一种用于核酸提取的洗涤缓冲液的制作方法

[0001]
本发明涉及一种用于核酸提取的洗涤缓冲液和提取试剂盒。


背景技术：

[0002]
分子诊断是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平而做出诊断的技术，常见的分子诊断方法有pcr、等温扩增、测序等，其中pcr是当前应用范围最广的分子诊断方法。与其他诊断方法相比，分子诊断具有检测灵敏度高、准确性高、特异性强的优点。分子诊断试剂的检测对象为核酸(dna或rna)，进行检测前需要对待测样本进行核酸提取。
[0003]
样本(如血液、痰液、拭子)中核酸的提取，一般使用胍盐作为主要原材料配制裂解缓冲液。胍盐能裂解细胞并释放核酸，核酸在高浓度胍盐环境下能吸附在硅羟基磁珠表面。用特殊的洗涤缓冲液洗去胍盐后，用洗脱缓冲液将核酸从硅羟基磁珠表面溶解下来，即完成核酸提取。
[0004]
高浓度胍盐溶液中，不仅核酸容易吸附在硅羟基磁珠表面，样本中常见的蛋白类pcr抑制剂，如血红蛋白、粘蛋白等，也易于吸附在硅羟基磁珠表面。且这些pcr抑制剂不易被常规的洗涤缓冲液去除，最终会与核酸一同被洗脱缓冲液洗脱下来。当用这种含pcr抑制剂的核酸做pcr检测时，往往因聚合酶活性被抑制而得到假阴性的实验结果。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种用于核酸提取的洗涤缓冲液和提取试剂盒。
[0006]
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题：
[0007]
一种用于核酸提取的洗涤缓冲液，其特征在于在常规的洗涤缓冲液的基础上添加了2-环己胺基乙磺酸(ches)。
[0008]
在本方案中，采用上述洗涤缓冲液进行核酸提取时，样本中常见的蛋白类pcr抑制剂，如血红蛋白、粘蛋白等易于从硅羟基磁珠表面洗涤去除，提取的核酸中pcr抑制剂含量少，能有效地减少pcr检测的假阴性结果。
[0009]
较佳地，所述洗涤缓冲液中2-环己胺基乙磺酸(ches)浓度为1mm～100mm。
[0010]
较佳地，所述洗涤缓冲液中还包含其它常规组分，65～80％的乙醇等。
[0011]
一种核酸提取试剂盒，所述提取试剂盒包含上述洗涤缓冲液。
[0012]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0013]
本发明的积极进步效果在于：本发明通过在核酸提取所用的洗涤缓冲液中添加1～100mm的2-环己胺基乙磺酸(ches)；使得样本中常见的蛋白类pcr抑制剂，如血红蛋白、粘蛋白等易于从硅羟基磁珠表面洗涤去除，提取的核酸中pcr抑制剂含量少，能有效地提升pcr检测结果的重复性并减少检测的假阴性结果
附图说明
[0014]
图1为实施例1的洗涤缓冲液(ches+)常规洗涤缓冲液(ches-)提取的核酸的检测效果对比。
具体实施方式
[0015]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0016]
实施例1：配制洗涤缓冲液
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1)配制不含ches的洗涤缓冲液(ches-)
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量取54ml 3m kac(ph＝5.0)、22ml 1m tris-hcl(7.5)、700ml无水乙醇混匀后加适量超纯水补足体积到1l，得到不含ches的洗涤缓冲液(ches-)。
[0019]
2)配制含ches的洗涤缓冲液(ches+)
[0020]
在上述不含ches的洗涤缓冲液(ches-)中加入2-环己胺基乙磺酸(ches)，使终浓度达到7.5mm，得到含ches的洗涤缓冲液(ches+)。
[0021]
实施例2：比较两种洗涤缓冲液提取核酸的效果
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取10份痰液样本，使用相同的裂解缓冲液裂解后，分别用(ches-)和(ches+)两种洗涤缓冲液洗涤提取核酸。提取核酸的操作过程完全相同，提取过程中使用的洗脱缓冲液完全相同，均为10mm tris(ph＝8.0)。
[0023]
使用人gapdh基因检测引物/探针，做实时荧光pcr检测提取的核酸。
[0024]
检测结果如下表所示：
[0025][0026]
[0027]
实验结果显示，含ches的洗涤缓冲液(ches+)提取的核酸，扩增曲线较为靠前(ct值较小)，且扩增曲线较为集中(ct值相近)，说明用该洗涤缓冲液提取的核酸中干扰物质较少，实验重复性好。而不含ches的洗涤缓冲液(ches-)提取的核酸，扩增曲线较为靠后(ct值较大)，且扩增曲线较为分散(ct值相差较大)，甚至出现没有扩增信号的情况(noct)，说明使用该洗涤缓冲液提取的核酸中干扰物质较多，实验结果不稳定，甚至可能由于干扰出现假阴性结果。
[0028]
检测结果说明，使用本发明所述洗涤缓冲液进行核酸提取时，提取的核酸中pcr抑制剂含量少，能有效地提升pcr检测结果的重复性并减少检测的假阴性结果。