组质粒，最后与大肠杆菌重组菌的感受态细胞混合；
[0025]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0026]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于ph6.0、35℃环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0027]
其中，发酵培养基组分为1.6％(w/v)山梨醇、2％(w/v)鲜骨蛋白胨、1％(w/v)oxoid酵母提取物和0.25％(w/v)na2hpo4；2-氨基-2,3-二甲基丁腈的初始浓度为0.3m。
[0028]
实施例一：
[0029]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0030]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0031]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.2mm金属离子和0.8ml有机溶剂，以获得新菌株；
[0032]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0033]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于ph6.0、35℃环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0034]
实施例二：
[0035]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0036]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0037]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.2mm金属离子和0.8ml有机溶剂，以获得新菌株；
[0038]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0039]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于ph8.0、35℃环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0040]
对比例一-对比例三：
[0041]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0042]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0043]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.2mm金属离子，以获得新菌株；
[0044]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0045]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于35℃且为酸性的环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0046]
对比例四-对比例六：
[0047]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0048]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0049]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.2mm金属离子，以获得新菌株；
[0050]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂
0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0051]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于35℃且为碱性的环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0052]
于对比例一-对比例六中，分别加入三种金属离子(ni
2+
、k
+
和ca
2+
)，检测发酵后腈水合酶的酶活，另外，再取湿菌体(小球诺卡氏菌)3.0g悬浮于180ml ph 7.8的磷酸盐缓冲液中，在30℃、转速180rpm的条件下预热5min，加入2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，使其终浓度达到0.2m，反应40min，取样气相测定上述反应40min后的反应溶液每100ml中2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的浓度(即2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺此时的占比率，占比率高则说明2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺仍有大量未被吸收反应，吸收反应率低，反之则说明2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺吸收反应率高)，具体数据如下表所示(表中“√”表示加入，
“×”
表示未加入)：
[0053][0054]
注：占比率为100ml的反应后溶液中2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺所占的百分比。
[0055]
由上表数据可知，向菌株中添加金属离子(ni
2+
、k
+
或ca
2+
)，都可以维持多相体系的渗透平衡，且在添加的过程中，可以发现在加入了ni
2+
后，发酵后腈水合酶的活性的增幅都高于其他金属离子，另外，在同样的条件下，加入了ni
2+
改性后的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺在反应容液中的占比率相对较低，也就是说，该情况下的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺更易被吸收反应。
[0056]
对比例七-对比例九：
[0057]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0058]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0059]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.8ml有机溶剂，以获得新菌株；
[0060]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0061]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于35℃且为酸性的环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0062]
对比例十-对比例十二：
[0063]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0064]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0065]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，纯化时加入0.8ml有机溶剂，以获得新菌株；
[0066]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0067]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于35℃且为碱性的环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0068]
对比例七-对比例十二中，分别加入三种有机溶剂(异辛烷、醋酸甲酯或乙二醇单甲醚)，检测发酵后腈水合酶的酶活，另外，再取湿菌体(小球诺卡氏菌)3.0g悬浮于180ml ph 7.8的磷酸盐缓冲液中，在30℃、转速180rpm的条件下预热5min，加入2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，使其终浓度达到0.2m，反应40min，取样气相测定上述反应40min后的反应溶液每100ml中2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的浓度(即2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺此时的占比率，占比率高则说明2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺仍有大量未被吸收反应，吸收反应率低，反之则说明2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺吸收反应率高)，具体数据如下表所示(表中“√”表示加入，
“×”
表示未加入)：
[0069][0070][0071]
注：占比率为100ml的反应后溶液中2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺所占的百分比。
[0072]
由上表数据可知，向菌株中添加有机溶剂(异辛烷、醋酸甲酯或乙二醇单甲醚)，可以改善腈水合酶的稳定性，且在添加的过程中，发现在加入异辛烷后，经发酵后，其对腈水合酶活性的促进作用都优于其他有机溶剂的效果，另外，在同样的条件下，加入了异辛烷改性后的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺在反应溶液中的占比率相对较低，也就是说，该情况下的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺更易被吸收反应。
[0073]
参照例一：
[0074]
一种2-氨基2，3二甲基丁酰胺的制备方法，包括以下步骤：
[0075]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0076]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，以获得新菌株；
[0077]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0078]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于ph6.0、35℃环境下进行
催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0079]
参照例二：
[0080]
s1、菌株的筛选：对大肠杆菌重组腈水合酶酶库进行筛选，通过铁离子显色反应，获得来源于pseudonocardia thermophila jcm3095的大肠杆菌重组菌；
[0081]
s2、新菌株的获取：以pet-28a为载体，通过镍柱对大肠杆菌重组菌进行纯化，以获得新菌株；
[0082]
s3、发酵条件优化：令新菌株在37℃下生长至od600为0.8时，向其中添加诱导剂0.1mm iptg，在20℃环境下进行诱导，令其在发酵培养基内进行发酵24h以获得腈水合酶，在培养过程中，从第4个小时开始，每隔4h向其中补加1％(w/v)鲜骨蛋白胨；
[0083]
s4、反应体系的构建：以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，腈水合酶作为催化剂，并令其二者以1.3:1的配比在hfe-7100/水(10％，v/v)两相体系下，于ph8.0、35℃环境下进行催化水合反应，制得2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
[0084]
将对比例一和七与实施例一以及参照例一对比成组，并将对比例四和十与实施例二及参照例二对比成组，对其中的腈水合酶进行酶活检测，另外，再取湿菌体(小球诺卡氏菌)3.0g悬浮于180ml ph 7.8的磷酸盐缓冲液中，在30℃、转速180rpm的条件下预热5min，加入2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，使其终浓度达到0.2m，反应40min，取样气相测定上述反应40min后的反应溶液每100ml中2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的浓度(即2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺此时的占比率，占比率高则说明2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺仍有大量未被吸收反应，吸收反应率低，反之则说明2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺吸收反应率高)，具体数据如下表所示(表中“√”表示加入，
“×”
表示未加入)：
[0085][0086]
注：占比率为100ml的反应后溶液中2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺所占的百分比。
[0087]
由上表可知，在菌株中加入金属离子或有机溶剂后，对经发酵后所产生的腈水合酶的活性都具有一定的促进作用，且同时加入金属离子和有机溶剂后，能够进一步的提高腈水合酶的活性，另外，在同样的条件下，仅加入金属离子或有机溶剂改性后的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺在反应溶液中的占比率达20％-30％，而同时加入金属离子和有机溶剂改性后的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺在反应溶液中的占比率低于20％，能够大幅度提高2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的占比率，也就是说，该情况下的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺更易被吸收反应。
[0088]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。