产IAA的溶磷菌及其应用的制作方法

产iaa的溶磷菌及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株产吲哚乙酸(iaa)的溶磷菌菌株，及其在农业生产中促进植物体生长中的应用。


背景技术：

[0002]
施用化肥是目前我国粮食、蔬菜增产的主要途径，但化肥在生产过程中会加入某些重金属物质和一些无机酸和有机物的组合成分，施用化肥时重金属离子以及无机酸与有机物的结合物质会在土壤中不断积累，并且会以食物链的形式进行浓缩，对畜牧业以及人类自身身体健康造成影响。随着化肥的使用量的逐年增加，施用过多化肥导致一系列环境问题，包括肥力降低、土壤盐渍化、重金属污染、土壤板结和水体富营养化等。施用微生物肥料能够在增加作物产量的基础上减少化肥对环境的危害。
[0003]
磷元素是植物的必需元素，土壤中虽然存在许多的磷元素，但是大部分是以不能被直接利用的形式存在，所以造成植物处于缺磷状态，当前农业生产中补磷的方法是施用磷肥，但是植物对施用的磷肥利用率较低，多余的磷肥在土壤中剩余，造成土壤板结和盐碱化等问题。研究发现土壤中的部分微生物可以通过有机酸和多糖等协作进行溶磷作用，提高土壤中磷元素的利用率。
[0004]
吲哚-3-乙酸(iaa)是一种植物生长调节物质，iaa是作用于植物生长、发育全过程的一种生长激素，在植物根际土壤中存在着根际细菌能够产生iaa。研究发现有些微生物因具有产吲哚乙酸(iaa)等功能，可在农业生产中作为肥料促进植物体生长，达到增产增收目的。
[0005]
因此，筛选研制出能够产吲哚乙酸(iaa)且溶磷的生物菌肥并应用于农业生产中具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明目的在于提供一株产吲哚乙酸(iaa)的溶磷菌菌株，通过产iaa、溶磷等方式促进植物生长，提高必需元素的利用率以减少化肥的使用量，保护生态环境。
[0007]
本发明提供了一种产iaa的溶磷菌，为地衣芽孢杆菌zbn-301，保藏编号为cgmcc no.20560。
[0008]
本发明提供的产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株的16s rrna基因序列测定结果如序列表中seq id no.1所示。
[0009]
本发明提供了产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株的发酵方法，包括步骤：将地衣芽孢杆菌接种于lb液体培养基中，在37℃条件下，180rpm振荡培养10h，获得种子液；然后将种子液接种于lb液体培养基中，在37℃条件下，180rpm振荡培养24h；其中，种子液的接种量为1％。
[0010]
本发明还保护产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株在降解难溶性磷酸盐中的应用，本发明还保护产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株促进植物生长中的应
用。
[0011]
本发明还保护一种生物菌肥，该生物菌肥的活性成分包括产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株。
[0012]
优选地，上述生物菌肥是将产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株和粉末状木薯有机物料混合而成；其中，产iaa的溶磷菌的质量分数为0.01％-50％，木薯有机物料的水分小于35％，ph 5.5-8.5，杂菌数小于20％，碳氮比大于26：1。需要说明的是，木薯有机物料是充分发酵腐熟的优质的木薯有机物料，生物菌肥施用方法为常规使用方法无特殊限制，与化肥混合使用无特殊限制。
[0013]
优选地，上述生物菌肥是将产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株和颗粒状木薯有机物料混合而成；其中，产iaa的溶磷菌的质量分数为0.01％-10％，颗粒状木薯有机物料的水分小于20％，ph 5.5-8.5，杂菌数小于20％，碳氮比大于26：1。需要说明的是，木薯有机物料是充分发酵腐熟的优质的木薯有机物料，并制成圆颗粒，制粒条件、制粒设备无特殊要求；生物菌肥施用方法为常规使用方法无特殊限制，与化肥混合使用无特殊限制。
[0014]
优选地，上述生物菌肥是将产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株和柱状木薯有机物料混合而成；其中，产iaa的溶磷菌的质量分数为0.01％-10％，柱状载体木薯有机物料的水分小于20％，ph 5.5-8.5，杂菌数小于20％，碳氮比大于26：1。需要说明的是，木薯有机物料是充分发酵腐熟的优质的木薯有机物料，并制成柱状，制柱条件、制柱设备无特殊要求；生物菌肥施用方法为常规使用方法无特殊限制，与化肥混合使用无特殊限制。
[0015]
本发明还保护上述生物菌肥在降解难溶性磷酸盐和/或促进植物生长中的应用。
[0016]
本发明从山东潍坊地区土样筛选产iaa菌株和溶磷菌株，采用形态学、生理生化指标、分子生物学鉴定方法进行鉴定，对具有产iaa和溶磷功能的菌株进行效果验证实验，通过植物根际土壤筛选特定植物根际促生细菌，菌株通过产iaa、溶磷等方式促进植物生长，得到一株具有产iaa和溶磷能力的菌株，将此菌株与有机载体进行结合，形成生物菌肥应用到实际生产中进行效果验证，得到具有产iaa和溶磷功能的促生型生物菌肥，提高必需元素的利用率以减少化肥的使用量，保护生态环境。
[0017]
保藏信息：地衣芽孢杆菌zbn-301，拉丁名：bacillus licheniformis，保藏编号：cgmcc no.20560，于2020年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
[0018]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例1中的菌株产iaa验证图；
[0020]
图2为本发明实施例1中的菌株溶磷效果图。
具体实施方式
[0021]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不
能以此来限制本发明的保护范围。
[0022]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值
±
标准差。
[0023]
实施例1：产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株筛选和鉴定
[0024]
1、菌株筛选
[0025]
(1)菌株分离
[0026]
通过在山东潍坊的种植层土样进行分离菌株，按照1：9比例将土壤样品与无菌水混合，摇床中37℃孵育30min，将土壤浸出液75℃水浴30min，在基础培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.0)上采用平板稀释涂布法对土壤浸出液进行菌株分离，分离出的菌株均通过lb液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，蒸馏水1000ml，ph7.0加入500mg/l的l-色氨酸)培养24h，得到细菌发酵液，通过4000rpm离心10min后取100μl上清。
[0027]
(2)产iaa筛选实验
[0028]
产iaa筛选实验体系为：100μl菌体发酵上清液，100μlsalkowski比色剂，处理完成后迅速暗置30min后，观察是否具有显色反应，如果显示红色则初步判断具有产iaa能力，结果如图1所示。
[0029]
(3)产iaa量的测定
[0030]
加入100μl的菌体发酵上清液，100μl salkowski比色剂，处理完成后迅速暗置30min，处理完后在od
530
处测出所有样品的吸光度。根据绘制标准曲线，确定菌株的iaa产量，该菌株iaa产量为44.8μg/ml。
[0031]
(4)溶磷菌株筛选
[0032]
将分离的菌株转接到蒙金娜无机磷固体培养基(葡萄糖10.0g，(nh4)2so40.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，mnso4·
4h2o 0.03g，kci 0.3g，feso4·
7h2o 0.03g，nacl 0.3g，ca3(po4)210.0g，琼脂20g，去离子水1000ml，ph 7.0)上，培养条件为28℃，时间为7d，观察溶磷透明圈大小。用游标卡尺测量其菌落大小(d)和透明圈大小(d)，通过对透明圈和菌落大小比值(d/d)初步判断其是否具有溶磷能力以及溶磷能力强弱，结果如图2所示。
[0033]
(5)溶磷菌株溶磷能力测定
[0034]
将分离菌株转接到蒙金娜无机磷液体培养基(葡萄糖10.0g，(nh4)2so40.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，mnso4·
4h2o 0.03g，kcl 0.3g，feso4·
7h2o 0.03g，nacl 0.3g，ca3(po4)210.0g，去离子水1000ml，ph 7.0)中，培养条件为180rpm30℃恒温震荡，培养时间为7d，取发酵液进行离心得到上清液，取50ml容量瓶，加入1ml上清液，4ml去离子水，5ml钼锑抗试剂，定容摇匀，放置30min后在od
880
下进行比色，测得待测液的吸光度，通过绘制的标准曲线方程，通过计算即可得到菌株液体培养基中的增加的可溶性磷含量，该菌株增加的可溶性磷含量为102.5mg/l。
[0035]
2、菌株鉴定
[0036]
通过16s rdna序列分析和生理生化实验鉴定菌株，具体步骤：采用dna提取试剂盒(天根细菌基因组dna提取试剂盒)提取和纯化菌株的dna，4℃保存。选用细菌的16s通用引物由华大基因公司合成，引物如下：
[0037]
上游引物为5
‘-
agagtttgatcctggtcagaacgaacgct-3’(seq id no.2)；
[0038]
下游引物为5
‘-
tacggctaccttgttacgacttcacccc-3’(seq id no.3)。
[0039]
扩增反应体系：引物各2μl，2xpcr mix 25μl，模板dna 1μl，ddh2o 20μl。
[0040]
pcr反应程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环29个周期；72℃延伸10min；4℃保持10min。将pcr产物进行测序(生工生物工程公司)。
[0041]
测序结果与ncbi blast数据库进行比对，发现其属于地衣芽孢杆菌。
[0042]
该菌株的16s rrna基因序列测定结果如序列表中seq id no.1所示：a aagggggggttctaatacatgcagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaacc ctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaagggggacccagat。
[0043]
基于测序结果和生理生化试验结果，确定该菌株属于地衣芽孢杆菌。将该菌命名为zbn-301，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2020年8月27日，保藏编号为cgmcc no.20560。
[0044]
将菌种接种在lb固体培养基上，37℃培养，3天后观察单菌落特征，菌落特征如下：菌落形态呈现为淡黄白色，不透明，表面干燥且不平滑，边缘光滑近透明。
[0045]
革兰氏染色实验：取一滴无菌水滴于在洁净载玻片上，用接种环挑取待测菌落充分混匀后，滴加结晶紫进行染色1min，流水冲至水流无色，滴加碘液染色1min，流水冲洗至水流无色，滴加95％乙醇进行脱色，至洗脱液无色，滴加番红染液2-3min，流水冲至水流无色，于40倍显微镜下进行观察，呈现深紫色为革兰氏阳性菌。
[0046]
进行生理生化测定，通过苯丙胺酸脱氢酶实验，zbn-301呈现阴性反应；通过解淀
粉实验，表明zbn-301具有分解淀粉的能力；进行v-p试验，呈阳性；通过柠檬酸盐实验，表明zbn-301能够利用柠檬酸盐。
[0047]
实施例2：产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)菌株促生功能验证
[0048]
使用拟南芥作为实验作物，进行种子萌发幼苗生长促生实验，菌株接入lb液体培养基37℃180rpm培养10h作为种子液，以1％的接种量接到100ml的液体培养基中37℃180rpm培养24h。6000rpm离心10min后，收集菌体后以灭菌的pbs缓冲液为空白对照，22℃昼夜比16/8的光照培养箱中培养7d。结果如下表1所示。
[0049]
表1 zbn-301促生试验
[0050]
编号根长/cm鲜重/g干重/gck7.612
±
0.67a0.0072
±
0.0015a0.0028
±
0.0006azbn-3018.524
±
1.43a0.0095
±
0.0023b0.0032
±
0.0004a
[0051]
结果表明，植株在根长、干重、鲜重等方面进行测量后发现，在根长方面总体拟南芥的根长增加了11.98％，鲜重方面具有显著性差异，鲜重增长了31.9％，干重方面增加了14％。
[0052]
实施例3：含产iaa的溶磷菌(地衣芽孢杆菌zbn-301)的生物菌肥制备及效果验证
[0053]
1、生物菌肥制备
[0054]
(1)粉剂生物菌肥
[0055]
将优质的木薯有机物料充分发酵腐熟，条件满足，水分小于35％，ph5.5-8.5，杂菌数小于20％，碳氮比大于26：1，按照需求比例进行物理掺混，菌的比例为0.01％-50％，施用方法为常规使用方法无特殊限制，与化肥混合使用无特殊限制。
[0056]
(2)颗粒状生物菌肥
[0057]
将优质的木薯有机物料充分发酵腐熟并制成圆颗粒，制粒条件、制粒设备无特殊要求，颗粒条件满足，水分小于20％，ph5.5-8.5，杂菌数小于20％，碳氮比大于26：1，按照需求比例进行物理掺混，菌的比例为0.01％-10％，施用方法为常规使用方法无特殊限制，与化肥混合使用无特殊限制。
[0058]
(3)柱状生物菌肥
[0059]
将优质的木薯有机物料充分发酵腐熟并制成柱状，制柱条件、制柱设备无特殊要求，柱状载体条件满足，水分小于20％，ph5.5-8.5，杂菌数小于20％，碳氮比大于26：1，按照需求比例进行物理掺混，菌的比例为0.01％-10％，施用方法为常规使用方法无特殊限制，与化肥混合使用无特殊限制。
[0060]
2、生物菌肥效果验证
[0061]
使用番茄作为菌肥效果验证的植株，品种为大明星，生长期为三片真叶，将蛭石与土1:1混合后的土壤置于花盆中，将番茄幼苗定植于花盆中，粉剂生物菌肥菌种浓度比例为2亿/g，用量为300kg/亩，将粉剂生物菌肥底施在番茄幼苗根部。待番茄生长40d后测其株高、茎粗、上下干重、上下鲜重。结果如下表2所示。
[0062]
表2 zbn-301生物菌肥促生试验
[0063]
处理ckzbn-301上鲜重g12.53
±
0.326bb14.04
±
0.581aa下鲜重g3.48
±
0.32aa3.93
±
0.11aa
株高cm40.83
±
1.71bb50.95
±
1.35aa茎粗mm5.05
±
0.046aa5.48
±
0.363aa上干重g1.28
±
0.053cc1.62
±
0.091aa下干重g0.32
±
0.041bb0.41
±
0.027aa
[0064]
结果发现，植株在根长、干重、鲜重等方面进行测量后发现，上鲜重方面增长了12.05％，下鲜重方面增长了12.93％，上干重方面增加了34％，下干重方面增加了28.13％，株高增加了24.79％，茎粗增加了8.5％。
[0065]
本发明从山东潍坊地区土样筛选产iaa菌株和溶磷菌株，采用形态学、生理生化指标、分子生物学鉴定方法进行鉴定，对具有产iaa和溶磷功能的菌株进行效果验证实验，通过植物根际土壤筛选特定植物根际促生细菌，菌株通过产iaa、溶磷等方式促进植物生长，得到一株具有产iaa和溶磷能力的菌株，将此菌株与有机载体进行结合，形成生物菌肥应用到实际生产中进行效果验证，得到具有产iaa和溶磷功能的促生型生物菌肥，提高必需元素的利用率以减少化肥的使用量，保护生态环境。
[0066]
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
[0067]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0068]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。