用于表达rFC蛋白的84E突变载体及其制备方法和应用与流程

用于表达rfc蛋白的84e突变载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]
本发明涉及转基因技术领域，特别涉及用于表达rfc蛋白的84e突变载体及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
鲎(limulidae)别名：马蹄蟹、夫妻鱼，是一种肢口纲剑尾目海生节肢动物，最早出现在古生代泥盆纪，有“活化石”之称，具有极高的生态与经济价值。目前，鲎的最大威胁来自于人类的无节制捕捞、采血提取鲎c因子(rfc)蛋白，为此，为了降低采血对鲎带来的毁灭性伤害，采用基因工程的方法合成鲎c因子(rfc)蛋白也是目前研究的重要领域，而在鲎c因子(rfc)蛋白的表达过程中，缺少理想的表达宿主、成本高等问题严格限制了其生产应用。为此，本领域技术人员一直致力于如何利用基因工程的方法生产rfc蛋白，对表达宿主也进行了多方研究，宿主研究过程中发现：利用大肠杆菌和酵母菌作为宿主，表达rfc蛋白都不能取得良好的效果，蛋白活性均很低；采用家蚕杆状病毒在家蚕幼虫血液中表达rfc因子，灵敏度能达到0.2eu/ml，但是也存在纯化困难的问题；而家蚕(bombyx mori)丝腺是已知外分泌蛋白质能力最强的动物器官，由于其出色的蛋白合成能力、蚕丝蛋白成分相对简单以及家蚕幼虫易于室内饲养和基因工程操作等优势而受到广泛应用。申请人自2016年以来，一直致力于psg系统表达rfc的研究，在研究过程中发现：虽然在应用蚕丝腺载体中采取特殊家蚕品种及超强启动子等措施，rfc蛋白在家蚕后部丝腺中的表达量已达170ug/mg，活性为0.3eu/ml超出普通鲎试剂的检测水平，加之rfc基因在转基因家蚕中稳定遗传，使得其生产成本远远低于目前的昆虫细胞表达系统。但是，在psg系统中，snt的增溶作用受ph影响较大，rfc易与丝蛋白形成不溶性复合体，难以获得可溶性表达产物。因而提高rfc在psg中的可溶性表达，是目前psg表达rfc需要解决的技术问题。


技术实现要素：

[0003]
鉴于上述内容，有必要提供一种能高效表达rfc蛋白的载体，并为该载体选择合适的宿主，提高rfc蛋白的表达量和活力，使得基因工程法生产rfc蛋白能够达到产业化应用，降低对鲎的伤害。
[0004]
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0005]
用于表达rfc蛋白的载体，所述载体是在piggybac载体骨架上插入dsred表达单元与cfib-h表达单元构建得到的，所述cfib-h表达单元由pfib-h家蚕重链基因启动子、突变型增溶标签sntk84e、his蛋白标签和rfc的表达基因组成；所述cfib-h表达单元的连接方式为pfib-h-sntk84e-his-rfc；所述dsred表达单元为由3xp3启动子引导的红色荧光dsred基因组成。
[0006]
进一步的，所述改良增溶标签sntk84e的蛋白序列如序列表seq：no：1所示。
[0007]
进一步的，所述载体的核酸序列如序列表seq：no：3所示。
[0008]
本发明还包括包含所述载体的宿主细胞。
[0009]
进一步的，所述宿主细胞为蚕丝腺。
[0010]
本发明还包括一种应用所述用于表达rfc蛋白的载体和/或宿主细胞分泌rfc蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
[0011]
(1)构建所述用于表达rfc蛋白的载体；
[0012]
(2)采用显微注射的方法将步骤(1)的载体注射到蚕卵的胚子发育区；
[0013]
(3)将步骤(2)的蚕卵孵化饲养成虫后，筛选红眼表型纯一的蛾进行连续3代的饲养，选出不产生性状分离的第3代蚕进行饲喂，育成红眼基因纯合、rfc蛋白纯合且丝腺细胞能够分泌rfc蛋白的转基因蚕；
[0014]
(4)rfc蛋白在蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到蚕的丝腺腔，并分泌到蚕茧。
[0015]
进一步的，所述步骤(2)蚕卵的注射时间为蚕卵产下后的4-8h。
[0016]
进一步的，所述步骤(2)蚕卵的注射时应将针孔从蚕卵的“d”型区凸面推入。
[0017]
本发明还包括一种制备载体的方法，所述方法为：
[0018]
(1)下载蜘蛛蛋白的snt序列，将序列进行氨基酸序列突变，最终得到并合成的突变氨基酸序列如序列表seq：no：1所示；
[0019]
(2)提取鲎的血液，通过rt-pcr的方法扩增rfc蛋白基因，并对该蛋白进行进行密码子改造，改造后编码的氨基酸序列如序列表seq：no：2所示；
[0020]
(3)将seq：no：1、seq：no：2、his蛋白标签和荧光表达基因连接在piggybac载体骨架上即得所述载体，最终得到的载体核苷酸序列如序列表seq：no：3所示。
[0021]
本发明具有如下有益效果：
[0022]
1、在对psg表达系统的研究过程中，申请人发现，外源蛋白在丝腺腔内发生纤维化，最终导致snt的增溶作用受ph影响较大，在中性或弱碱性条件下snt为单体状态，单体状态的snt可介导蛋白质形成可溶性的胶束结构；而在酸性条件下(ph<6.5)snt则形成反向二聚体，这时胶束结构遭到破坏，内部疏水性蛋白质向外部暴露并折叠为不溶性多聚体；因此，申请人对snt序列进行了一系列突变，最终发现：把snt序列的保守区84位酸性氨基酸k突变为碱性氨基酸e(记作sntk84e突变体)时，sntk84e突变体的构象变化导致snt对ph不敏感，有效解决了snt在酸性条件下容易形成二聚体的技术缺陷；提高了由其所介导的rfc等外源蛋白在psg生物反应器中的可溶性表达能力和蛋白活性，是一种简单、高效、低成本的生产rfc蛋白方法，经实验，使用该载体生产rfc其表达量可达630ug/mg。
【附图说明】
[0023]
图1是本发明实施例1中野生型载体(snt+rfc)的构建示意图；
[0024]
图2是本发明实施例1中84e突变载体(sntk84e+rfc)的构建示意图；
[0025]
图3是本发明实施例2中蚕卵的显微注射示意图；
[0026]
图4是本发明实施例中鲎c蛋白的western blot蛋白印迹表达图；图中wt为野生型mut为突变型；
[0027]
图5是本发明84e突变载体和野生型载体rfc在蚕丝腺中的荧光表达量图。
【具体实施方式】
[0028]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0029]
实施例1：
[0030]
本实施例为鲎c蛋白基因(rfc)的载体构建：
[0031]
(1)在genebank上调取纤维性能较好的斑络新妇蜘蛛(nephila pilipes)蛋白的n末端序列，并将其作为野生型snt；对野生型snt的第84位氨基酸序列进行突变，突变方法为：将野生型snt序列中保守位置的第84位由氨基酸k变为酸性氨基酸84e得到sntk84e序列，突变后的氨基酸序列如序列表seq：no：1所示：
[0032]
(2)提取中华鲎血液，克隆鲎c蛋白基因(rfc)并测序，得到鲎c蛋白基因(rfc)，其序列如序列表seq：no：2所示：
[0033]
根据上述步骤构建两个载体其连接顺序如图1和图2所示：
[0034]
其中，图1为野生型载体(snt+rfc)的构建示意图：图中，piggybac表达载体的转座子上连接有dsred表达单元与cfib-h表达单元；其中，dsred表达单元部分有一个完整的红色标记荧光蛋白(dsred)的表达单元，它由3xp3启动子引导；3xp3启动子可在昆虫的眼部视神经中启动其后所连接的dsred基因的表达。cfib-h表达单元由pfib-h家蚕重链基因启动子、野生型增溶标签snt、his蛋白标签和鲎c因子表达基因(rfc)组成；由于dsred表达单元与cfib-h表达单元相连接，因此可以通过观察转基因家蚕的眼睛荧光的有无对转基因家蚕进行初选。
[0035]
其中，图2为84e突变载体(sntk84e+rfc)的构建示意图：图中，piggybac表达载体的转座子上连接有dsred表达单元与cfib-h表达单元；其中，dsred表达单元部分有一个完整的红色标记荧光蛋白(dsred)的表达单元，它由3xp3启动子引导；3xp3启动子可在昆虫的眼部视神经中启动其后所连接的dsred基因的表达。cfib-h表达单元由pfib-h家蚕重链基因启动子、突变型增溶标签sntk84e、his蛋白标签和鲎c因子表达基因(rfc)组成；由于dsred表达单元与cfib-h表达单元相连接，因此可以通过观察转基因家蚕的眼睛荧光的有无对转基因家蚕进行初选。上述载体的核苷酸序列如序列表seq：no：3。
[0036]
实施例2：
[0037]
本实施例为将实施例1的载体转入蚕丝腺中的方法：
[0038]
(1)采用显微注射的方法将实施例1的两个载体均注射到蚕卵的胚子发育区；
[0039]
(2)将步骤(1)的蚕卵孵化饲养成虫后，筛选红眼表型纯一的蛾进行连续3代的饲养，选出不产生性状分离的第3代蚕进行饲喂，育成红眼基因纯合、rfc蛋白纯合且丝腺细胞能够分泌rfc蛋白的转基因蚕；
[0040]
(3)rfc蛋白在蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到蚕的丝腺腔，并分泌到蚕茧。
[0041]
为了提高孵化率，注射时需要需注意以下几点：
①
在蚕卵注射的合适时间范围内(蚕卵产下后4-8小时,这段时间是蚕卵受精后胚子形成之前的时间)；
②
为减少蚕卵内容物的流出，dna注射量要少，在显微镜下看到液珠即可(约15-20nl)；
③
因为胚子发育区域靠近
“
d”型蚕卵的较凸的一面，注射时在蚕卵腹部凸面的中心部位进行开孔，dna推入部位以刚到达胚子发育区为宜，具体如图3所示。
[0042]
实施例3：
[0043]
对实施例2的转基因蚕丝腺中rfc蛋白含量进行鉴定，具体如下：
[0044]
解剖转基因家蚕5龄幼虫的丝腺，western blot(wb)鉴定rfc蛋白；结果如图4所示，图中可见在蛋白印迹中出现了rfc蛋白的结合片段，证明，在该丝腺中存在rfc蛋白，图中，野生型(wt)的条带明显比84e突变型(mut)细，由此证明，在本实验中84e突变型的rfc蛋白表达量远高于野生型。
[0045]
申请人还进行了荧光定量pcr检测：
[0046]
对转基因家蚕5龄幼虫的丝腺野生型(wt)和84e突变型(mut)的cdna为作为定量pcr的模板，以rpl
32
基因为内参基因，根据rfc基因序列设计引物，引物见表1：
[0047]
表1
[0048][0049]
实时荧光定量pcr检测采用在applied biosystems
tm
荧光定量pcr仪上进行，
[0050]
pcr的反应体系如表2所示：
[0051]
表2
[0052]
反应物反应体积cdna(50ng
·
μl-1
)0.5μl上游引物(10μg
·
l-1
)0.4μl下游引物(10μg
·
l-1
)0.4μlrnase free water3.5μlsybr premix ex taq5μlrox reference dyeⅱ0.2μl合计10μl
[0053]
上述反应体系的反应条件为：
[0054]
95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸10s，共计45个循环，采集荧光信号；95℃变性1s，65℃退火15s，1个循环，制定溶解曲线；40℃冷却30s。使用2-δδ
ct法所有的数据均表示为平均值
±
标准偏差。实时荧光定量pcr数据分析用spss 17.0和microsoft office excel 2007进行统计分析，采用spss17.0软件方差分析，采用excel 2010软件制图，结果如图5所示：从图5可见，84e突变型的相对表达量约是野生型的3.67倍。
[0055]
经检测，野生型的蛋白表达量达到170ug/mg；突变型的蛋白表达量达到630ug/mg。
[0056]
综上所述，84e突变载体(sntk84e+rfc)相对于野生型载体(snt+rfc)来说具有更高的蛋白表达量和活性。而且，采用基因重组的方法，利用蚕丝腺宿主表达rfc蛋白，使得
rfc蛋白产量更高、活性更低、成本更低，能完全替代人工采血，可进行大规模的推广应用，不会造成鲎的过度捕杀，保护濒危野生动物。
[0057]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。